春雷霉素在番茄幼苗中的吸收與轉運機制

張洪珍，衛國羽，趙 微，胡安龍*

（1.貴州大學作物保護研究所，貴陽 550025；2.貴州大學農學院，貴陽 550025）

農藥分為內吸性農藥和非內吸性農藥。對于具有內吸性的農藥而言，農藥分子進入植物細胞有主動運輸和被動運輸。通常研究認為農藥以被動擴散的方式進入植物細胞，而關于蠶豆葉原生質體吸收草甘膦的試驗結果證明，植物對草甘膦的吸收是被磷酸鹽轉運蛋白介導[1]。春雷霉素（圖1），又稱春日霉素，其結構由二碳側鏈、春雷胺和D-肌糖三部分組成[2]。該類抗生素是一種農用、醫用抗生素，其能抑制氨酰-tRNA結合mRNA-核糖體蛋白復合體，阻止蛋白質翻譯的起始，抑制菌絲生長和造成細胞顆?；?，從而使得病原菌凋亡[3]。春雷霉素自研發以來，由于其高效低毒的特性，在亞洲和南美洲被廣泛應用于農業，對稻瘟病、番茄葉霉病、馬鈴薯環腐病、黃瓜和西瓜細菌性角斑病等具有很好的防效[4]，在農業病害防治中具有很大的應用價值。目前關于春雷霉素的研究主要集中在作用機制[5]、田間防效[6]、殘留[7]等方面，而對于春雷霉素在植株體內的內吸傳導特性和轉運機制研究較少。

圖1 春雷霉素化學結構式

農藥的主動吸收及韌皮部輸導對防治作物根部和維管束病害、刺吸式口器害蟲等有較大優勢。前人研究發現，草甘膦以主動方式跨膜運輸并進入韌皮部向根部輸導，使其表現出優良特性[8]。因此，探明農藥分子在作物體內吸收機理與傳導特性具有重要意義。本研究以番茄幼苗為研究對象，通過葉面和根部浸藥，采用高效液相色譜串聯質譜法探究了春雷霉素在植物體內的吸收與傳導方式，以期揭示該藥劑的傳導特性與吸收機理，為后期該藥劑研發設計靶向輸導型農藥分子提供依據，以及為田間科學合理施藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290高效液相色譜儀、Agilent 6470質譜儀、ST16R冷凍離心機，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；XW-80A渦旋混合器，上海精科實業有限公司；CPA225D電子天平，德國賽多利斯股份公司。

春雷霉素原藥（純度98%）、D-葡萄糖、根皮苷（純度98%），阿拉丁試劑有限公司；氰化羰基間氯苯腙（CCCP，純度98%）、N-丙基乙二胺（純度98%），天津希恩思生化科技有限公司；二硝基苯酚（DNP，純度98%），麥卡希試劑有限公司。以上均為市售國產分析純產品。超純水，美國密立波公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄培養方法及樣品前處理

精選適量飽滿的種子，于30℃條件下用無菌水浸種催芽24 h，然后將種子均勻撒播在土壤表面，覆土，用噴壺灑水浸濕土壤。室內培養條件為室溫（25±2）℃，用加濕器使室內濕度保持在85%左右，于光照、黑暗分別處理16、8 h。以培養3葉番茄幼苗為供試材料。稱取2.00 g勻質化的番茄樣品（精確到0.01 g）于10 mL離心管中，加入4 mL提取溶液（V甲醇∶V水為9∶1），渦旋振蕩提取2～3 min；加入1 g氯化鈉，渦旋振蕩1 min，于4 000 r/min下離心5 min；取1 mL上清液至2 mL離心管中，加入30 mgN-丙基乙二胺（PSA），渦旋振蕩30 s，于12 000 r/min下離心5 min；取上層凈化液1 mL，過0.22μm有機濾膜，待用HPLC-MS/MS檢測。

1.2.2 春雷霉素向頂傳導試驗

用超純水稀釋春雷霉素，使制劑質量濃度分別為50、100、150 mg/L，用5 mL藥劑對每株番茄進行根部灌根施藥，每個處理重復3次，以超純水處理為對照，于相同條件溫室培養。在施藥后3、6、12、24、32、48 h，整株取樣，取樣時將根部和莖葉部分開，于-20℃保存，備用。

1.2.3 春雷霉素向基傳導試驗

用超純水稀釋，使制劑質量濃度分別為500、1 000、1 500 mg/L，將番茄第2張葉片（共3張葉片，浸藥葉片即為中部葉片）浸于配制好的藥液中，除去浸藥葉，上下各有一片葉可取。用清水處理的番茄為對照，于相同條件下溫室培養。在噴藥后6、12、24、48、72 h整株取樣，取樣時將根部和莖葉部分開，稱重并記錄，于-20℃保存，備用。

1.2.4 不同影響因子對番茄吸收春雷霉素的影響

（1）用檸檬酸和氫氧化鉀將春雷霉素藥液pH值分別調至4、5、6、7、8、9，將番茄根部浸于不同pH值的春雷霉素藥液中；（2）分別在24℃與4℃下將番茄根部浸于藥液并分別于6、12、24 h取樣；（3）將番茄根 部 分 別 浸 入 含 有0.15、0.30、0.50 mmol/L的CCCP和0.5、1.0、1.5 mmol/L的DNP溶液中培養1 h，隨后轉移至春雷霉素藥液中培養后取樣；（4）將n春雷霉素∶nD-葡萄糖=1∶20、1∶200和1∶300，以及將n春雷霉素∶n根皮苷噴=1∶10、1∶20和1∶30的配制藥液分別用于番茄幼苗浸根培養，取樣。以上處理藥液最終濃度為150 mg/L、pH值為5（pH處理組除外），在溫室培養（溫度處理組除外）24 h后取番茄幼苗莖部。

1.3 檢測條件

液相條件：流速為0.35 mL/min；柱溫為30℃，進樣量為5μL；流動相A為0.1%的甲酸水（75%）；流動相B為乙腈（25%）；ZORBAX HILIC Plus色譜柱（3.0 mm×50 mm，1.8μm）。質譜電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描；噴霧電壓（IS＋）為5 500 V；電噴霧離子源溫度（TEM）為320℃；霧化氣流量為310.275 kPa；碰撞室入口電壓（EP）為150 V；碰撞室出口電壓（CXP）為85 V；定量離子對為380.3/200.3（m/z）；定性離子對為380.3/112.1（m/z）。

1.4 標準曲線及添加回收試驗

用超純水溶解純度98%的春雷霉素，配制成質量濃度為10 mg/L的母液，再用超純水稀釋成濃度分別為0.001 0、0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0μg/L系列標準工作液，按1.3條件測定標準曲線?？瞻追褬悠分屑尤胍欢看豪酌顾貥藴使ぷ魅芤?，使其添加水平分別為0.05、0.10、0.50 mg/kg，3次重復試驗。按1.2.1方法進行樣品前處理，按1.3條件測定，計算番茄各部位添加回收率和相對標準偏差。

1.5 數據處理

所有實驗進行多次驗證統計結果，每組處理番茄數為10株，重復3次。使用DPS 10.0，Duncan法對試驗獲得的數據結果進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 方法的線性關系、精密度和準確度

由圖2可知，目標檢測物保留時間為0.620 min。標準曲線線性回歸方程為y=1.125 9x＋5.699 9，相關系數為0.994 1。由表1可知，在0.05、0.10、0.50 mg/kg添加水平下，春雷霉素在番茄樣品中的平均回收率為89%～96%，相對標準偏差（RSD）為1.00%～3.00%，均低于10.00%。按信噪比為3（S/N=3）計算檢出限，可得春雷霉素檢出限為0.003μg/L。結果表明，建立的方法線性關系良好，精密度和準確度較高，適用于番茄樣品中春雷霉素的檢測。

圖2 春雷霉素在番茄各部位色譜圖

表1 春雷霉素在番茄各部位的添加回收率

2.2 根部施用春雷霉素在番茄植株中的吸收和傳導

如圖3所示，分別用50、100、150 mg/L春雷霉素處理番茄6 h后，在根部和莖部均能檢測到春雷霉素。用藥劑處理24 h后，3組不同濃度處理的葉片中檢測到目標藥劑含量分別為3.91、9.16、38.46μg/L。根部的春雷霉素含量在3～24 h內呈上升趨勢，24～48 h內處于平衡狀態，可能因為在該時間段內根部吸收的藥劑迅速向莖部和葉部輸送。處理48 h后，藥劑在根部的累積達到最大量；50、100 mg/L處理組中，莖部的春雷霉素含量在3～48 h內差異不顯著，但用150 mg/L處理后，莖部的春雷霉素含量呈顯著上升趨勢；高濃度處理組葉部中春雷霉素的積累量上升較快，且在24～48 h內也趨于穩定。研究結果表明，春雷霉素通過番茄幼苗根部吸收后向上傳導，并在植株各個部位累積。

圖3 不同濃度的春雷霉素在番茄幼苗中的吸收和分布

2.3 葉部施用春雷霉素在番茄植株中的吸收和傳導

由表2可知，將幼苗中部葉片用不同質量濃度藥液浸泡6 h后，在中部葉片均能檢測到目標藥劑，其含量分別為11.09、25.99、40.81μg/L，說明春雷霉素在番茄葉片上具有良好的吸收特性。6～12 h在幼苗上部和下部葉片均未檢測到目標藥劑，12 h后能檢測到微量的春雷霉素，可能是藥劑被葉片吸收后大部分都累積在番茄葉片的各個細胞及組織中，或是向下運輸。藥劑處理12 h后均可在莖部及根部檢測到目標藥劑，其中用1 500 mg/L處理葉片72 h后，春雷霉素在根部的累計含量可高達21.03μg/L。

表2 春雷霉素處理中部葉片后在番茄幼苗中的吸收和分布

以上結果表明，春雷霉素在番茄體內既可通過由木質部向上運輸的質外體轉運，也可由韌皮部向下運輸的共質體轉運，具有雙向運輸的特性。

2.4 pH對番茄吸收春雷霉素的影響

由圖4可知，春雷霉素吸收量隨著堿性增強而逐漸下降。pH值為5時，春雷霉素的最大吸收量為83.07μg/L，隨著pH值的升高吸收量降低，逐步降低至80.00、58.86、50.09、42.01μg/L，特別是pH值為9時直接下降到42.01μg/L，與pH值為5時的吸收量相差1.9倍，表明番茄吸收春雷霉素受酸堿性的影響。

圖4 pH值對番茄吸收春雷霉素影響

2.5 溫度對番茄吸收春雷霉素的影響

如表3所示，2種不同溫度處理下，春雷霉素的吸收量都隨著時間的增加而升高，且都是在24 h吸收量最大，分別為25.90和81.46μg/L。相關研究表明，Q10值（24℃下的吸收量除以4℃下的吸收量）小于或大于2.0可作為判斷作物對農藥的吸收與生物代謝是否有直接的聯系，還是屬于被動物理過程的標準[9]。本研究中Q10值均大于2.0，表明番茄幼苗對春雷霉素的吸收屬于主動運輸。

表3 不同溫度條件下番茄幼苗莖部春雷霉素的吸收量

2.6 能量抑制劑對番茄吸收春雷霉素的影響

DNP可抑制細胞產生能量；CCCP是一種解偶聯劑，會影響植物對化合物的吸收，能去除藥物在跨膜過程中的質子驅動力，這是判斷吸收過程是否需要能量的重要標準。由圖5可知，加了0.50 mmol/L的CCCP和DNP的處理與未加的空白對照相比，處理24 h后，藥劑吸收量由72μg/L分別下降至28、25 μg/L，均受到顯著抑制，抑制率分別達60.12%、60.28%，說明番茄吸收春雷霉素需要能量。

圖5 能量抑制劑（CCCP、DNP）對番茄吸收春雷霉素的影響（P＜0.01）

2.7 競爭性底物對番茄吸收春雷霉素的影響

D-葡萄糖進入植物體細胞，必須有載體蛋白才能完成運輸。當藥劑和D-葡萄糖同時存在時，藥劑和D-葡萄糖同時競爭共用載體而影響藥劑的吸收。由圖6可知，加入D-葡萄糖后與空白對照相比，春雷霉素吸收量受到了明顯的抑制作用，從72μg/L降低至60、46、25μg/L。隨著D-葡萄糖配比量的升高，抑制效果增強，抑制率分別為16.67%、36.11%、65.28%。加入葡萄糖轉運蛋白抑制劑根皮苷，春雷霉素吸收量也受到了顯著的抑制效果，分別降低至50、35、30 μg/L，抑制率分別為30.56%、51.39%、58.33%。隨著根皮苷濃度升高，抑制效果加強。上述結果表明，番茄對春雷霉素的吸收可能有單糖轉運蛋白的參與。

圖6 競爭性底物（D-葡萄糖、根皮苷）對番茄吸收春雷霉素的影響（P＜0.01）

3 結論與討論

本研究采用浸根浸葉法，通過在番茄幼苗根部和特定葉位施藥，分別研究了春雷霉素在番茄幼苗中的向頂和向基傳導能力，以及番茄幼苗對春雷霉素的吸收機理。結果表明，春雷霉素具有較好的內吸性和傳導能力，于番茄幼苗根部施藥后，可被根部快速吸收并向地上部分傳導，6 h后即可到達植株葉部；根部中春雷霉素含量在3～24 h內呈上升趨勢，24～48 h內處于平衡狀態。通過用藥劑質量濃度分別為500、1 000、1 500 mg/L對幼苗中部葉片處理24 h后，上部葉片、莖部和根部均能檢測到微量的春雷霉素，其中1 500 mg/L處理組在72 h后，春雷霉素在根部的累計含量可高達21.03μg/L，表明番茄葉片吸收藥劑后，藥劑能向根部輸導。綜合以上皆說明春雷霉素在番茄幼苗體內具有雙向輸導特性，即可以向上輸導至頂部葉片，也可以向下運輸至根部。

Michelet等[10]證明了植物質膜ATPase活性存在一個最適pH值，本試驗中發現弱酸性和中性環境有利于番茄幼苗對春雷霉素的吸收，在pH為5時吸收量達到最大；在pH為9時吸收量最小。低溫對春雷霉素的吸收有一定的抑制作用，與前人證明低溫能抑制黃瓜對硅、小麥對菲主動吸收[11]的結果一致。4℃條件下的吸收量明顯少于24℃條件下的吸收量，不同時間段的Q10值均大于2，表明番茄幼苗對春雷霉素的吸收屬于主動吸收過程。DNP是一種能量抑制劑，CCCP是一種解偶聯劑[12]，二者可以作為判斷植株對某種化合物的吸收是否需要能量的標志[13-15]。用CCCP、DNP處理后發現，春雷霉素吸收量受到顯著抑制，高濃度處理組抑制率分別可達60.12%、60.28%。為進一步驗證此吸收過程是否有載體蛋白參與，采用單糖轉運蛋白競爭性底物D-葡萄糖和根皮苷進行處理，結果發現二者都對番茄幼苗吸收春雷霉素產生了抑制作用，與前人證明根皮苷、D-葡萄糖能抑制KPT2細胞對慶大霉素的吸收，且慶大霉素在動物細胞內的吸收是由鈉-葡萄糖轉運體SGLT2所介導的結果一致[16-17]，由此表明春雷霉素的吸收可能受單糖轉運蛋白介導。

綜上所述，春雷霉素具有較好的內吸性，以及具有能同時向頂和向基運輸的特性。其吸收受低溫、能量抑制劑（CCCP、DNP）、pH、單糖轉運蛋白競爭性底物等因素的影響，說明該藥劑的內吸傳導是由單糖轉運蛋白介導的主動吸收的過程。所得研究結果有助于雙向輸導型藥劑的開發，以及為指導春雷霉素田間科學合理用藥提供理論依據。