熒光法測定溶液和食品添加劑中的馬來酸

于珊珊, 田 俊

(四川大學化學學院綠色化學與技術教育部重點實驗室, 成都 610064)

1 引 言

二酸分子由于其獨特的生物學活性以及作為重要生物中間體的合成而備受關注[1,2]. 在常見的二酸中, 馬來酸(學名：順丁烯二酸)及其幾何異構體富馬酸(反丁烯二酸)是兩種重要的二酸結構, 具有巨大的的生物學影響[3]. 它們廣泛存在于醫藥、食品以及聚合物的合成中, 同時也是一種重要的化工原料. 近年來研究發現, 馬來酸在三羧酸循環中起著重要的作用, 但過量食用馬來酸對腎臟有損害, 并可能導致多種腎臟疾病[4-6]. 因此根據中國現行食品安全標準[7], 禁止馬來酸酐和馬來酸作為食品添加劑加入食物中. 由于馬來酸作為添加劑可以使得淀粉等面制品的光澤度提高且黏性和彈性增加, 從而它被不法商家所利用. 在我國, 2010年長春, 2011年廣西, 以及2013年臺灣均發生過大規模非法添加馬來酸在淀粉中的事件, 給人們的健康造成了不利影響和傷害.

目前, 馬來酸的檢測主要依賴于離子色譜法[8]、高效液相法[9]以及氣相色譜-串聯質譜法[10]等. 這些方法均依賴于昂貴的儀器設備, 且樣品制備繁瑣、操作過程復雜, 在一定程度上增加了檢測的難度, 限制了大批量快速檢測. 而熒光法具有靈敏度高、測定快速、檢測方式多樣化、可以實現在線實時檢測等優點, 因此此方法得到了科學家的青睞. 近年來, 熒光法在化學、生物及醫學領域迅猛發展, 取得了優異的效果[11-13].

我們之前報道的一類基于聯萘醛結構的探針1[14]對手性谷氨酸和天冬氨酸有良好的化學選擇性和對映選擇性, 且對部分二酸化合物有一定的熒光增強. 本文對探針1與馬來酸反應后的熒光進一步研究, 并將其應用于淀粉中馬來酸的檢測.

圖1 探針1Fig.1 Probe 1

2 實 驗

2.1 儀器與試劑

本文所用藥品均來自安耐吉化學試劑供應商, 且使用前未做特殊處理. 所有用于測定熒光光譜的溶劑均為色譜純, 來自Fisher公司. 熒光光譜儀：日立F7000(HITACHI). 核磁：Bruker AV-400核磁共振儀 (1H: 400 MHz, 0.5% TMS為內標). 化合物1參照文獻[14]的方法合成.

2.2 核磁滴定實驗

稱取化合物1(1 mg)于核磁管中, 另分別稱取馬來酸(1.9 mg)和富馬酸(1.9 mg)分別加入不同的核磁管中, 加入氘代溶劑定容至500 μL, 混合均勻后, 室溫放置2 h后進行核磁氫譜的掃描.

2.3 熒光測試

2×10-3mol/L 的化合物1的CH2Cl2溶液和二酸的甲醇溶液均為每次實驗現配. 在10 mL試管加入2.5 mL的甲醇溶液, 用微量注射器加入25 μL的化合物1 (2×10-3mol/L), 再加入所需當量的二酸客體溶液(0.10 mol/L, MeOH). 將反應液置于室溫下反應一定時長后進行熒光測定. 所有樣品的熒光光譜測定總時間不超過2 h.

3 結果與討論

3.1 核磁滴定

我們考察了在不同氘代溶劑中, 化合物1與馬來酸和富馬酸的核磁情況. 如圖2所示, 在氘代二甲基亞砜、丙酮和乙腈中, 化合物1的醛基信號峰δ=9.53與順丁烯二酸作用后沒有任何變化, 表明其與二酸均不發生反應. 在氘代甲醇中, 加入馬來酸后,δ=9.53處的信號峰消失, 在δ=4.75處產生新的信號峰, 這表明羧基與醛基形成對稱的半縮醛結構. 在加入富馬酸的溶液中, 醛基信號峰δ=9.53沒有完全消失, 在δ=4.75處的新的信號也比較弱, 表明沒能形成穩定的半縮醛結構. 這與我們之前的報道[14]一致, 醇類溶劑有利于這一反應的進行, 核磁滴定實驗也表明了這一點.

圖2 化合物1與馬來酸和富馬酸在不同氘代溶劑中的反應: (a) DMSO-d6; (b) Acetone-d6; (c) MeCN-d3; (d) MeOH-d4Fig.2 The reaction of compound 1 with maleic acid and fumaric acid in different deuterated solvents: (a) DMSO-d4; (b) Acetone-d6; (c) MeCN-d3; (d) MeOH-d4

3.2 熒光實驗

3.2.1 反應時間和反應當量比考察 在2.5 mL甲醇中加入化合物1 (2.0 mmol/L)與馬來酸和富馬酸(10 equiv), 分別反應不同時間后進行熒光測量.如圖3a, 3b所示, 隨著時間增加, 熒光強度逐漸增加, 在240 min后達到穩定, 表明反應達到平衡, 后續測量均在反應240 min后進行.

不同當量的馬來酸與化合物1反應的熒光效果如圖3c, 3d所示.隨著馬來酸量的增加, 熒光強度穩定增加.在馬來酸當量大于等于10 equiv后, 熒光強度保持穩定，表明這一反應的穩定性, 不會隨著后續馬來酸的過量加入而破壞反應平衡.因此其具有較好的應用前景.

圖3 (a) 化合物1(2.0 × 10-5 mol/L)與馬來酸(10 equiv) 在10, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300和360 min時的熒光圖譜; (b) 化合物1(2.0 × 10-5 mol/L)與馬來酸(10 equiv)在350 nm處的熒光強度;(c)化合物1(2.0×10-5 mol/L)與馬來酸(0～30 equiv)反應的熒光光譜; (d) 化合物1(2.0 × 10-5 mol/L)與不同當量的馬來酸在350 nm處的熒光強度誤差線通過3次獨立實驗測定. 溶劑： MeOH∶DCM=99∶1, v/v. λexc = 285 nm, slits = 5/5 nmFig.3 (a) Fluorescence spectra of compound 1 (2.0 × 10-5 mol/L) with 10 equiv of maleic acid at 10, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300 and 360 min; (b) fluorescence intensity of compound 1 (2.0 × 10-5 mol/L) with 10 equiv of maleic acid at 350 nm; (c) fluorescence spectra of compound 1 (2.0 × 10-5 mol/L) with 0～30 equiv of maleic acid; (d) fluorescence intensity of compound 1 (2.0 × 10-5 mol/L) versus the equivalence of maleic acid at 350 nmThe error bars were obtained with three independent measurements. Solvent: MeOH∶DCM=99∶1, v/v. λexc = 285 nm, slits = 5/5 nm

3.2.2 檢測限計算 化合物1與低當量馬來酸作用時熒光強度的急劇線性增長表明可以在低濃度下進行檢測. 接下來, 我們就化合物1對馬來酸響應的檢測限做了考察.檢測限的計算根據公式：LOD=3δ/S，其中δ為測量10次空白樣品的標準偏差值,S為得到的濃度與熒光強度滴定曲線擬合的線性關系的斜率. 為了計算結果的準確, 選取熒光強度變化明顯, 馬來酸在0～10 mmol/L時的熒光強度進行考察. 如圖4所示, 隨著馬來酸的加入, 熒光強度呈線性增長, 且線性關系良好.通過擬合的線性直線的斜率以及空白探針樣品測量10次得到的標準偏差值即可計算得到檢測限. 通過計算可得探針1對馬來酸的最低檢測濃度可達1.3×10-7mol/L. 這一檢測濃度達到百納摩爾級別, 由此可見該探針具有較高的靈敏度, 具有較大的實際應用潛能.

圖4 化合物1(2.0×10-5 mol/L)對0～10 mmol/L的馬來酸的 (a) 熒光滴定; (b) 350 nm處熒光強度的線性擬合圖溶劑： MeOH∶DCM=99∶1, v/v. λexc = 285 nm, slits = 5/5 nmFig.4 The fluorescence spectra (a) and fluorescence intensity at 350 nm (b) of compound 1 (2.0 × 10-5 mol/L) with 0～10 mmol/L of maleic acidSolvent: MeOH∶DCM=99∶1, v/v. λexc = 285 nm, slits = 5/5 nm

3.2.3 干擾實驗 抗干擾能力也是衡量一個熒光探針重要的指標.我們之前報道了化合物1對23種二酸的熒光響應, 化合物1對馬來酸有著優異的選擇性[14]. 在此基礎上, 本文分別考察了其余22種二酸對化合物1與馬來酸熒光響應的干擾. 在化合物1中分別加入馬來酸(6 equiv)和其余二酸(4 equiv)，反應后的熒光結果如圖5所示.相比于化合物1與馬來酸, 加入其余二酸后幾乎沒有大的熒光變化, 表明了化合物1對馬來酸識別的穩定性, 也進一步表明了其實際應用的價值.

圖5 (a) 測試的23種二酸的結構式; (b) 化合物1(2.0 × 10-5 mol/L)與馬來酸(6 equiv)在其他二酸存在時的熒光光譜; (c) 350 nm處熒光強度的柱狀圖溶劑： MeOH∶DCM=99∶1, v/v. λexc = 285 nm, slits = 5/5 nmFig.5 (a) The structural formula of 23 diacids tested; (b) compound 1 (2.0 × 10-5 mol/L) and the fluorescence spectrum of maleic acid (6 equiv) in the presence of other diacids; (c) the bar graphs of the fluorescence intensity at 350 nmSolvent: MeOH∶DCM=99∶1, v/v. λexc = 285 nm, slits = 5/5 nm

3.3 淀粉樣品中馬來酸的檢測

我們將這一檢測體系拓展到淀粉樣品中的馬來酸檢測. 分別取3份40 g玉米淀粉放入100 mL燒瓶, 一份作為空白對照, 其余兩份分別加入0.40 g馬來酸和富馬酸. 然后向3份樣品中加入80 mL甲醇, 攪拌24 h后過濾掉不溶的固體, 取1 mL濾液與1 mL 化合物1(0.86 × 10-3mol/L)二氯甲烷溶液混合反應2 h后, 用甲醇稀釋到2× 10-5mol/L后進行熒光測定. 如圖6所示, 化合物1與二酸反應后, 與馬來酸作用表現出明顯的強熒光信號, 富馬酸和空白對照幾乎沒有熒光增強. 因此可以很好地通過熒光法來對富含淀粉食物中的馬來酸添加劑進行檢測.

圖6 熒光光譜法測定淀粉食物中的馬來酸Fig.6 Determination of maleic acid in starch food by fluorescence spectroscopy

4 總 結

我們對已有的化合物1與馬來酸反應的熒光條件細化篩選, 考察了反應時間和當量比. 低的檢測限表明探針具有高的應用潛能, 優異的抗干擾能力和對淀粉樣品中的馬來酸添加劑有效的檢測進一步表明其實用價值. 總之, 我們開發了一種利用熒光法高效檢測食品添加劑中馬來酸的方法.