布托啡諾通過調控miR-665表達對脂多糖致心肌細胞炎癥反應及細胞凋亡的影響

魏利娟，馬亞飛，陳小莉，郭仲輝，王鵬華

心肌細胞損傷是引起心血管疾病的重要原因之一，其中，炎癥反應引起的心肌細胞凋亡是誘發心肌細胞損傷的重要因素，脂多糖(LPS)屬于革蘭陰性菌胞壁的重要成分，LPS可促進炎癥反應從而加重心肌細胞損傷，因此，如何減輕心肌細胞損傷成為治療心血管疾病的關鍵[1]。右美托咪定可抑制高遷移率族蛋白B1(HMGB1)介導的炎癥反應，保護心肌細胞免受缺氧/復氧損傷[2-3]。但相關麻醉藥物對心肌細胞損傷的作用機制尚未完全闡明。布托啡諾是人工合成的一種阿片受體激動劑，其可激活心肌阿片受體從而保護心肌細胞。研究表明，布托啡諾通過抑制線粒體介導的細胞凋亡而減輕心肌缺血再灌注損傷[4]。微小RNA(miRNA)在LPS誘導的心肌細胞中可發揮重要調控作用。研究發現，黃芪多糖通過調節miR-127表達而減輕LPS誘導的心肌細胞炎癥損傷[5]。但布托啡諾是否可通過調控某些miRNA表達從而發揮作用尚未闡明。微小RNA-665(miR-665)在心肌缺血再灌注損傷中表達水平升高，敲低其表達可激活p21激活激酶-1(PAK1)/蛋白激酶B(Akt)信號通路，從而減輕心肌細胞損傷[6]。但布托啡諾是否通過調控miR-665的表達影響LPS致心肌細胞炎癥反應和細胞凋亡尚未可知。因此，本研究采用LPS誘導心肌細胞建立細胞損傷模型，探討布托啡諾是否可通過調控miR-665的表達從而參與LPS誘導的心肌細胞炎癥反應及凋亡過程，并探究其可能作用機制，為進一步闡明布托啡諾治療心血管疾病的分子機制奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 布托啡諾購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；大鼠心肌細胞H9C2購自上海鈺博生物科技有限公司；LPS購自上海滬鼎生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)檢測試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司；DMEM、胎牛血清購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000、Trizol試劑、反轉錄與實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；膜聯蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購自上海瑞楚生物科技有限公司；anti-miR-NC、anti-miR-665、miR-NC、miR-665 mimics購自廣州銳博生物技術有限公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 心肌細胞接種于96孔板(5×103個/孔)上，分別加入濃度為10 mg/L LPS的培養液培養24 h[7]，設為LPS組。同時將正常培養的細胞作為Con組。使用不同濃度(1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L)的布托啡諾與含有濃度為10 mg/L LPS的培養液培養24 h[8]，分別設為LPS+Bu-L組、LPS+Bu-M組、LPS+Bu-H組。參照Lipofectamine2000試劑說明書分別將anti-miR-NC、anti-miR-665轉染至心肌細胞，加入含有濃度為10 mg/L LPS的培養液培養24 h，分別設為LPS+anti-miR-NC組、LPS+anti-miR-665組。參照Lipofectamine2000試劑說明書分別將miR-NC、miR-665 mimics轉染至心肌細胞，加入含有4 μmol/L布托啡諾與10 mg/L LPS的培養液培養24 h，分別設為LPS+Bu+miR-NC組、LPS+Bu+miR-665組。

1.2.2 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測TNF-α、IL-6水平 取各組心肌細胞培養液，采用ELISA法檢測TNF-α、IL-6水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取各組心肌細胞加入預冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，棄上清，加入500 μL結合緩沖液重懸細胞后依次加入Annexin Ⅴ-FITC(5 μL)與PI(5 μL)，室溫振蕩孵育10 min，應用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 qRT-PCR檢測細胞中miR-665的表達水平 Trizol法提取各組心肌細胞中總RNA，應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度，將RNA反轉錄合成cDNA(嚴格按照試劑盒說明書進行操作)，以cDNA為模板進行qRT-PCR反應(嚴格按照試劑盒說明書進行操作)，反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40次循環。應用美國ABI ViiA7 qRT-PCR儀檢測miR-665相對表達量。

1.2.5 蛋白質免疫印跡法(Western Blot)檢測Bcl-2、Bax蛋白表達 取各組心肌細胞加入400 μL RIPA裂解液提取細胞總蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白變性后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)反應，轉膜、封閉，分別孵育一抗稀釋液(1∶1 000)，4 ℃孵育24 h后分別孵育二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫孵育1 h后進行曝光顯影，應用Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結 果

2.1 布托啡諾對LPS誘導的心肌細胞炎性因子表達的影響 與Con組比較，LPS組TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+Bu-L組、LPS+Bu-M組、LPS+Bu-H組TNF-α、IL-6水平依次降低(P<0.05)，且LPS+Bu-L組、LPS+Bu-M組、LPS+Bu-H組TNF-α、IL-6水平比較差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 布托啡諾對LPS誘導的心肌細胞炎性 因子表達的影響(±s，n=9) 單位：pg/mL

2.2 布托啡諾對LPS誘導的心肌細胞凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響 與Con組比較，LPS組細胞凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+Bu-L組、LPS+Bu-M組、LPS+Bu-H組細胞凋亡率依次降低(P<0.05)，Bax蛋白水平依次降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平依次升高(P<0.05)，且LPS+Bu-L組、LPS+Bu-M組、LPS+Bu-H組細胞凋亡率、Bax蛋白、Bcl-2蛋白水平比較差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1、表2。

表2 布托啡諾對LPS誘導的心肌細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響 (±s，n=9)

圖1 布托啡諾對LPS誘導的心肌細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

2.3 布托啡諾對LPS誘導的心肌細胞中miR-665表達的影響 與Con組比較，LPS組miR-665表達水平升高(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+Bu-L組、LPS+Bu-M組、LPS+Bu-H組miR-665表達水平依次降低(P<0.05)，且LPS+Bu-L組、LPS+Bu-M組、LPS+Bu-H組miR-665表達水平比較差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 布托啡諾對LPS誘導的心肌細胞中miR-665表達的影響 (±s，n=9)

2.4 抑制miR-665表達對LPS誘導的心肌細胞炎性因子表達和細胞凋亡的影響 與LPS+anti-miR-NC組比較，LPS+anti-miR-665組TNF-α、IL-6水平、細胞凋亡率、Bax蛋白水平均降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖2、表4。

圖2 抑制miR-665表達對LPS誘導的心肌細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響(A為凋亡相關蛋白表達；B為細胞凋亡流式圖)

表4 抑制miR-665表達對LPS誘導的心肌細胞炎性因子表達和細胞凋亡的影響(±s，n=9)

2.5 miR-665過表達逆轉了布托啡諾(4 μmol/L)對LPS誘導的心肌細胞炎性因子表達和細胞凋亡的作用 與LPS+Bu+miR-NC組比較，LPS+Bu+miR-665組TNF-α、IL-6水平、細胞凋亡率、Bax蛋白水平均升高，Bcl-2蛋白水平降低，差異均有統計學意義(P<0.001)。詳見圖3、表5。

圖3 miR-665過表達逆轉了布托啡諾對LPS誘導的心肌細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的作用(A為凋亡相關蛋白表達；B為細胞凋亡流式圖)

表5 miR-665過表達逆轉了布托啡諾對LPS誘導的心肌細胞炎性因子表達和細胞凋亡的作用(±s，n=9)

3 討 論

有研究表明，丙泊酚通過靶向miR-181a/ Bcl-2減少蒽環類藥物誘導的心肌細胞凋亡[9]。丙泊酚通過調控miR-451/HMGB1分子軸而減輕心肌缺血/再灌注損傷[10]。丙泊酚可減輕心肌細胞氧化應激損傷[11]。表明麻醉藥物具有抗心肌細胞損傷的作用，但其具體作用機制尚未闡明。

布托啡諾通過靶向核因子-κB(NF-κB)減輕化膿性大鼠腦損傷[12]。布托啡諾對缺血再灌注損傷心肌具有保護作用，可降低缺血再灌注損傷心肌炎性因子的釋放，其作用可能與布托啡諾激活κ受體有關[13]。布托啡諾可減輕膿毒癥大鼠心肌細胞損傷[14]。本研究結果顯示，LPS處理后可明顯提高TNF-α、IL-6水平，與相關文獻報道結果[15]相似，提示心肌細胞損傷模型建立成功。進一步分析顯示，不同劑量的布托啡諾處理后可明顯降低TNF-α、IL-6水平，且隨著藥物劑量的增加而明顯降低，提示布托啡諾可抑制LPS誘導的心肌細胞炎癥反應，且呈劑量依賴性。心肌細胞中促炎因子大量釋放可促進Bax表達，Bcl-2屬于抗細胞凋亡家族成員，而Bax屬于促細胞凋亡家族成員，其可激活線粒體途徑從而誘導細胞凋亡[16]。本研究結果顯示，LPS誘導的心肌細胞凋亡率升高，Bax表達升高而Bcl-2蛋白表達降低，不同劑量的布托啡諾處理后可明顯降低LPS誘導的心肌細胞凋亡率，抑制Bax蛋白表達，促進Bcl-2蛋白表達，提示布托啡諾可抑制LPS誘導的心肌細胞炎癥反應及凋亡從而減輕細胞損傷，且呈劑量依賴性。

本研究結果顯示，LPS可提高心肌細胞中miR-665表達水平，而不同劑量的布托啡諾處理后可明顯降低miR-665表達水平，且隨著藥物劑量的增加而明顯降低，提示布托啡諾可能通過下調miR-665表達從而減輕LPS誘導的心肌細胞損傷。有研究表明，miR-665上調表達通過抑制內質網應激而促進炎癥性腸病細胞凋亡及結腸炎[17]。miR-665通過抑制CD34介導的冠狀微血管的血管新生而加重心力衰竭[18]。右美托咪定通過調控miR-665表達而對心肌細胞氧化應激損傷發揮保護作用[19]。本研究結果顯示，抑制miR-665表達可明顯降低LPS誘導的心肌細胞TNF-α、IL-6水平及細胞凋亡率。進一步研究顯示，miR-665過表達可明顯逆轉布托啡諾對LPS誘導的心肌細胞炎性因子表達和細胞凋亡的作用。提示布托啡諾通過下調miR-665的表達從而減輕LPS誘導的心肌細胞損傷。

綜上所述，布托啡諾可通過下調miR-665的表達抑制LPS誘導的心肌細胞炎癥反應及細胞凋亡從而減輕心肌細胞損傷，其可能作為布托啡諾治療心血管疾病的作用靶點。