基于網絡藥理學探索血府逐瘀湯治療非小細胞肺癌的作用機制

田 琳，畢勝男，陳夢竹，牛崇陽，齊文龍，王 檀

長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春 130021

原發性肺癌是我國常見的惡性腫瘤之一，而非小細胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)是其最常見的類型，約占肺癌總數的85%，具有惡性程度高、分化程度低、生長較快的特點，如不及時治療，5 年生存率低于15%［1-2］；目前臨床治療以化療、放療、免疫治療、介入和中醫藥治療為主。其中手術治療是早期NSCLC 的首選方法，但大多數NSCLC 確診時已是中晚期，失去了外科手術的機會，臨床常用EP 方案化療，但放化療對人體毒副反應大，適應癥少。近年來隨著中醫藥治療惡性腫瘤疾病研究的不斷深入，中醫辨證治療癌癥取得了理想效果，使得臨床治療惡性腫瘤有了新選擇［3］。

中醫治療NSCLC 強調辨證治療、標本兼治。瘀阻肺絡證為肺癌的常見分型，非小細胞肺癌患者多氣血虧虛，治療常以補氣活血、祛瘀止痛、化痰散結為治則。血府逐瘀湯出自《醫林改錯》，由桃仁、紅花、當歸、生地黃、川芎、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡、枳殼、甘草組成，具有活血化瘀、行氣止痛等功效，對治療瘀阻肺絡型肺癌有一定療效，目前臨床有很多關于血府逐瘀湯治療NSCLC 的報道，如張紅等［4］選取80 例NSCLC 患者為研究對象，使用血府逐瘀湯進行治療，結果緩解33例，穩定41例，進展6 例，總有效率41.25%。張喜峰等［5］選取52例NSCLC 患者為研究對象，使用血府逐瘀湯進行治療，結果緩解率為75.00%，可見，血府逐瘀湯能提高NSCLC 患者肺功能，對改善中醫證候具有臨床價值。血府逐瘀湯成分復雜多樣，其對NSCLC的治療作用機制目前尚無明確研究報道。

網絡藥理學是近年來新興的一門學科，融合了系統生物學、多向藥理學、計算生物學、網絡分析等多學科技術和內容，將生物學網絡與藥物作用網絡整合，探究疾病及藥物的相互作用機理，與復雜疾病的治療理念相吻合［6］，通過對信號通路的多途徑調節，提高藥物療效，降低藥物毒副作用，以此提升新藥臨床試驗的成功率，節省藥物研發費用。本研究運用網絡藥理學方法，獲取血府逐瘀湯治療NSCLC 的主要藥物成分及活性靶點，建立相關網絡，分析血府逐瘀湯治療NSCLC 的作用機制，為臨床使用血府逐瘀湯提供數據支持。

1 資料與方法

1.1 文獻檢索利用“CNKI、萬方”等數據庫的高級檢索，以“血府逐瘀湯+肺癌、血府逐瘀湯＋非小細胞肺癌、網絡藥理學”為關鍵詞，以中醫學、中藥學、中西醫結合為文獻檢索范圍，檢索時間不限。

1.2 數據庫與分析軟件基因表達數據庫（gene expression omnibus，GEO，美國國立生物技術信息中心NCBI創建并維護的基因表達數據庫）、中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（簡稱TCMSP，網址：http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、Practical Extraction and Report Language（Perl）軟件、R語言的Bioconductor 庫、Cytoscape v3.6.0 軟件、CytoNCA安裝包等數據庫和軟件。

1.3 基因芯片的篩選在GEO數據庫中，以“lung cancer+normal”為檢索詞和“series，Expression profiling by array，Home sapiens”為檢索條件，搜索NSCLC 患者和正常人組織的基因芯片，共篩選了42 個樣本（正常和NSCLC 基因樣本各21個），并下載NSCLC 組織和正常組織的人源基因芯片的matrix 文件（文件編號為GSE118916）和記載探針和基因名字轉化關系的平臺文件（文件編號為GPL15207-17536），作為本文研究的樣本信息。

1.4 差異基因（DEGS）的篩選與處理運用Perl（Practical Extraction and Report Language）軟件，把樣本信息中探針的名稱轉化成基因名稱，得到一個新的基因文件；把42個樣品基因分為正?；颍ㄕ＝M）和癌癥基因（實驗組）兩組，運用Perl 軟件進行分析，得到樣品表達的文件；利用R語言中的limma包，以“logFC（過濾閾值）filter=1，adjPflter（校正后的p 閾值）=0.05”為篩選條件，對樣品基因進行差異分析，篩選出NSCLC組織較正常組織顯著上調、下調的差異基因，利用Library（pheatmap）包繪制基因聚類熱圖和火山圖。

1.5 中藥化學成分及作用靶點數據庫的建立利用TCMSP數據庫，分別以血府逐瘀湯的組成藥物（桃仁、紅花、當歸、生地黃、川芎、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡、枳殼、甘草）為檢索詞，搜索血府逐瘀湯的藥物靶點；再以“口服生物利用度（OB）≥30（其中甘草OB≥60）和類藥性（DL）≥0.18為條件篩選其中藥化學成分。運用Perl軟件整理中藥化學成分和藥物靶點。

1.6 中藥復方調控網絡構建和分析將血府逐瘀湯各藥物的靶點基因和NSCLC的差異基因取交集，以交集基因作為橋梁，得到藥物有效成分和基因的關系與每個節點的屬性；運用Cytoscapev3.6.0軟件和JAVA8 軟件，以上述交集基因和藥物相關化學成分為輸入數據，構建血府逐瘀湯化合物-靶點網絡的可視化網絡圖。

1.7 ppi蛋白互作網絡構建和網絡拓補分析使用Cytoscapev3.6.0軟件中的Bisogenet包，以基因為輸入數據，利用深度數據包檢測數據庫（deep packet inspection，DPI）、蛋白相互作用數據庫（biological general repository for interaction datasets，BIOGRID）、人類蛋白參考數據庫（human protein reference database，HPRD）、BIND 等數據庫，觀察基因內部的相互作用關系，構建蛋白互作網絡（protein-protein interaction networks，PPI）；利用CytoNCA 包進行網絡拓補分析，找出臨界節點數目相對較高的蛋白和蛋白之間相互作用比較緊密的蛋白，再用這部分蛋白去構建核心網絡。

1.8 基因本體（gene ontology，GO）富集分析運用R 語言的“org.Hs.eg.db Bioconductor”包，以基因名稱為輸入數據，得到基因對應的id 文件；再利用R 語言的“colorspace、clusterProfiler、enrichlot”等程序包，以id 文件為輸入數據，進行GO 富集分析，通過圖像展示中藥有效化合物的靶點蛋白在基因功能中的作用。

1.9 京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析通過R語言的library（clusterProfiler、ggplot2）等包，以id 文件為輸入數據，進行KEGG通路富集分析；運用Cytoscapev3.6.0 軟件構建KEGG 關系網絡，其結果以節點的形式形象地展示基因與信號通路之間的富集關系。

2 結果

2.1 差異基因表達通過對GEO 數據庫中NSCLC患者與正常人組織的基因芯片進行數據挖掘，共獲取NSCLC肺組織與正常肺組織的差異基因2861個，上調基因1313 個，下調基因1548 個。差異表達基因熱圖見圖1，差異表達基因火山圖見圖2。

圖1 差異表達基因熱圖

圖2 差異表達基因火山圖

2.2 化合物有效活性成分篩選利用TCMSP 數據庫進行檢索，以“口服生物利用度（OB）≥30（其中甘草OB≥60）和類藥性（DL）≥0.18”為條件篩選血府逐瘀湯的中藥化學成分，獲得柴胡、赤芍、川芎、當歸、紅花、桔梗、牛膝、生地黃、桃仁、枳殼有效活性成分分別為17、29、7、2、22、7、20、6、23、5 個，血府逐瘀湯總有效活性成分為161個。

2.3 血府逐瘀湯的“化合物—靶點網絡”可視化網絡圖運用Cytoscapev3.6.0 軟件和JAVA8 軟件構建血府逐瘀湯治療NSCLC“化合物—靶點”的可視化網絡圖。先將1984 個血府逐瘀湯化合物靶點與2861 個NSCLC 靶點基因取交集，得到69 個交集基因，對應血府逐瘀湯中82 個候選化合物，包括柴胡有效化合物12個、川芎有效化合物4個、甘草有效化合物22個、桔梗有效化合物2個、牛膝有效化合物7 個，枳殼有效化合物4 個、紅花有效化合物9個、桃仁有效化合物11個、赤芍有效化合物4個、多種藥混合有效化合物7個。血府逐瘀湯候選化合物成分見表1。再把69個交集基因和82個血府逐瘀湯的候選化合物做為“化合物—靶點”的可視化網絡圖的節點，得到了397 條邊，見圖3。圖中度值最高的化合物為槲皮素（quercetin），其次為毛地黃黃酮（luteolin）、漢黃芩素（wogonin）、甘草寧G（Gancaonin G）等。這些度值較高的化合物可能是血府逐瘀湯治療NSCLC 的關鍵化合物。體現了血府逐瘀湯治療NSCLC 的多靶點、多成分特點。

圖3 血府逐瘀湯“化合物—靶點”的可視化網絡圖

表1 血府逐瘀湯候選化合物成分

2.4 血府逐瘀湯治療NSCLC 的蛋白互作網絡構建和網絡拓補分析Cytoscape v3.6.0 軟件的Bisogenet 包以69 個基因為輸入數據，在DPI、BIOGRID、HPRD、BIND 等數據庫中構建各共有靶點的蛋白互作網絡。針對血府逐瘀湯治療NSCLC，運用CytoNCA 包，以DC≥61，BC≥1500 為篩選條件，對臨界節點數目較高的蛋白進行網絡拓撲分析，繪制出由88 個關鍵節點組成的核心網絡，核心網絡關鍵節點名稱見表2，篩選策略圖見圖4。

圖4 篩選策略示意圖

2.5 基因本體論（GO）富集分析GO 富集分析得到935 個GO 條目，列舉生物學功能排名較靠前的20 個條目，見圖5—6。圖中顯示血府逐瘀湯的中藥活性成分主要富集在對活性氧的反應過程、營養代謝過程、類固醇激素代謝過程、對機械刺激的反應過程、氧化水平過程、鎘離子響應過程等生物過程中；中藥活性成分主要影響膜筏、膜微區、膜區域等細胞結構。

圖5 GO富集功能分析（BP富集結果）

2.6 KEGG富集通路分析通過R語言的library（cluster Profiler、ggplot2）等包，對基因名字進行KEGG通路富集分析得到69條信號通路，列舉排名靠前的20 個條目，見圖7。主要包括膀胱癌信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、前列腺癌信號通路、乙型肝炎信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、人類T細胞白血病病毒1型感染信號通路、細胞衰老信號通路、白介素17 信號通路、松弛素信號通路等，提示血府逐瘀湯通過作用于以上多條信號通路治療NSCLC。

圖6 GO富集功能分析（CC富集結果）

圖7 KEGG富集通路氣泡圖

3 討論

原發性肺癌是我國常見的惡性腫瘤之一，而NSCLC 是其最常見的類型，NSCLC 有很多致病因素。駱文斌等［7］認為肺癌的主要致病因素有邪毒留滯、飲食內傷、情志勞倦及體質等。邪毒侵肺，或情志內傷，導致肺失疏泄而生痰，或因飲食不節，平素過食生冷辛辣，致使脾胃運化功能失常，內生痰濁瘀血，蘊結于肺，形成積塊。在眾多發病機制中，痰瘀最為嚴重，二者相互影響，既是病理產物，又是致病因素，血府逐瘀湯方中黃芪益氣固表；桃仁潤燥行滯；紅花止痛化瘀、引血下行；赤芍、川芎活血通經；生地黃清熱活血、養血益陰；柴胡升達清陽、疏肝解郁；桔梗、枳殼寬胸行氣，與柴胡同用，可使氣血循環、理氣行滯；甘草具有調和諸藥之效。諸藥合用可益氣補肺、疏肝解郁、引血下行，達到化瘀、活血、行氣的效果，對治療NSCLC有良好療效［8-9］，本研究運用中藥復方網絡藥理學和基因芯片分析血府逐瘀湯的有效成分及作用靶點，為臨床使用血府逐瘀湯提供數據支持。

從NSCLC 組織與正常組織的基因差異分析結果看，共獲得兩者的差異基因2861 個，上調基因1313個，下調基因1548 個，以此作為血府逐瘀湯治療NSCLC 的靶基因。經過分析血府逐瘀湯的有效化學成分和藥物作用靶點，構建中藥復方治療NSCLC 的調控網絡圖，發現槲皮素（quercetin）、毛地黃黃酮（luteolin）、漢黃芩素（wogonin）等化學成分的度值在圖中排名靠前，槲皮素、毛地黃黃酮是血府逐瘀湯的混合藥物有效成分，甘草、牛膝、紅花等多種藥物都含有這兩種成分，漢黃芩素是牛膝的有效成分。目前藥物有效成分的相關研究表明，槲皮素是一種天然類黃酮，它具有抗氧化，促進細胞凋亡，抗微小血管生成等作用，而氧化、細胞凋亡、免疫等是腫瘤細胞產生和惡變的基礎，所以槲皮素貫穿腫瘤產生與發展的終始。槲皮素還能調控PI3K/Akt、MAPK、MMP-9 等的細胞信號通路，發揮抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡、阻止腫瘤細胞侵襲及轉移等作用［10-12］。毛地黃黃酮是一種天然植物多酚化合物，目前臨床研究表明黃酮具有抑制氧化、抵抗炎癥、抑制腫瘤細胞生長、抗動脈粥樣硬化等廣泛的生物學作用，其分子結構3，6 一二羥基黃酮具有較強的抗腫瘤活性分子，能夠抑制腫瘤的發生、增殖、遷移、侵襲、血管生成以及耐藥性等細胞生物過程［13］。漢黃芩素為中藥牛膝的主要活性成分之一，是一種黃酮類化合物，黃愷飛等［14］研究發現漢黃芩素可以誘導人肺癌細胞A549 凋亡，其作用機制與下調Bcl-2、survivin表達、上調Bax蛋白有關?？梢?，血府逐瘀湯主要以槲皮素、毛地黃黃酮、漢黃芩素等化合物成分作用于NSCLC 基因，達到治療（NSCLC 的目的。

從蛋白互作網絡結果看，AKT1、PCNA、BRCA1、TP53等是血府逐瘀湯治療NSCLC的關鍵靶點。AKT1能夠參與細胞凋亡和葡萄糖代謝的細胞過程。在人基因里，TP53是非常重要的抑癌基因，在正常細胞中低表達，在惡性腫瘤細胞中高表達［15］；目前有很多關于RRM1 的報道，如王文然等［16-17］以54 例NSCLC 患者為研究對象，采用吉西他濱聯合卡鉑化療方案，化療前后檢測腫瘤組織及外周血中BRCA1 與RRM1 的表達水平，結果發現腫瘤組織內RRM1 表達可作為預測非小細胞肺癌患者吉西他濱聯合卡鉑治療預后的因子，可以推斷出血府逐瘀湯主要作用于AKT1、PCNA、BRCA1、TP53 等靶點，達到治療NSCLS的效果。

從GO富集分析和KEGG富集分析結果看，血府逐瘀湯的中藥活性成分主要富集在對活性氧的反應過程、營養代謝過程、類固醇激素代謝過程、對機械刺激的反應過程、氧化水平過程、鎘離子響應過程等生物過程中；其治療NSCLC 的通路主要包括膀胱癌信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、前列腺癌信號通路、乙型肝炎信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、人類T細胞白血病病毒1型感染信號通路、細胞衰老信號通路、白細胞介素17 信號通路、松弛素信號通路等。臨床研究表明，血府逐瘀湯可以通過降低全血黏度、血小板黏附性，提高紅細胞變形性及降低白細胞介素16等［18-20］炎癥介質等多種途徑，改善患者血流狀況，起到治療NSCLC 的作用、提高患者生存質量。但目前還缺少對血府逐瘀湯治療NSCLC 的具體蛋白、具體信號通路的研究，本研究可以推斷出血府逐瘀湯治療NSCLC 直接或者間接涉及到的蛋白和信號通路，從而提高中醫中藥治療NSCLC的成功率。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學和基因芯片分析方法初步探究了血府逐瘀湯多成分、多靶點、多通路的復雜機制過程，可為臨床使用血府逐瘀湯治療NSCLC提供數據支持。