激活蛋白-1對機械通氣性肺損傷小鼠肺組織炎癥反應、細胞凋亡和MMP-9/TIMP-1平衡的影響

趙利芳，楊建功，文先杰，王培山，孟瑞霞，王開娟，代 秀

1)新鄉市中心醫院(新鄉醫學院第四臨床學院)麻醉與圍術期醫學科 河南新鄉 453000 2)佛山市第二人民醫院麻醉科 廣東佛山 528099

機械通氣已成為救治各類危重癥呼吸困難患者的主要手段，在改善通氣困難的同時，也可能誘導或者加重肺損傷，即機械通氣性肺損傷(ventilator-induced lung injury，VILI)，如何預防或者減輕VILI已成為臨床研究的重點。研究[1]發現，氣道和肺組織炎癥反應紊亂是VILI發生和發展的重要病理機制。激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)作為細胞內一類重要的轉錄激活因子,通過與靶基因結合并調控靶基因的功能表達，對體內外多種刺激(如細胞因子、機械壓力、細菌和病毒感染等)做出反應，參與調節細胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等過程。研究[2]發現，香葉基二磷酸合酶1基因敲除可以通過調節Toll樣受體2/AP-1信號通路改善VILI。此外，細胞外基質成分改變和細胞膜通透性增加也是VILI重要的病理改變，多種酶原的激活在降解細胞膜結構、增強炎癥反應、重塑氣道結構和功能等方面發揮重要作用[3]。其中基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)是一類研究較深入的蛋白水解酶，主要降解Ⅳ、Ⅴ型膠原蛋白和明膠，在維持細胞局部微環境穩態中扮演重要角色[4]。我們推測AP-1和MMP-9可能參與了VILI的發生過程，并且存在內在聯系,因此本研究探討了AP-1對VILI小鼠炎癥反應、細胞凋亡和MMP-9/組織基質金屬蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)平衡的影響機制，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物2～3個月齡健康昆明小鼠30只，雌雄不限，體重27～33 g，購自上海實驗動物研究中心，許可證號：SCXK(滬)2019-1563。分籠飼養，溫度(23.5±1.5) ℃，相對濕度(35±3)%，晝夜各12 h，自由進食和飲水，適應環境1周后進行后續實驗。所有操作均符合動物倫理學要求。

1.2 動物分組與處理采用隨機數字表法將小鼠分為假手術組、模型組和干預組3組，每組10只。實驗前小鼠禁食12 h，自由飲水。3組小鼠均腹腔注射20 g/L戊巴比妥鈉2 mL/kg麻醉，順利完成氣管插管，股靜脈建立液體通道，10 mL/(kg·h)滴注生理鹽水至實驗結束。假手術組行氣管切開保留自主呼吸；模型組和干預組連接動物專用呼吸機(北京六一生物科技有限公司)行機械通氣6 h，設置呼吸潮氣量為40 mL/kg，吸呼比1∶2，頻率70次/min，吸入氧體積分數21%；干預組連接呼吸機后立即腹腔注射AP-1單克隆抗體(20 μg，江蘇碧云天科技有限公司)，假手術組與模型組腹腔注射等體積的生理鹽水。

1.3 檢測指標

1.3.1血漿白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和腹主動脈血血氧分壓(PaO2)的檢測 ①通氣6 h后采用股動脈放血法處死小鼠，肝素抗凝采集動脈血，3 000 r/min離心5 min取上清血漿，-80 ℃保存集中送檢。ELISA法檢測血漿IL-6和TNF-α水平，試劑購自美國Sigma公司，根據說明書操作。②處死前用血氣針穿刺腹主動脈取抗凝血1 mL，采用動物專用血氣分析儀檢測PaO2。

1.3.2肺濕干重比值(W/D)、肺損傷評分及細胞凋亡指數測定 ①處死小鼠后迅速取右肺上葉，分別測量濕重和干重，計算W/D。②取右肺中葉置于40 g/L多聚甲醛PBS溶液中固定48 h，制備石蠟切片，厚度約4 μm，進行HE染色。在100倍光學顯微鏡下觀察肺組織的病理學改變；進行肺損傷評分，從肺間質水腫、肺泡水腫、中性粒細胞浸潤和肺泡內充血4個方面進行半定量評分，每項賦值0～4分，總分16分，分值越高表示損傷越嚴重。③取右肺下葉肺組織，根據TUNEL細胞凋亡試劑盒(美國Sigma公司)說明操作。凋亡細胞表現為細胞核呈黃色至棕色。在400倍視野下挑選5個完整不重疊的肺泡區域計數凋亡細胞數和總細胞數，細胞凋亡指數=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.3.3肺組織中AP-1、MMP-9和TIMP-1蛋白表達的測定 采用Western blot法檢測，所用試劑均購自美國Sigma公司。取左肺組織依次加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑后充分勻漿，2 000 r/min離心10 min,采用蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度和純度。取50 μg蛋白樣本和等量標本進行上樣、SDS-PAGE電泳，然后帶電轉移至PVDF膜。加入兔抗鼠AP-1、MMP-9、TIMP-1和GAPDH抗體(稀釋度為1∶1 000)過夜孵育，洗滌后加入羊抗兔抗體(稀釋度為1∶500)室溫下搖床孵育1 h，ECL顯色。使用Image J圖像分析軟件測定條帶灰度值，以目的蛋白與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

1.4 統計學處理采用SPSS 19.0進行統計學處理。3組間所有指標的比較均采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組血漿IL-6和TNF-α水平的比較見表1。與假手術組比較，模型組和干預組血漿IL-6和TNF-α水平升高；與模型組比較，干預組血漿IL-6和TNF-α水平下降。

表1 3組血漿IL-6和TNF-α水平的比較 ng/L

2.2 3組小鼠肺組織病理學改變、腹主動脈血PaO2、肺W/D、肺損傷評分和凋亡指數的比較肺組織HE染色結果見圖1。假手術組未見明顯肺損傷，肺泡間隔結構正常，僅有少量炎性細胞浸潤；模型組可見肺間質和肺泡內滲出水腫，肺間質大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，部分肺泡腔內有血性滲出物，肺泡結構紊亂；干預組較模型組肺泡結構破壞減輕，肺泡間隔稍增寬，炎性細胞浸潤減少。

與假手術組比較，模型組和干預組腹主動脈血PaO2降低，肺W/D、肺損傷評分、肺組織中細胞凋亡指數升高；與模型組比較，干預組腹主動脈血PaO2升高，肺W/D、肺損傷評分、肺組織中細胞凋亡指數降低。見圖2、表2。

A：假手術組；B：模型組；C：干預組

A：假手術組；B：模型組；C：干預組

表2 3組小鼠腹主動脈血PaO2、肺W/D、肺損傷評分、細胞凋亡指數的比較

1 mmHg=0.133 kPa;*：與假手術組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05

2.3 3組小鼠肺組織中AP-1、MMP-9和TIMP-1蛋白相對表達量的比較見圖3和表3。與假手術組比較，模型組和干預組AP-1和MMP-9相對表達量增加，TIMP-1相對表達量降低；與模型組比較，干預組AP-1和MMP-9相對表達量降低，TIMP-1相對表達量增加。

圖3 3組小鼠肺組織中AP-1、MMP-9和TIMP-1蛋白的表達

表3 3組小鼠肺組織中AP-1、MMP-9和TIMP-1蛋白相對表達量的比較

3 討論

本研究復制了VILI小鼠模型，HE染色發現模型小鼠肺間質和肺泡內滲出水腫，肺間質大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，部分肺泡腔內血性滲出物，肺泡結構紊亂，與人體VILI病理改變[5]基本一致。VILI的發生機制較為復雜，可能與通氣刺激、氣道高反應、氧化應激、炎癥和免疫反應等密切相關[6]。但是，目前仍然無法確定VILI的有效干預靶點。既往研究[7]發現，機械通氣作為應激源誘導氣道和肺組織產生多種炎癥因子和細胞黏附分子，進而損傷肺泡和間質，導致VILI。AP-1作為機體對應激反應較靈敏的效應分子，在各種急性肺損傷包括VILI中可大量表達，進而發揮生物學功能[8]。

循環動脈血和靜脈血是臨床最易獲得的樣本，檢測動脈血炎癥因子表達更易在臨床中推廣應用。有研究[9]認為，肺泡灌洗液中炎癥因子表達意義更大，肺泡灌洗液中炎癥因子水平與循環動脈血濃度也有較好的一致性。IL-6和TNF-α是主要的促炎因子，是誘發瀑布樣炎癥反應紊亂的核心分子，能夠招募更多的炎癥細胞如白細胞、中性粒細胞、肥大細胞和淋巴細胞向病變部位聚集，釋放更多的炎癥因子(如IL-1β、IL-8)和細胞因子(如血管內皮細胞黏附分子)，不斷向肺泡和間質浸潤，加重肺水腫和肺出血[10-11]。本研究發現，干預組血漿IL-6和TNF-α水平較模型組明顯下降。干預組腹主動脈血PaO2比模型組明顯升高，肺W/D降低，肺組織病理學改變減輕，肺損傷評分降低。VILI以嚴重缺氧和通氣改善不佳為主要臨床表現，嚴重者可導致急性呼吸窘迫綜合征和呼吸衰竭[12]。檢測動脈血PaO2是臨床診斷VILI的重要依據。肺W/D增加提示肺組織水腫、滲出、出血嚴重，繼而發生纖維化，導致肺功能障礙[13]。

細胞凋亡是VILI發生和發展的重要病理改變，研究[14]表明，α1-抗胰蛋白酶能夠通過抑制炎癥反應和細胞凋亡來改善小鼠VILI。黃天豐等[15]研究發現，VILI的發生與IL-17A加重炎癥反應和誘導細胞凋亡有關。AP-1主要由原癌基因jun和fos編碼的蛋白組成，是調節細胞生存和死亡途徑的關鍵轉錄因子，作為基因轉錄的分子開關對細胞內外多種應激源做出反應，調節效應基因的表達[16]；作為細胞內多條信號通路的交會點，調節細胞因子、生長因子、細胞外信號調節激酶等活性，參與多種細胞生物學行為，如增殖、炎癥、分化、凋亡、轉化等，影響多種生理病理過程[17]。研究[18]發現，AP-1調節細胞凋亡具有雙重作用,在不同細胞中可促進或抑制細胞凋亡。AP-1活性受到細胞內外多種因素的調節，如絲裂原活化蛋白激酶和PI3K/AKT通路[19]。AP-1在VILI發生中的具體作用還尚未得到統一認識。本研究發現，干預組肺組織中細胞凋亡指數比模型組降低，AP-1和MMP-9表達減少，TIMP-1表達增加。MMP-9/TIMP-1可能是AP-1的一個重要下游靶點；抑制AP-1活性，可以降低MMP-9表達，上調TIMP-1表達。MMP-9與TIMP-1通常處于動態平衡中，協同維持細胞微環境的穩態，當MMP-9活性增強，TIMP-1活性受到抑制，氣道和肺間質中Ⅳ、Ⅴ型膠原蛋白和明膠成分被降解，細胞通透性增加，細胞基質沉積，肺泡結構破壞，功能障礙[20-21]。

綜上所述，AP-1單克隆抗體外源性作用于AP-1配體，能夠高效降低VILI小鼠肺組織來源的AP-1表達，繼而發揮減輕機械通氣刺激誘導的炎癥反應，減輕缺氧和肺損傷，抑制肺組織細胞凋亡，調整MMP-9/TIMP-1平衡；外源性干預AP-1可改善VILI程度，有望提供臨床干預新靶點。當然，除了肺組織外，其他臟器組織也可能存在AP-1配體，如何更加針對性篩選肺組織來源的AP-1配體，尋找高效的抗體作用靶點，是下一步研究的重點。