多因素影響白花前胡甲素和乙素含量分析

李肖莉，宋 程，賈 彬，劉 麗，歐金梅，韓邦興1，**

（1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽合肥230038；2.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽六安237012；3.安徽省中藥資源保護與持續利用工程實驗室，安徽六安237012）

傘形科植物白花前胡（Peucedanumpraerupto?rumDunn）的干燥根是中國藥典規定的中藥前胡的唯一來源。前胡味苦、辛，性微寒，具有降氣化痰、散風清熱的功效，多用于治療痰熱喘滿、咯痰黃稠、風熱咳嗽痰多等癥［1］。白花前胡資源豐富，主要分布于浙江、江西、福建、安徽、貴州等地，生長于山坡林緣，路旁或半陰性的山坡草叢中。目前研究認為前胡主要含香豆素類化合物［2-4］，特征性成分為角型二氫呋喃香豆素類化合物，白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E是前胡中主要的3種香豆素類成分?，F代藥理研究表明，白花前胡乙素具有抗腫瘤作用，白花前胡素E能擴張血管，降低血壓［5-6］。近年來，隨著市場需求的增大，野生資源日漸枯竭，已難以滿足市場的需要。在傳統種植過程中，第一年播種出苗后進入營養生長，根部肉質肥厚，當年秋、冬季節采挖，可做藥材。早期抽薹嚴重影響中藥材次生代謝產物的積累，對白花前胡藥材的產量和質量都有很大程度的影響［7］。目前，關于傘形科植物抽薹后不能藥用的調控機制尚不明確，一種可能原因是處于生殖生長時期的白花前胡體內大量的營養成分用于抽薹，根部得不到充足的營養而無法進行正常代謝活動，導致次生木質部面積的增加，香豆素類含量降低［8］。另一種可能原因是白花前胡開始抽薹后，生長中心是地上部分，植物光合作用產生的大部分營養物質由根部轉移至地上部分，供給白花前胡葉和花器官的發育，這可能是早期抽薹現象的主要原因［9］。但由于受遺傳因素、生態因素等影響，致使同一時期白花前胡不同個體間營養生長和生殖生長不相統一，白花前胡早臺是否發生已成為前胡藥材品質形成的關鍵。本研究采用高效液相色譜法測定不同采收時期前胡甲素和乙素含量，探討不同采收期特別是抽薹開花對白花前胡甲素及乙素成分含量的影響，為明確白花前胡采收時期的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器

HPLC高效液相色譜儀（日本島津公司）；JE3002G型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；JE303G型電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；101-4B電熱鼓風干燥箱（余姚市星辰儀表廠）；1000C型粉碎機（永康市紅太陽機電有限公司）；F-030S型超聲波清洗器（福洋電器有限公司）。

1.2 試劑

白花前胡甲素（praeruptorin A，批號B20035~20 mg），白花前胡乙素（praeruptorin B，批號B20037~10 mg），所有對照品均購自上海源葉生物科技有限公司，甲醇為色譜純（上海麥克林生化科技有限公司），甲醇分析純（上海麥克林生化科技有限公司），三氯甲烷分析純（純度≥99.0，西隴科學股份有限公司）。

1.3 材料

試驗所用白花前胡均采自于安徽省六安市金安區東河口栽培基地，土壤類型為水稻土，基原植物經皖西學院韓邦興教授鑒定為傘形科植物白花前胡。分別于2019年3月~11月進行樣品收集，約每隔15~30 d，取不同生長年限、不同坡向生長的樣品。采收其鮮根后洗凈泥土，除去須根，趁鮮切片。經自然陰干后粉碎成粗粉，過3號篩后置于干燥器，密封保存。

1.4 試驗方法

1.4.1 色譜條件

本試驗采用的色譜柱為Inertsil-C18（5μm，250 nm×4.6 mm），以甲醇（A）-水（B）為流動相，等度洗脫的程序如下：流動相甲醇：水=75：25，流速1.0 mL/min，最大吸收檢測波長設為321 nm，進樣體積10μL。理論塔板數按照白花前胡甲素計算應不低于4 000。前胡甲素和乙素對照品及白花前胡不同年限、不同部位的HPLC圖譜結果見圖1。

圖1 白花前胡甲素與乙素標準品及前胡樣品HPLC圖譜Fig.1 The HPLCchromatograms of praeruptorin standards and P.praeruptorum Dunn samples

1.4.2 對照品溶液制備

精密稱取前胡甲素及前胡乙素適量，置100 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，搖勻，配置成甲素濃度0.343 ug/mL及乙素濃度0.340 ug/mL以100%甲醇為空白對照在321 nm處測定吸光值。

1.4.3 樣品溶液制備

稱取粉碎的白花前胡樣品約0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入三氯甲烷25 mL，密塞，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）10分鐘，放冷，再稱重，用三氯甲烷定容，搖勻，濾過；量取續濾液10 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至25 mL量瓶中。

1.4.4 線性關系的考察

量取白花前胡甲素和白花前胡乙素母液各1 mL分別放入5、10、25、100、250 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，即得梯度濃度混合對照品。吸取上述混合對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以絕對含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，將所得數據進行線性回歸。

1.4.5 精密度試驗按照供試品溶液的制備方法，在1.4.1項色譜條件下，進樣10μL，重復進樣6次，記錄峰面積。

1.4.6 穩定性試驗

按照供試品溶液的方法制備一份供試品溶液，在2.1色譜條件下，分別在4、8、12、16、20、24 h時進樣，記錄峰面積。

1.4.7 重復性試驗

稱取同一批母前胡樣品6份，按照供試品溶液制備方法分別制備6份供試品溶液，在1.4.1項色譜條件下，進樣10μL，分別記錄峰面積。

1.4.8 加樣回收試驗

取母前胡樣品6份約0.5 g，分別加入白花前胡甲素和白花前胡乙素對照品適量，按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在1.4.1項色譜條件下，記錄峰面積。

1.4.9 樣品含量測定

稱取樣品粉末，按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在1.4.1項下色譜條件測定樣品中白花前胡甲素和白花前胡乙素含量，重復3次，結果取算術平均值。含量計算公式：m=c（樣品）/c（甲素或乙素）。

1.5 數據分析

采用方差分析、多重比較等統計方法對原始數據進行統計，應用SPSS 21.0等軟件進行數據分析和處理。

表2 白花前胡甲素和乙素回歸方程、相關系數和線性范圍Table 2 Regressive equations，correlation coefficients，linear ranges of praeruptorin A and B

2 結果與分析

2.1 方法學驗證

如表3所示，重復性測定結果表明白花前胡甲素和白花前胡乙素峰面積的Relative standard devia?tion（RSD）分別是0.014%和0.032%，表明該儀器重復性良好?；貧w方程為：白花前胡甲素Y=1 701775.02x+1 574.10（r=0.999），線 性 范 圍0.002~5.15。白花前胡乙素Y=2 099 983.22x+6707.64（r=0.999），線性范圍0.002~5.09。白花前胡甲素和白花前胡乙素精密度的RSD，分別為0.009%和0.012%，結果見表4。供試品溶液在24 h內穩定性良好，白花前胡甲素和白花前胡乙素的RSD，分別為0.014%和0.032%，結果見表5。加樣回收率為99.32%和98.58%，RSD分別為0.025%和0.012%，結果見表6。

表3 重復性實驗結果Table 3 The repeatability experiment

表4 精密度實驗結果Table 4 The precision experiment

表5 穩定性實驗結果Table 5 The stability experiment

表6 加樣回收率實驗結果Table 6 The sampling recovery experiment

2.2 色譜條件優化

圖1 為利用已優化的色譜條件進行白花前胡對照品和樣品分析的結果?？梢钥闯?，白花前胡甲素和乙素對照品色譜峰尖銳，對稱性較好。樣品中大多數色譜峰能夠基線分離，其中兩種對照品與其它雜質的分離度較好，可用于后續定量的實驗。

2.3 采收時期對前胡甲素和乙素含量的影響

如表7和圖2所示，對比前胡甲素和乙素含量，前胡甲素含量總體較高，前胡乙素含量總體較低。在14次采樣過程中，二年生的前胡含量高于一年生前胡，前胡甲素含量變化幅度較大，前胡乙素含量的變化幅度較小。前胡甲素含量在2019年3月30日（二年生）采樣時最高，含量約為1.067 2%；前胡乙素在2019年3月30日（二年生）采樣時含量最高，約為0.120 3%。

表7 不同采收期前胡甲素及前胡乙素含量Table 7 contents of imperatorin A and imperatorin Bin differ?ent harvest time

圖2 不同采收期前胡甲素及前胡乙素含量變化Fig.2 The contents of praeruptorin A and Bat different har?vest time

2.4 栽培環境對前胡甲素和乙素含量的影響

如表8和圖3所示，白花前胡甲素在不同坡向上的含量存在差異，南坡的白花前胡甲素含量約高于北坡、西坡及東坡的80%；而白花前胡乙素含量在不同坡向上差異較小。

圖3 不同坡向前胡甲素和乙素含量Fig.3 The content of praeruptorin A and Bin different slope directions

表8 前胡甲素和乙素含量在不同坡向的差異檢驗Table 8 Difference test of praeruptorin A and Bcontents in dif?ferent slope directions

2.5 抽薹對前胡甲素和乙素含量的影響

由表9和圖4看出，在白花前胡甲素、乙素含量在抽薹前后的差異檢驗中，白花前胡甲素和乙素含量在抽薹前后差異不顯著。

表9 前胡甲素和乙素含量在抽薹前后的差異檢驗Table 9 Difference test of praeruptorin A and Bcontents during bolting

圖4 抽薹前后前胡甲素和乙素含量Fig.4 The content of praeruptorin A and Bbefore and after bolting

2.6 不同組織對前胡甲素和乙素含量的影響

如表10和圖5所示，前胡甲素、乙素含量在不同部位上的差異檢驗中，根組織的前胡甲素含量約高于莖部和葉片的一倍。其中，前胡甲素在葉片的含量高于莖部的1.5倍，即前胡甲素含量在不同部位的順序從大到小為：根＞葉＞莖。根組織中的前胡乙素含量約高于莖部和葉片的1.5倍，葉片的乙素含量高于葉部3倍，即前胡乙素含量在不同部位的順序從大到小為：根＞葉＞莖。

表1 白花前胡樣品采收時間Table1 Sampling of P.praeruptorum Dunn time for collection

圖5 不同生長部位前胡甲素和乙素含量Fig.5 Content of praeruptorin A and Bin different growth parts

表10 前胡甲素和乙素含量在不同部位上的差異檢驗Table10 Difference test of praeruptorin A and Bcontents in different tissues

3 討論

3.1 不同采收期前胡甲素和乙素含量變化

不同的環境、氣候對前胡藥材中香豆素類成分的含量影響較大，包括土壤、溫度、濕度等因素［11］。白花前胡為兩年甚至多年生宿根植物，一般第一年進行營養生長，第二年抽薹開花進行生殖生長［12］。因此，在恰當的時期采收其根莖是保證前胡質量和功效的前提。一般來說，前胡適于冬季至次春莖葉枯萎或未抽花莖時釆挖，此時的前胡甲素和乙素等香豆素成分含量最高。本實驗中，二年生前胡第1次采收時，前胡甲素及乙素含量達到最大值；第1次采樣時含量最高，其他采樣點含量略低于二年生第1次，綜合考慮若采收二年生前胡藥材應選取3月份時間點，采樣時間與文獻報道一致。前胡在第二年三月份采收時，前胡甲素和乙素含量最高，達到《藥典》規定的甲素及乙素含有量不少于0.9%和0.24%的標準，其余采樣點的樣品甲素及乙素含量均不達標。

3.2 栽培因素（光照強度）前胡甲素和乙素含量變化

光照是影響植物生長和生物量積累的重要因素之一。許多研究均表明，農作物的生長情況和產品品質會隨著光照強度的變化而變化［13］。本實驗的采集地位于安徽六安山區，處于北半球北緯31度。因此，位于南坡的前胡植株受到日照的時間最長，其次是西坡和東坡。試驗結果也表明，南坡的前胡甲素含量顯著高于北坡、西坡、東坡；南坡和西坡的前胡乙素含量也是較高的。此外，光照不僅對陰生植物的形態結構塑造具有重要的調控作用，對其內在的生理生化效應和次生代謝產物合成也有明顯的誘導效應［14］。前胡作為半陰生草本植物，其香豆素活性成分的積累同樣受到光照的影響。長日照能夠提高白花前胡香豆素及黃酮醇合成途徑關鍵酶基因PAL、4CL、F6’H、BMT、CYP450的表達水平，這可能是光強影響前胡有效成分積累的主要原因之一［15-17］。因此，在實際生產過程中，應充分考慮光照對前胡藥用成分代謝的作用機制，以期定向篩選出適宜的光照培養條件。

3.3 抽薹與未抽薹前胡甲素和乙素含量變化

抽薹開花對傘形科藥材的根部木質化及其藥用成分的積累都有顯著影響［16-18］。白花前胡的生長周期為兩年，第1年進行營養生長，第2年進行生殖生長。進入生殖生長后，根部開始木質化。因此，作為藥材生產的白花前胡只能當年采收［19］。在第8次采樣點（7月19日）之后獲得的抽薹樣本逐漸增多，抽薹后前胡由營養生長迅速進入生殖生長，9月份以后植株不再長高，營養生長期根系發達，主根肉質肥大。由于生態環境、生理條件等情況不同而使其營養生長期和生殖生長期的長短不相統一。一般將營養生長階段的前胡稱為“母前胡”，將生殖生長階段的前胡稱為“公前胡”，母前胡質地柔軟、氣味香濃品質較好，公前胡質地堅硬、氣味較淡一般不做藥用，故有“雄前胡，須揀去勿用”的說法。前胡在野生狀態下可生長多年以后才抽薹開花，而在栽培情況下，其個體發育時間大大縮短，一般在第2年抽薹開花，少部分甚至第1年就開始抽薹開花［20］。因此必須充分了解白花前胡生物學特性，闡明其抽薹開花的內在規律，尋求既科學又經濟的方法，使二年生變為多年生延長其開花時間，以保證根部藥材的采收質量。

3.4 不同組織部位前胡甲素和乙素含量變化及轉化規律

本試驗中前胡甲素、乙素含量在不同組織部位的差異明顯，根部前胡甲素含量顯著高于莖和葉片，其中前胡甲素在葉片的含量顯著高于莖部。前胡甲素含量在不同部位的順序從大到小為：根＞葉＞莖。根組織中的前胡乙素含量顯著高于莖部和葉片，葉片的乙素含量顯著高于莖部，前胡乙素含量在不同部位的順序從大到小為：根＞葉＞莖。由于香豆素類成分主要積累于前胡根中，其入藥部位也是根。有參考文獻研究表明，白花前胡甲素和白花前胡乙素在前胡早薹前后的比例發生顯著變化，早薹前后兩者的比例關系呈現一降一升的現象［21-22］。本實驗結果表明，抽薹開花后根部的前胡甲素和乙素含量逐漸減少，關于前胡甲乙素是否存在根組織向地上部分的轉運及其調控機制有待進一步地研究。