微生物合成3-甲硫基丙醇的研究現狀

馬景浩，王 洋，張玉姣，成柳潔，滕 超，李秀婷，范光森*

（1.北京工商大學 食品與健康學院，北京 100048；2.北京工商大學 北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048；3.濟南海關技術中心 德州實驗室，山東 德州 253000）

3-甲硫基丙醇（俗稱菠蘿醇）是一種重要的含硫高級醇，常溫下為易流動的淡黃色液體，低濃度時具有強烈的肉類芬芳香氣，天然存在于蘋果、番茄、醬油、奶酪、白酒、葡萄酒、啤酒、威士忌、白蘭地等食品或飲料中，能賦予眾多食品其特有的風味[1]。3-甲硫基丙醇香氣閾值低，在1～3 mg/L之間即可表現出一種令人愉悅的、肉類的或者烤制奶酪的香氣，是調配肉味香精的重要香料之一，是國家允許使用的食品用香料，廣泛應用于香精香料調配和食品增香，是一類應用非常廣泛的食用香料化合物，市場需求量大[2-3]。

目前，3-甲硫基丙醇的生產方法包括化學合成法和微生物發酵法，其中化學合成法是目前3-甲硫基丙醇生產的主要方法?；瘜W合成法雖然成本低，但卻存在合成過程污染較大等問題，不能滿足消費者日益對環保、綠色和純天然香精香料青睞的需求。由于生物轉化制備天然3-甲硫基丙醇具有構型單一、綠色環保，成為近年來生產3-甲硫基丙醇的重要發展方向[4]。相關研究表明，微生物，尤其是酵母能代謝L-蛋氨酸發酵合成3-甲硫基丙醇，是生物轉化生產天然3-甲硫基丙醇的有效途徑。目前，有關微生物發酵合成3-甲硫基丙醇的研究相對較少，需要對其進行深入研究。本文正是基于微生物合成3-甲硫基丙醇的重要性，通過對微生物合成3-甲硫基丙醇的主要微生物及其代謝途徑中的關鍵酶進行簡述，加強對微生物產天然3-甲硫基丙醇研究現狀的了解，為相關研究提供參考。

1 3-甲硫基丙醇在食品中的作用

3-甲硫基丙醇具有強烈的甜香、湯或肉樣香氣，早在1973年美國食用香料與提取物制造者協會（Flavour and Extract Manufactuere's Association，FEMA）將其確定為一般認為安全的香料物質，在食品中建議用量為0.1～50 mg/kg[5]，1986年，我國相關食品國家標準也將其列為暫時允許使用的食品香料。3-甲硫基丙醇特有的肉香味及其低閾值特性，對眾多食品呈現獨特的風味發揮了重要的作用，如在切達干酪、藍奶酪、卡門培爾干酪等奶酪中呈現發酵卷心菜的獨特氣味，能很容易在奶酪中被辨識出，是奶酪整體風味的重要組成部分[6-7]；盡管3-甲硫基丙醇是否是芝麻香型白酒中的特征風味物質存有爭論，但其在部分品牌芝麻香型白酒的風格形成中發揮著重要作用，并且在豉香型白酒及果酒的呈味中也具有重要的貢獻，表現出花椰菜和煮熟蔬菜的香氣，對風味品質的貢獻顯著[1，8]；3-甲硫基丙醇是黃酒中的重要含硫化合物，在清爽型黃酒中香氣強度較高，主要賦予黃酒青香和煮熟蔬菜的氣味，豐富黃酒的香氣[9]；3-甲硫基丙醇也是葡萄酒中重要的風味物質，能賦予葡萄酒煮土豆味，豐富其風味[10]。除此之外，因其具有甜的肉及肉湯氣味，3-甲硫基丙醇是調配肉味香精的重要原料，還可用于調配諸如水果、蔬菜、醬油、酒等眾多食用香精，用途廣泛[11]。

2 3-甲硫基丙醇的生產方法

2.1 化學合成法

化學合成方法因具有成本低、合成快、產物濃度高的優勢，一直是3-甲硫基丙醇主流的生產方法。目前，有關3-甲硫基丙醇的化學合成方法主要有四種：①采用甲硫醇和烯丙醇的加成反應。②利用3-氯-1-丙醇和甲硫醇鈉在醚中進行取代反應。③采用烯丙基甲基硫醚的分解反應。④3-巰基-1-丙醇和硫酸二甲酯的取代反應（圖1）[11]。其中，前兩種反應是目前實際生產中所采用的方法，相關研究也較多。劉玉平等[11]以3-氯-1-丙醇和甲硫醇鈉為原料，在相轉移催化劑四甲基溴化銨的作用下發生取代反應，制得了純度較高的3-甲硫基丙醇，產率達到81%。雖然，化學合成成本低廉，但存在的一些諸如原料毒性高、生產過程中的毒副產物難以去除及污染較大等問題引起關注，在一定程度上限制了其在工業化生產中的長期使用，必須拓展新的生產方法[12]。

圖1 3-甲硫基丙醇的4種化學合成方法Fig.1 Four chemical synthesis methods for 3-methithiopropanol

2.2 微生物合成法

有關研究表明，微生物可以將甲硫氨酸轉化為3-甲硫基丙醇[7，13]。如，BUZZINI P等[13]篩選獲得10株能夠轉化氨基酸生成3-甲硫基丙醇的酵母菌株，產量在0.04～0.40 g/L。雖然，當前微生物轉化合成3-甲硫基丙醇的速率不及化學方法，但由于其具有反應條件溫和、產物構型單一、綠色環保、所用原料安全無污染等特點，成為近年來制備“綠色”和“天然”的3-甲硫基丙醇的重要發展方向。

2.2.1 生產3-甲硫基丙醇的天然菌株

當前，國內外有關微生物轉化生產天然3-甲硫基丙醇的研究相對較少，能夠產生3-甲硫基丙醇的微生物種類不多，主要集中于酵母菌株（表1）。已報道能夠產3-甲硫基丙醇的菌株包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、酒類酒球菌（Oenococcus oeni）、擔子菌酵母（Basidiomycetous yeasts）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）、擬威爾酵母（Williopsis）等[4，13-21]。目前，天然微生物轉化生產3-甲硫基丙醇的能力相對較弱，CASTILLO-LOZANO M L D等[7]通過搖瓶發酵培養5株酵母菌株，其中乳酸克魯維酵母KL640和釀酒酵母SC45能轉化生成3-甲硫基丙醇，產量分別為14.51 mg/L和25.70 mg/L；BUZZINI P等[13]從37株擔子菌酵母中獲得10株可以生成3-甲硫基丙醇的酵母，其產量在0.04～0.40 g/L；侯晟等[4]優化了釀酒酵母SC408發酵合成3-甲硫基丙醇的條件，在最優條件下，該菌株所產3-甲硫基丙醇的量達到1.6 g/L；為進一步提高釀酒酵母SC408發酵合成3-甲硫基丙醇的產量，王成濤等[22]采用發酵-分離耦合技術降低3-甲硫基丙醇對細胞的毒害作用，最終產量可達2.26 g/L，為已報道天然菌株中所產3-甲硫基丙醇最高產量；另外，WILLIAMS A G等[23]從切達干酪中分離獲得29株能產3-甲硫基丙醇的乳酸菌，產量也較低，在0.04～0.30 g/L之間。天然菌株所產3-甲硫基丙醇普遍低的現象（幾乎都低于0.1 g/L），成為采用天然菌株進行工業化生產3-甲硫基丙醇最主要的限制因素[24]。

表1 產3-甲硫基丙醇的天然菌株Table 1 Natural strains that produce 3-methylthiopropanol

續表

2.2.2 生產3-甲硫基丙醇的基因工程菌

隨著人們對天然生產的3-甲硫基丙醇的需求增加以及基因工程技術的不斷發展，越來越多的學者開始采用分子生物學技術對菌株進行改造，以此實現高產3-甲硫基丙醇的工程菌株。劉麗等[26]通過過表達釀酒酵母S288C中的氨基轉移酶ARO8基因構建工程菌ARO8，工程菌所產3-甲硫基丙醇達到0.76 g/L，相比野生型S288C提高了28.8%；溫明顯等[3]通過過表達釀酒酵母INVSc1中的脫羧酶基因ARO10構建了釀酒酵母轉化子SC10-1，其產3-甲硫基丙醇的量相比天然菌株提高了55.2%，達到0.90 g/L；YIN S等[27]通過共表達氨基轉移酶基因ARO8和ARO10構建了釀酒酵母轉化子S810，在搖瓶水平上，該工程菌所產3-甲硫基丙醇達到1.27 g/L，通過分批補料發酵罐培養，產量達到3.24 g/L；ETSCHMANN M M W等[24]通過分批補料發酵方法實現了工程菌釀酒酵母CEN.PK113-7D高產3-甲硫基丙醇的目的，產量可達3.5 g/L；楊雪蓮等[28]優化了過表達脫羧酶基因ARO10的釀酒酵母工程菌合成3-甲硫基丙醇的發酵條件，在最優條件下，工程菌株所產3-甲硫基丙醇可達4.38 g/L，為已報道中的最高水平。部分產3-甲硫基丙醇的基因工程菌株見表2，由表2可知，通過基因改造可以實現3-甲硫基丙醇產量的大幅度提高，為工業化應用微生物轉化生產3-甲硫基丙醇打下基礎。

表2 產3-甲硫基丙醇的基因工程菌株Table 2 Genetically engineered strains producing 3-methylthiopropanol

3 微生物生物轉化生產3-甲硫基丙醇的關鍵基因和酶

在酵母細胞中，Ehrlich途徑是生物轉化生成高級醇的最重要的途徑[2]。3-甲硫基丙醇是高級醇的一種，可以由蛋氨酸經過Ehrlich途徑代謝產生[34]。在3-甲硫基丙醇的生物合成過程中，如果沒有蛋氨酸，3-甲硫基丙醇幾乎不產生，這足以表明Ehrlich途徑在合成3-甲硫基丙醇中的重要性[24]。在Ehrlich途徑中，首先，蛋氨酸在氨基轉移酶（aminotransferase）作用下發生轉氨基作用生成α-酮-γ-甲硫基丁酸（α-keto-γ-（methylthio）butyrate，KMBA），然后在脫羧酶（decarboxylase）作用下生成3-甲硫基丙醛，最后在乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）作用下發生還原反應生成3-甲硫基丙醇[24，35]。

圖2 微生物轉化L-蛋氨酸產3-甲硫基丙醇的Erich途徑Fig.2 Erich pathway of microbial transformation of L-methionine to produce 3-methylthiopropanol

3.1 氨基轉移酶

在Ehrich途徑中具有轉氨作用的基因有4種，分別為BAT1、BAT2、ARO8和ARO9[2]。CHOLET O等[36]對漢斯德巴氏酵母菌（Debaryomyces hansenii）、馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中的86個基因進行了脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）微陣列分析，發現能高效同化L-蛋氨酸的解脂耶氏酵母中，與釀酒酵母同源的基因BAT2和ARO8表達量較高，表明這兩種轉氨酶在酵母通過Ehrich途徑轉化蛋氨酸生成3-甲硫基丙醇中起到一定的作用。研究表明，基因BAT1編碼線粒體氨基轉移酶BAT1p，優先參與支鏈氨基酸（BCAAs）的生物合成，BAT2則編碼細胞質氨基轉移酶BAT2p，參與BCAAs的分解代謝，兩者在3-甲硫基丙醇的合成中起到的作用較小，而在合成其他高級醇中的作用顯著[37-40]?；駻RO8和ARO9則分別編碼Aro8p和Aro9p，兩者作用的底物是芳香族氨基酸，分別被稱為芳香族氨基酸轉移酶Ⅰ和Ⅱ[41-42]。Aro8p屬于組成型表達蛋白，是主要的芳香族氨基酸轉移酶，它的表達易受到氨基酸合成代謝的影響；Aro9p則是一種誘導表達蛋白，其表達受到氮源調控以及ARO8基因缺失等因素的影響。在已有研究中發現，雖然L-蛋氨酸不是芳香族氨基酸，但其代謝過程與芳香族氨基酸相似，基因ARO8和ARO9在利用L-蛋氨酸合成3-甲硫基丙醇中起到重要的作用[42-43]。Aro8p和Aro9p都具有廣泛的底物特異性，其表達水平在以L-蛋氨酸為唯一氮源、葡萄糖受限的條件下較高，Aro8p表現出較強的催化蛋氨酸轉氨基生物活性[2，43-44]。URRESTARAZU A等[43]研究表明，單獨缺失ARO8或ARO9基因的釀酒酵母都能在含有蛋氨酸存在的基礎培養基上生長，而同時缺失ARO8和ARO9基因后則無法生長，通過體外實驗發現，ARO8基因編碼的芳香族氨基酸轉移酶I不僅對芳香族氨基酸具有轉氨作用，而且還對蛋氨酸、α-氨基乙二酸和亮氨酸具有轉氨活性，ARO9基因編碼的芳香族氨基酸轉移酶II同樣具有較寬廣的底物特異性。YIN S等[27]研究發現，過表達ARO8基因提高的芳香族氨基酸轉移酶活性明顯高于過表達ARO9基因所獲得的活性，表明相比芳香族氨基酸轉移酶II，芳香族氨基酸轉移酶I在轉化L-蛋氨酸合成3-甲硫基丙醇中效果更為明顯。DEED R C等[25]研究表明，單獨缺失基因ARO8可使釀酒酵母BY4743合成3-甲硫基丙醇的能力下降44%，使商用葡萄酒酵母F15合成3-甲硫基丙醇的能力降低92%；單獨缺失ARO9基因對釀酒酵母BY4743合成3-甲硫基丙醇沒有影響，然而卻使菌株F15的3-甲硫基丙醇含量相比野生型菌株提高了46%。另外，相關研究還表明，轉氨酶的轉氨作用具有可逆性，Aro8p和Aro9p可以催化α-KMBA發生轉氨作用產生L-蛋氨酸[45-46]。綜上可見，酵母通過Ehrlich途徑合成3-甲硫基丙醇中轉氨酶Aro8p所發揮的轉氨作用最為重要。

3.2 脫羧酶

在轉氨酶的作用下，L-蛋氨酸轉化為α-KM BA，α-KMBA則在脫羧酶作用下生成3-甲硫基丙醛，這種醛也具有獨特的肉香味，對番茄、奶酪和醬油呈味也發揮重要的作用[47-48]。脫羧酶與轉氨酶不同，在Ehrlich途徑中是不可逆的[2]。VURALHAN Z等[48-49]研究了釀酒酵母CEN.PK113-7D中的脫羧酶，結果表明其擁有5個候選基因可以編碼：ARO10（YDR380w）、THI3（YDL080c）、PDC1（YLR044c）、PDC5（YLR134w）和PDC6（YGR087c），表達的脫羧酶屬于硫胺二磷酸依賴性脫羧酶[27]。ARO10基因編碼的脫羧酶具有廣泛的底物特異性，尤其對芳香族氨基酸具有很強的轉氨活性，是產生支鏈和含硫雜醇類的關鍵貢獻者，尚未發現THI3編碼具有活性的脫羧酶，PDC1基因和PDC5基因編碼為丙酮酸脫羧酶，與ARO10基因編碼的脫羧酶類似，對所有支鏈和含硫的2-oxo酸均表現出活性，兩者中一種的缺失都會激發另一種的大量表達，而PDC6僅能在含低硫的條件下表達，并且PDC5基因編碼的脫羧酶脫羧效率與PDC1基因編碼的相當，而PDC6基因編碼的脫羧酶的脫羧效率最低[50-52]。

VURALHAN Z等[48]研究發現，在以苯丙氨酸、亮氨酸或蛋氨酸為唯一氮源時，5種脫羧酶基因中只有ARO10基因轉錄水平上調，其中使用L-Met作為唯一氮源時，ARO10基因的轉錄水平上調15倍，當其他四個基因失活時，ARO10能編碼足夠量的苯丙酮酸脫羧酶活性[49]。PERPETE P等[35]研究發現，KMBA在Ydr380wp作用下可脫羧生成3-甲硫基丙醛，若Ydr380wp失活，釀酒酵母不能將L-蛋氨酸轉化為3-甲硫基丙醇，而缺失其他四個脫羧酶仍能轉化3-甲硫基丙醇，由此推測KMBA的脫羧作用受Ydr380wp特異性影響。LIU B等[21]研究發現，鹽度可以提高魯氏接合酵母中ARO10基因的表達，從而增加其合成3-甲硫基丙醇的含量。YIN S等[27]通過基因過表達研究同樣發現，ARO10基因的過表達可顯著提高細胞脫羧酶活性，從而提高了3-甲硫基丙醇的產量。由此可見，5種脫羧酶中，ARO10基因所編碼的脫羧酶對酵母通過Ehrlich途徑合成3-甲硫基丙醇更為重要。

3.3 醇脫氫酶

在Ehrlich途徑中，3-甲硫基丙醇合成的最后一步是氧化還原反應，其由3-甲硫基丙醛在醇脫氫酶的作用下發生還原反應而生成的，這一步是非限制性速度，不限制3-甲硫基丙醇的轉化速度，因為酵母中存在許多乙酸脫氫酶，可被其中的任何一種催化完成[2]。

BOER V M等[53]研究發現，醛的氧化或還原受培養條件的影響，在葡萄糖限制型的恒化培養基中，當進行有氧發酵時大部分醛被氧化為酸，進行無氧發酵時大部分醛被還原為醇。VALLET A等[54]研究表明，僅有的能合成3-甲硫基丙醇細菌-酒類酒球菌IOEB 8406中存在乙醇脫氫酶（ADH）活性，在3-甲硫基丙醇的合成中起到重要的作用。DICKINSON J R等[55]采用13C核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）和氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析發現，醇脫氫酶Adh1p、Adh2p、Adh3p、Adh4p、Adh5p和Sfa1p中的任何一種都能將醛轉化成3-甲硫基丙醇。然而，CHE Y X等[31]分析了在添加3-甲硫基丙醛的條件下酵母中7個ADH基因的表達情況，結果發現，只有ADH4表達量明顯增加，在釀酒酵母S288c中過表達ADH4后，3-甲硫基丙醇產量明顯增加，這表明不同醇脫氫酶在合成3-甲硫基丙醇中的重要性不同，有待進一步研究。

3.4 脫甲硫基酶

在Ehrlich途徑中，L-蛋氨酸或其衍生物α-KMBA可以通過脫甲基化轉化，從而產生甲硫醇（methanthiol，MTL），從而對3-甲硫基丙醇的合成產生影響，具有脫甲硫基功能的酶有胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase，CGL）和胱硫醚-β-裂解酶（cystathionine β-lyase，CBL）等[35]。KNOLL C等[56]研究發現酒類酒球菌中胱硫醚-γ/β-裂解酶似乎參與了蛋氨酸代謝途徑生成甲硫醇，在過表達胱硫醚-γ-裂解酶基因的菌株中，顯著增加了蛋氨酸的分解，產生了更多的甲硫醇。JIA K Z等[57]研究發現胱氨酸-β-裂解酶（CBL）可以將蛋氨酸和KMBA降解為甲硫醇，是合成甲硫醇的限速酶。然而，劉麗等[30]敲除胱硫醚-γ-裂解酶基因后，釀酒酵母S288c所產3-甲硫基丙醇產量降低，推測可能除了胱硫醚-γ-裂解酶外，還有其他酶參與了L-蛋氨酸的去甲基化。ZHANG Q等[58]在粉紅螺旋聚孢霉和釀酒酵母中過表達E3-泛素-蛋白連接酶HUWE1后顯著提高了去甲基硫醇途徑中甲硫醇及其衍生物的生物合成，而抑制了Ehrlich途徑中的3-甲硫基丙醛和3-甲硫基丙醇的生物合成。由此可見，影響Ehrlich途徑的支路上的酶對于3-甲硫基丙醇合成也具有重要影響。

4 展望

3-甲硫基丙醇是許多食品中的重要風味物質，隨著人們對天然添加劑3-甲硫基丙醇需求的增加，微生物轉化法生產3-甲硫基丙醇成為滿足消費者需求的重要方法。但已報道的天然菌株中具有高產3-甲硫基丙醇的菌株較少，需要進一步篩選高產產3-甲硫基丙醇的天然菌株，另外，可以利用基因工程對天然菌株進行改造，如可以通過過表達Ehrlich途徑中的關鍵酶，也可以敲除胱硫醚-γ-裂解酶基因，減少蛋氨酸的支路代謝，從而提高3-甲硫基丙醇的產量，再次，也可以通過在發酵過程中分離出發酵產物3-甲硫基丙醇以減少其對微生物的毒性，從而連續不斷的轉化生成3-甲硫基丙醇。隨著對微生物研究的深入，也可利用微生物群落法對不同的微生物進行最佳組合從而獲得3-甲硫基丙醇的最大產量。由此可見，通過傳統篩選方法、分子生物技術及發酵技術等組合可以實現生物法高效轉化合成3-甲硫基丙醇，為生物法合成天然的3-甲硫基丙醇提供廣闊的應用空間。