甲磺酸阿帕替尼對人乳腺癌紫杉醇耐藥性的逆轉作用

曾會會，余小婷，胡婷，王娟，汪婷婷，鄭榮生

(蚌埠醫學院第一附屬醫院腫瘤內科，安徽 蚌埠 233004)

乳腺癌是威脅女性生命健康最常見的惡性腫瘤，成為2020年全球癌癥發病率的主要原因，也是全球第五大癌癥死亡原因[1]?；熢谌橄侔┚C合治療中占有極其重要的地位，紫杉醇作為乳腺癌化學治療中的一線藥物廣泛應用臨床，但紫杉醇耐藥問題已經成為乳腺癌患者治療的主要挑戰。因此，深入探究乳腺癌紫杉醇耐藥的機制，尋找低毒有效的逆轉紫杉醇耐藥的藥物，提高轉移性乳腺癌生存期具有重要意義。

紫杉醇來源于紅豆杉科植物中獲取的天然物質，通過阻止微管蛋白重聚合而起到抗腫瘤作用的。然而，紫杉醇在乳腺癌治療過程中誘導腫瘤細胞發生突變、旁路信號通路的激活等多途徑共同作用產生耐藥性[2]。根據目前研究發現，三磷酸腺苷結合盒轉運體(ATP binding cassette transporter，ABC )的過度表達、β-微管蛋白結合區和微管蛋白突變的改變、凋亡蛋白(如Bcl2和P53)的功能降低、以及細胞因子表達的改變與紫杉醇耐藥性有關[3]。最新研究表明酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKI)與腫瘤細胞的多藥耐藥(multi drug resistant，MDR)表型相互作用，顯著抑制P-gp活性，增加多藥耐藥腫瘤細胞對化療的敏感性[4]。甲磺酸阿帕替尼是我國自主研制的一種小分子TKI，高度選擇性競爭血管內皮細胞生長因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR-2)的ATP結合位點，阻斷下游信號傳導，從而抑制腫瘤血管的生成。阿帕替尼目前批準用于晚期胃腺癌患者，但在肝癌[5]、非小細胞肺癌[6]、食管癌[7]、乳腺癌[8]等臨床研究中也獲得一定的療效。阿帕替尼在逆轉多藥耐藥、抑制腫瘤血管、增強化療和放射治療療效等方面具有顯著的優勢[9]。本研究探索阿帕替尼逆轉乳腺癌紫杉醇的耐藥性及可能機制，從而為解決臨床乳腺癌紫杉醇耐藥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑及儀器

MCF-7人乳腺癌細胞株由蚌埠醫學院中心實驗室保存，MCF-7/Taxol細胞株由本實驗室構建。紫杉醇注射液及阿帕替尼購自北京索萊寶科技有限公司，CKK-8試劑盒購自翌圣生物科技股份有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡及細胞周期檢測試劑盒購自蘭杰柯科技有限公司；山羊抗兔IgG-HRP購自天津三箭生物技術股份有限公司；E-Cadherin、N-Cadherin抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；P-gp、BCRP抗體購自美國Abcam公司。流式細胞儀購自美國BD公司；酶標儀購自上海閃譜公司。

1.2 細胞培養條件

MCF-7細胞使用RPMI1640培養基，在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中無菌培養。細胞傳代用含0.25%胰蛋白酶進行消化。

1.3 構建人乳腺癌MCF-7/Taxol細胞株

采用低濃度加量持續誘導法誘導MCF-7細胞[10]。復蘇MCF-7細胞，常規條件下培養2～3代。紫杉醇對親本細胞MCF-7的半數抑制濃度(half-inhibitory concentration IC50)的0.1作為起始濃度，待每個紫杉醇濃度處理細胞穩定生長后再逐步提高藥物濃度，CCK-8法檢測紫杉醇對耐藥株細胞的IC50，計算耐藥指數(resistance factor RF)，RF=IC50(MCF-7/Taxol)/IC50(MCF-7)。成功構建耐藥細胞，停藥2個月，細胞穩定成長，委托上海軒瑋生物科技服務中心給予MCF-7/Taxol細胞進行STR鑒定。

1.4 CCK-8法檢測紫杉醇對MCF-7及MCF-7/Taxol細胞的毒性

收集對數生長期的親本MCF-7及MCF-7/Taxol細胞接種于96孔板，稀釋細胞至數量為1×104～1×105個/毫升左右，每孔加入100 μL細胞混懸液，待細胞貼壁24 h后吸去上清液，分為3組，實驗組在每孔中加入含有不同濃度的紫杉醇培養液，對照組加入不含藥物的培養液；空白組是不含細胞和藥物的培養液。每組設3個平行孔。繼續培養48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑溶液，37 ℃孵育2 h。在多功能酶標儀450 nm波長處測量各個孔吸光值(OD值)。計算各組細胞抑制率(inhibitory concentration IR)，IR=1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。實驗重復3次，Graphpad prism 9軟件計算各組細胞IC50。

1.5 CCK-8法檢測阿帕替尼對MCF-7/Taxol細胞的毒性及耐藥逆轉作用

分別加入2.5、5、10、20、40、80 μmol/L阿帕替尼加入親本MCF-7細胞；2.5、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L加入MCF-7/Taxol耐藥細胞株。計算各組細胞IR，選取阿帕替尼一高一低2個逆轉濃度聯合紫杉醇，計算聯合阿帕替尼前后紫杉醇對MCF-7/Taxol細胞IC50的變化。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率

利用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測MCF-7/Taxol各組細胞凋亡率的變化。實驗分4組，空白對照組(A組)，紫杉醇無毒劑量組(B組)，阿帕替尼低毒濃度劑量組(C組)，紫杉醇無毒劑量聯合阿帕替尼低毒濃度劑量組(D組)處理MCF-7/Taxol細胞48 h后，分別收集各組細胞，加入適量不含EDTA的胰酶消化細胞。用PBS洗滌細胞3次后收集細胞，按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書，取100 μL的重懸細胞中加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混均，室溫避光孵育10 min，上機前5 min加入10 μL碘化丙啶混勻，再加入400 μL PBS重懸細胞上機。導出實驗數據后用FlowJo軟件分析各組細胞的凋亡率，實驗重復3次。

1.7 流式細胞術檢測細胞周期分布

實驗分組同細胞凋亡檢測分組一致，收集各組的細胞沉淀，棄上清液，按照細胞周期檢測試劑盒說明書，用預冷PBS洗滌2次，加入25 μL碘化丙啶染色液和10 μL RNaseA，混合均勻。再加入0.5 mL碘化丙啶染色液，輕輕混合重懸細胞沉淀，37 ℃避光孵育30 min上機，應用Modfit軟件分析各組細胞周期分布變化情況。

1.8 Western Blot檢測MCF-7/Taxol細胞內相關蛋白的變化

實驗分組同細胞凋亡檢測分組一致，處理MCF-7/Taxol細胞48 h后，用預冷的PBS洗3次，盡量吸干殘液后加入含有PMSF的細胞裂解液150 μL，低溫裂解10 min后，將液體轉移到1.5 mL EP管中，加入5×Loading buffer(按4∶1的比例)，100 ℃煮沸10 min。上樣進行SDS-PAGE膠制作，通過電泳，轉膜至PVDF膜上，將膜浸在封閉液中37 ℃封閉；將膜取出直接放入一抗E-Cadherin(1∶1000稀釋)、N-Cadherin(1∶1000稀釋)、P-gp(1∶2000稀釋)、BCRP(1∶1000稀釋)、β-actin(1∶1000稀釋)，4 ℃過夜；PBST洗膜，每次5 min，洗4次；將膜轉入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶20 000稀釋)中，37 ℃孵育40 min；PBST洗膜，每次5 min，洗5次；用化學發光法(ECL)顯影，實驗重復3次。

1.9 統計學方法

采用SPASS 22.0軟件進行統計學分析，計量資料呈正態分布，以均數±標準差表示，組間比較采用ANOVA方法單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 構建MCF-7/Taxol細胞株及耐藥指數的測定

通過不斷增加紫杉醇濃度，成功構建MCF-7/Taxol細胞株，該細胞株可以在600 nmol/L紫杉醇濃度中穩定生長，其RF=88。撤藥2個月后，MCF-7/Taxol細胞進行STR分型結果顯示來源于MCF-7細胞系，不存在交叉污染現象。紫杉醇作用于MCF-7/Taxol的IC50=(659.9±22.27)nmol/L，見圖1A；對同步傳代的MCF-7細胞的IC50=(17.81±2.27)nmol/L，見圖1B。RF=37，表明MCF-7/Taxol細胞株具有耐藥性。根據實驗結果選取100 nmol/L作為紫杉醇無毒劑量濃度。

圖1 不同濃度紫杉醇作用于MCF-7/Taxol及MCF-7的細胞增殖抑制率

2.2 阿帕替尼對MCF-7及MCF-7/Taxol細胞毒性的影響

將不同濃度的阿帕替尼作用于MCF-7和MCF-7/Taxol細胞株，CCK-8實驗結果分析阿帕替尼對MCF-7細胞的IC50=(20.83±0.41)μmol/L，見圖2A，MCF-7/Taxol細胞的IC50=(35.06±0.94)μmol/L，見圖2B；根據結果數據顯示阿帕替尼對MCF-7/Taxol不具有耐藥性。

圖2 不同濃度阿帕替尼作用于MCF-7及MCF-7/Taxol的細胞增殖抑制率

2.3 阿帕替尼對MCF/Taxol細胞逆轉的影響

選取對耐藥株細胞抑制小于10%的濃度作為逆轉劑在體外實驗中的聯用濃度。選取阿帕替尼2.5 μmol/L和5 μmol/L作為逆轉劑量，與不同濃度的紫杉醇聯用，其MCF-7/Taxol分別為IC50=(344.7±9.32)nmol/L見圖3A、IC50=(174.1±6.11)nmol/L見圖3B，逆轉倍數分別是1.9倍和3.7倍。實驗結果表明阿帕替尼作用于MCF-7/Taxol細胞株具有逆轉耐藥作用，并且5 μmol/L比2.5 μmol/L逆轉作用明顯增加，后續實驗選取5 μmol/L的阿帕替尼作為低濃度逆轉劑量。

圖3 不同濃度阿帕替尼作用于MCF-7/Taxol細胞增殖抑制率

2.4 阿帕替尼對MCF-7/Taxol細胞凋亡的影響

本實驗分為4組，A組未加任何藥物的空白對照組；B組加入100 nmol/L紫杉醇；C組加入5 μmol/L阿帕替尼；D組加入100 nmol/L紫杉醇聯合5 μmol/L阿帕替尼。各組藥物作用于MCF-7/Taxol細胞48 h后，流式細胞術分析其結果，見圖4。阿帕替尼聯合紫杉醇組細胞總凋亡率為(20.42±1.17)%，與空白對照組(10.17±0.05)%、紫杉醇組(12.4±0.07)%、阿帕替尼組的細胞凋亡率(13.98±0.25)%比較，細胞凋亡率升高；紫杉醇組，阿帕替尼組及聯合組進行兩兩比較，細胞凋亡率均有升高(P<0.05)，見圖5。

A：空白對照組；B：紫杉醇組；C：阿帕替尼組；D：紫杉醇聯合阿帕替尼組

對比空白對照組aP<0.05；對比紫杉醇組bP<0.05；對比阿帕替尼組cP<0.05

2.5 阿帕替尼對MCF-7/Taxol細胞周期的影響

各組細胞周期分布的變化見圖6。與空白對照組比較，紫杉醇組、阿帕替尼組、阿帕替尼聯合紫杉醇組G0/G1期分布減少，其差異具有統計學有差異(P<0.05)；與空白對照組比較，紫杉醇組、阿帕替尼聯合紫杉醇組G2/M期分布增加(P<0.05)，阿帕替尼組G2/M期差異不明顯(P>0.05)；與紫杉醇組、阿帕替尼組G2/M期比較，阿帕替尼聯合紫杉醇組G2/M期增加(P<0.05)，見圖7。

A：空白對照組；B：紫杉醇組；C：阿帕替尼組；D：紫杉醇聯合阿帕替尼組

對比空白對照組aP<0.05；對比紫杉醇組bP<0.05；對比阿帕替尼組cP<0.05

2.6 阿帕替尼對MCF-7/Taxol細胞內相關蛋白的影響

Western Blot實驗結果顯示，阿帕替尼聯合紫杉醇組作用MCF-7/Taxol細胞48 h后，與空白對照組、紫杉醇組、阿帕替尼組比較，P-gp蛋白和BCRP蛋白表達變化不明顯(P>0.05)。進一步探究阿帕替尼逆轉紫杉醇耐藥是否與上皮間質轉化有關。阿帕替尼聯合紫杉醇處理MCF-7/Taxol細胞48 h后，與空白對照組、紫杉醇組、阿帕替尼組比較，MCF-7/Taxol細胞內E-cadherin蛋白和N-cadherin蛋白變化不明顯(P>0.05)，見圖8。

3 討 論

紫杉醇是乳腺癌治療最常見的化療藥物，但紫杉醇耐藥是復發轉移性乳腺癌治療的主要障礙。ABC轉運體的過度表達是導致紫杉醇耐藥最常見機制之一，其中P-gp、BCRP蛋白是ABC轉運蛋白中常見的耐藥蛋白，通過將多種化療藥物直接排出腫瘤細胞體外產生耐藥性[11]。因此，ABC轉運蛋白小分子抑制劑是克服傳統抗腫瘤藥物耐藥的一種新的策略。國外學者研究表明TKI藥物(如波齊替尼、拉帕替尼)具有抑制P-gp外排功能，逆轉卵巢癌多藥耐藥[12]。阿帕替尼與其他小分子TKI相比具有更高的抑制血管生成活性，通過抑制膜結合的ABC轉運蛋白的外排功能來逆轉多藥耐藥[13]。但阿帕替尼是否逆轉乳腺癌紫杉醇耐藥及機制研究報道少見。

阿帕替尼是一種小分子TKI，臨床研究數據[14]顯示晚期乳腺癌患者可從小劑量阿帕替尼治療中獲益?；A實驗[15]證明阿帕替尼具有抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖并誘導其凋亡的能力。最近研究[16]表明阿帕替尼聯合白蛋白紫杉醇協同誘導乳腺癌細胞凋亡。根據CCK-8實驗結果顯示低毒濃度的阿帕替尼聯合紫杉醇藥物處理MCF-7/Taxol細胞株后，紫杉醇的IC50值下降，表明阿帕替尼具有逆轉紫杉醇耐藥的作用。流式細胞術結果提示阿帕替尼促進MCF-7/Taxol耐藥株的凋亡，聯合紫杉醇增加耐藥株細胞的凋亡率。阿帕替尼不影響MCF-7/Taxol細胞周期變化，但聯合紫杉醇藥物增加MCF-7/Taxol細胞G2/M期分布。本實驗結果表明阿帕替尼和紫杉醇的聯合治療具有協同作用，通過調節MCF-7/Taxol耐藥株細胞凋亡和周期變化，一定程度上增加了紫杉醇對耐藥株細胞抗腫瘤作用的敏感性。

逆轉多藥耐藥的方式[17]不僅通過抑制ABC轉運體的外排功能，也通過下調ABC轉運體的表達來完成。本實驗通過Western Blot實驗驗證低毒濃度的阿帕替尼對MCF-7/Taxol細胞外排性轉運體P-gp和BCRP蛋白表達的影響，結果提示阿帕替尼不是通過下調紫杉醇耐藥株細胞中 P-gp和BCRP蛋白的表達來逆轉耐藥。張圣村等學者表明[18]阿帕替尼可能是一種P-gp底物競爭性抑制劑，可能通過與紫杉醇競爭性結合ABC轉運蛋白的ATP催化位點，抑制紫杉醇藥物外流，誘導多藥耐藥逆轉，從而增加化療敏感性。上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)是腫瘤細胞從上皮樣轉化為間充質樣表型或部分間充質表型，對腫瘤細胞遷移、侵襲和化療的耐藥性方面具有潛在的作用[19]。國內學者研究表明EMT在乳腺癌紫杉醇耐藥機制中發揮重要作用，MCF-7/Taxol細胞發生EMT且具有較強的耐藥和侵襲轉移能力[20]。本研究結果發現阿帕替尼作用于MCF-7/Taxol細胞，EMT相關蛋白E-cadherin蛋白和N-cadherin蛋白變化不明顯，顯示阿帕替尼逆轉紫杉醇乳腺癌耐藥的發生與上皮間質轉化過程可能不相關。

綜上所述，本研究結果證明阿帕替尼具有逆轉紫杉醇耐藥的作用，通過聯合紫杉醇藥物促進 MCF-7/Taxol耐藥株的凋亡和細胞周期分布于G2/M期，增強紫杉醇藥物敏感性，是一種有潛力的逆轉多藥耐藥藥物。但是阿帕替尼逆轉乳腺癌紫杉醇耐藥的機制仍需進一步的研究驗證，為今后臨床應用提供更充分的實驗依據。