新型氨基酸類衍生物的設計、合成及抗腫瘤活性研究

郭易華 黃志勇 王福東 李龍 李榮東

〔摘要〕 目的 將氨基酸引入喹唑啉母核，探究含喹唑啉結構的氨基酸衍生物的抗腫瘤細胞增殖活性。方法 以DL-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和3-氨基-3-苯基丙酸為原料合成關鍵中間體，與喹唑啉母核連接合成一系列4-苯氨基喹唑啉衍生物。采用CCK-8法測試目標化合物對非小細胞肺癌細胞（A549）的抗增殖活性。通過LeDock軟件測試目標化合物與EGFR蛋白的結合效果。結果 合成了21個新型4-苯氨基喹唑啉衍生物，經1H NMR、LC-MS確證其結構。體外抗腫瘤實驗結果表明，目標化合物12u與12o的抗腫瘤活性與陽性對照藥吉非替尼相當。LeDock軟件測試結果與體外抗腫瘤實驗結果一致。結論 新型4-苯氨基喹唑啉衍生物具有抗非小細胞肺癌的作用，為進一步探究含喹唑啉的氨基酸抗腫瘤藥物打下基礎。

〔關鍵詞〕 氨基酸衍生物;喹唑啉;非小細胞肺癌;A549;細胞增殖;化學合成

〔中圖分類號〕R284.3 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.01.011

〔Abstract〕 Objective To introduce amino acids into the quinazoline core to explore the anti-tumor cell proliferation activity of amino acid derivatives containing quinazoline structure. Methods DL-phenylalanine， L-phenylalanine， D-phenylalanine and 3-amino-3-phenylpropionic acid were used as raw materials to synthesize key intermediates， which were connected to the quinazoline core to synthesize a series 4-phenylaminoquinazoline derivatives. The CCK-8 method was used to test the anti-proliferative activity of the target compound on non-small cell lung cancer cells （A549）. LeDock software was used to test the binding effect of the target compound and EGFR protein. Results 21 novel 4-phenylaminoquinazoline derivatives were synthesized， and their structures were confirmed by 1H NMR and LC-MS. The results of in vitro anti-tumor experiments showed that the antitumor activity of compound 12u and 12o was equivalent to that of the positive control drug gefitinib. The LeDock software test results were consistent with the results of in vitro anti-tumor experiments. Conclusion The novel 4-phenylaminoquinazoline derivatives have anti-non-small cell lung cancer effects， which lay the foundation for further exploration of quinazoline containing amino acid anti-tumor drugs.

〔Keywords〕 amino acid derivatives; quinazoline; non-small cell lung cancer; A549; cell proliferation; chemical synthesis

肺癌是嚴重病威脅人們生命的惡性腫瘤之一[1]。隨著表皮生長因子受體（epidermal growth factor rece？鄄

ptor， EGFR）、漸變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase， ALK）和神經營養因子受體絡氨酸激酶（neurotrophin receptor kinase， NTRK）等幾種酪氨酸激酶抑制劑的發展，肺癌患者的存活率略有改善[2-4]。喹唑啉是重要的雜環衍生物，具有抗腫瘤活性[5-7]。吉非替尼為第一代可逆性EGFR抑制劑，在2003年被美國FDA批準為局部晚期或轉移性非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）患者的單一治療藥物[8]。此外，埃羅替尼和阿法替尼也是用于治療非小細胞肺癌的EGFR抑制劑[9-10]，且他們都是含喹唑啉結構的上市抗腫瘤藥物。氨基酸是構成蛋白質的基本單位，具有良好的生物相容性和親和性，將其引入藥物分子，可提高抗腫瘤活性以及代謝穩定性，增加藥物的溶解性，促進細胞對藥物的吸收，降低對正常細胞的毒性，為尋求高效、低毒的抗腫瘤藥物開辟途徑[11-14]。本文以喹唑啉環為母核，將修飾后的氨基酸與喹唑啉4位連接，并對喹唑啉環6位進行結構改造，設計合成了21個新型含喹唑啉的氨基酸衍生物，并測試其對人肺癌細胞株A549的抗增殖活性。

1 儀器與試藥

Water Xevo G2-XS TOf型質譜儀（沃特世科技有限公司）;核磁共振波譜儀AVANCE Ⅲ HD 600 MHz（布魯克科技有限公司）;RE-2000B型旋轉蒸發儀（鞏義市予華儀器有限公司）;DFY-10L型低溫恒溫反應浴槽（鞏義市予華儀器有限公司）;SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）;ZNCL-DL-G2智能磁力攪拌器（愛博特科技有限公司）;DB-2BC型真空干燥箱（鞏義市予華儀器有限公司）;Multiskan MK3型多功能酶標儀（賽默飛世爾科技公司）;人肺癌細胞株A549由湖南中醫藥大學中西醫結合心腦疾病防治實驗室贈予;吉非替尼PS180501（河南普賽化工產品有限公司）。實驗所用試劑均為市售化學純或分析純，所有試劑使用前都未作處理。

2 方法與結果

2.1 ?目標化合物的合成

目標化合物12a～12u的合成方案如圖1所示，合成路線分為兩部分。第一部分，以DL-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸以及3-氨基-3-苯基丙酸為起始原料，經乙?；?、硝化、酯化和還原，得到重要中間體5a～5d。第二部分以6-羥基-7-甲氧基-3H-喹唑啉-4-酮為原料，經乙?；Ｗo羥基，氯化亞砜氯化得到7-甲氧基-6-乙酰氧基-4-氯喹唑啉，然后與第一部分重要中間體對接，脫保護得到重要中間體10a～10d，再對6位羥基進行修飾，得到目標化合物12a～12u。

2.1.1 ?（S）-2-乙酰氨基-3-苯基丙酸（2a）[15]的制備 ?L-苯丙氨酸（15 g，0.091 mol）和水（200 mL）室溫攪拌10 min，緩慢滴加飽和NaOH水溶液，調節溶液的pH值至苯丙氨酸全溶，緩慢滴加乙酸酐（15 mL）。乙酸酐滴加過程中，由于pH值的改變，L-苯丙氨酸析出，滴加飽和NaOH水溶液維持反應液的弱堿性環境（pH=8.0）。室溫反應3 h，TLC檢測反應完全后，滴加鹽酸調節反應液的pH值至2，產物完全析出，抽濾，干燥得白色固體16.6 g，收率：88.2%。

目標化合物2b～2d的合成方法參照上述方法。

2.1.2 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-硝基苯基）丙酸（3a）[16]的制備 ?在250 mL燒瓶中緩慢加入98%硫酸 （9.6 mL）和67%硝酸（8.0 mL），控溫-20 ℃攪拌0.5 h，取出，置于冰浴中攪拌，分批加（S）-2-乙酰氨基-3-苯基丙酸（10 g，0.048 mol）。18 h后停止反應，將反應液倒入200 mL冰水中，攪拌，產物析出，抽濾，干燥得白色固體6.9 g，收率：56.7%。

目標化合物3b～3d的合成方法參照上述方法。

2.1.3 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-硝基苯基）丙酸甲酯（4a）[17]的制備 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-硝基苯基）丙酸（6 g，0.024 mol）溶于甲醇（60 mL），85 ℃攪拌0.5 h，緩慢滴加98%濃硫酸（0.84 mL），回流反應7 h，停止反應，冷卻至室溫。減壓蒸除甲醇，加乙酸乙酯（100 mL）提取，滴加飽和Na2CO3溶液，調節pH值至7，水相用乙酸乙酯（50 mL×2）萃取，合并有機相，加水（50 mL×2）洗滌，無水硫酸鎂干燥有機相4 h。過濾，濾液減壓濃縮，得黃色固體5.8 g，收率：91.6%。

目標化合物4b～4d的合成方法參照上述方法。

2.1.4 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-氨基苯基）丙酸甲酯（5a）[18]的制備 ?還原鐵粉（11.1 g，0.199 mol）、氯化銨（0.68 g，0.013 mol）、乙醇（56 mL）、水（14 mL）和冰醋酸（3.4 mL），90 ℃機械攪拌1.5 h，加入（S）-2-乙酰氨基-3-（4-硝基苯基）丙酸甲酯（5.1 g，0.019 mol）繼續反應3 h。趁熱抽濾，濾液減壓濃縮，加二氯甲烷（150 mL）提取，加水（50 mL×2）洗滌，無水硫酸鎂干燥有機相4 h。過濾，濾液減壓濃縮，得黃白色固體3.4 g，收率：75.2%。

目標化合物5b～5d的合成方法參照上述方法。

2.1.5 ?7-甲氧基-6-乙酰氧基-4-氯喹唑啉（8）[19]的制備 ?6-羥基-7-甲氧基-4-酮喹唑啉（10 g，0.052 mol）、乙酸酐（108 mL）和吡啶（22.4 mL），100 ℃攪拌1 h，加入4-二甲氨基吡啶（1.4 g，0.012 mol），繼續攪拌4 h，停止反應。冷卻至室溫，倒入冰水（500 mL）攪拌，抽濾，濾餅烘干，得黃白色固體。將其溶于氯化亞砜（107 mL），80 ℃攪拌0.5 h，滴加DMF（4.6 mL，0.059 mol）。4 h后停止反應，冷卻至室溫，減壓回收氯化亞砜，倒入冰水攪拌，抽濾，烘干濾餅，得灰白色固體10.5 g，收率：80.0%。

2.1.6 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-乙酰氧基-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（9a）的制備 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-氨基苯基）丙酸甲酯（3.7 g，0.016 mol）溶于異丙醇（37 mL），95 ℃攪拌0.5 h，加入7-甲氧基-6-乙酰氧基-4-氯喹唑啉（4.8 g，0.014 mol）。4 h后趁熱抽濾，烘干濾餅，得白色固體5.0 g，收率：70.6%。熔點：199.9～201.2 ℃。HRMS（ESI）m/z： 453.1791 [M+H]+。

目標化合物9b～9d的合成方法參照上述方法。

2.1.7 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-羥基-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（10a）的制備 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-乙酰氧基-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（3 g，0.007 mol）溶于甲醇（20 mL），70 ℃攪拌0.5 h，加入氨水（5.2 mL）。5 h后冷卻至室溫，反應液減壓濃縮，得黃色油狀物。加入乙酸乙酯（30 mL）攪拌，出現黃色固體，抽濾，烘干濾餅，得黃色固體2.5 g，收率：91.9%。熔點：197.5～198.8 ℃。HRMS（ESI） m/z： 411.1613 [M+H]+。

目標化合物10b～10d的合成方法參照上述方法。

2.1.8 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二甲基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12a）的制備 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-羥基-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（2.8 g，0.007 mol）溶于DMF（14 mL），95 ℃攪拌0.5 h，加入碳酸鉀（1.2 g，0.009 mol）、碘化鉀（0.02 g）和N，N-二甲基-3-氯丙胺（1.5 mL，0.011 mol）。繼續反應8 h，TLC檢測反應完全后，停止反應。冷卻至室溫，加入冰水（70 mL），攪拌2 h，抽濾得粗產品。將粗產品溶于甲醇（10 mL）攪拌，緩慢滴加鹽酸，有白色固體產生，抽濾，烘干濾餅，得白色固體1.6 g，收率：47.3%。

目標化合物12b～12l的合成方法參照上述方法。

2.1.9 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-氯丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（11a）的制備 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-羥基-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（2.5 g，0.006 mol）溶于DMF（10 mL），75 ℃攪拌0.5 h，加入碳酸鉀（1.0 g，0.007 mol）、碘化鉀（0.02 g）和1，3-溴氯丙烷（0.78 mL，0.008 mol）。繼續反應8 h，TLC檢測反應完全后，停止反應。冷卻至室溫，加冰水（50 mL），攪拌2 h，抽濾得粗產品，加丙酮洗滌，烘干濾餅，得黃色固體2.3 g，收率：77.4%。熔點：130.2～131.7 ℃。HRMS（ESI） m/z： 487.1737 [M+H]+。

目標化合物11b～11d的合成方法參照上述方法。

2.1.10 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二乙氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12m）的制備 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-氯丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（2.3 g，0.005 mol）溶于DMF（10 mL），95 ℃攪拌0.5 h，加入碳酸鉀（1.04 g，0.008 mol）、碘化鉀（0.02 g）和二乙胺（0.8 mL，0.007 mol）。繼續反應8 h，TLC檢測反應完全后，停止反應。冷卻至室溫，加冰水（50 mL），攪拌2 h，抽濾得粗產品。將粗產品溶于甲醇（10 mL），緩慢滴加鹽酸，有白色固體產生，抽濾，烘干濾餅，得黃白色固體1.2 g，收率：48.8%。

目標化合物12n～12u的合成方法參照上述方法。

2.2 ?目標化合物的圖譜數據

2.2.1 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二甲基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12a） ?白色固體，收率：41.6%。熔點：165.1～167.5 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.51 （s， 1H）， 7.88 （s， 1H）， 7.61 （d， J=8.5 Hz， 2H）， 7.30 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.22 （s， 1H）， 4.49-4.44 （m， 1H）， 4.12 （s， 3H）， 3.75 （s， 3H）， 3.63-3.60 （m， 2H）， 3.24-3.19 （m， 2H）， 3.08-3.00 （m， 2H）， 1.97 （s， 3H）， 1.27 （s， 6H）， 0.90-0.87 （m， 2H）。HRMS（ESI） m/z： 496.3410 [M+H]+。

2.2.2 ?（R）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二甲基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12b） ?白色固體，收率：38.9%。熔點：153.3～154.5 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.58 （s， 1H）， 7.90 （s， 1H）， 7.63 （d， J=8.2 Hz， 2H）， 7.31 （d， J=8.2 Hz， 2H）， 7.23 （s， 1H）， 4.75-4.71 （m， 1H）， 4.12 （s， 3H）， 3.73 （s， 3H）， 3.33 （s， 6H）， 3.30-3.25 （m， 2H）， 3.24-3.18 （m， 2H）， 3.04-2.95 （m， 2H）， 2.48-2.34 （m， 2H）， 1.95 （s， 3H）。HRMS（ESI） m/z： 496.3407 [M+H]+。

2.2.3 ?2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二甲基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12c） ?白色固體，收率：47.3%。熔點：171.7～174.6 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.53 （s， 1H）， 7.93 （s， 1H）， 7.63 （d， J=8.2 Hz， 2H）， 7.30 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.27 （s， 1H）， 4.49-4.45 （m， 1H）， 4.12 （s， 3H）， 3.75 （s， 3H）， 3.68-3.62 （m， 2H）， 3.23-3.18 （m， 2H）， 3.07-3.01 （m， 2H）， 1.98 （s， 6H）， 1.29-1.25 （m， 2H）， 1.21 （s， 3H）。HRMS（ESI） m/z： 496.3421 [M+H]+。

2.2.4 ?3-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二甲基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12d） ?白色固體，收率：47.3%。熔點：145.7～146.6 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.65 （s， 1H）， 8.18 （s， 1H）， 7.73 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.45 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.26 （s， 1H）， 5.39 （t， J=7.4 Hz， 1H）， 4.42 （t， J=4.9 Hz， 2H）， 4.09 （s， 3H）， 3.66 （s， 3H）， 3.47-3.41 （m， 4H）， 3.00 （s， 6H）， 2.43-2.33 （m， 2H）， 1.98 （s， 3H）。HRMS（ESI） m/z： 496.2431 [M+H]+。

2.2.5 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-嗎啉代丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12e） ?白色固體，收率：36.7%。熔點：168.0～170.2 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.57 （s， 1H）， 8.22 （s， 1H）， 7.69 （d， J=7.9 Hz， 2H）， 7.61 （s， 1H）， 7.34 （d， J=8.3 Hz， 2H）， 4.53-4.40 （m， 1H）， 4.08 （s， 3H）， 4.04-3.98 （m， 2H）， 3.51-3.41 （m， 4H）， 3.35 （s， 3H）， 3.30-3.16 （m， 4H）， 3.06 （dt， J=13.8， 6.9 Hz， 2H）， 2.52-2.40 （m， 2H）， 1.98 （s， 3H）， 1.20 （t， J=7.0 Hz， 2H）。HRMS（ESI） m/z： 538.2517 [M+H]+。

2.2.6 ?（R）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-嗎啉代丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12f） ?白色固體，收率：41.6%。熔點：153.0～155.2 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.59 （s， 1H）， 8.23 （s， 1H）， 7.70 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.63 （s， 1H）， 7.34-7.27 （m， 2H）， 4.46 （t， J=5.6 Hz， 1H）， 4.09 （s， 3H）， 3.99 （t， J=12.2 Hz， 2H）， 3.74 （s， 3H）， 3.46 （t， J=7.4 Hz， 2H）， 3.34 （t， J=1.6 Hz， 4H）， 3.24-3.16 （m， 4H）， 3.08-2.99 （m， 2H）， 2.50-2.42 （m， 2H）， 1.98 （s， 3H）。HRMS（ESI） m/z： 538.2521 [M+H]+。

2.2.7 ?2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-嗎啉代丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12g） ?白色固體，收率：33.7%。熔點：171.0～172.9 ℃。1H NMR（600 MHz， CD3OD） δ 8.57 （s， 1H）， 8.24 （s， 1H）， 7.70 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.56 （s， 1H）， 7.31 （d， J=7.0 Hz， 2H）， 4.46 （t， J=5.2 Hz， 1H）， 4.09 （s， 3H）， 4.01 （t， J=12.1 Hz， 4H）， 3.75 （s， 3H）， 3.45 （t， J=7.2 Hz， 2H）， 3.37-3.33 （m， 4H）， 3.24-3.15 （m， 2H）， 3.09-3.04 （m， 2H）， 2.47 （t， J=6.5 Hz， 2H）， 1.98 （s， 3H）。HRMS（ESI） m/z： 538.2553 [M+H]+。

2.2.8 ?3-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-嗎啉代丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12h） ?白色固體，收率：41.6%。熔點：148.5～150.1 ℃。1H NMR（600 MHz， CD3OD） δ 8.60 （s， 1H）， 8.20 （s， 1H）， 7.72 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.47 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.23 （s， 1H）， 5.41 （t， J=7.1 Hz， 1H）， 4.09 （s， 3H）， 3.95 （t， J=12.3 Hz， 2H）， 3.69-3.60 （m， 4H）， 3.46 （t， J=6.7 Hz， 2H）， 3.34 （s， 3H）， 2.89 （s， 2H）， 2.88-2.78 （m， 2H）， 2.53-2.36 （m， 4H）， 2.00 （s， 3H）。HRMS（ESI） m/z： 538.2518 [M+H]+。

2.2.9 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二丁基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12i） ?白色固體，收率：46.2%。熔點：180.4～182.1 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.60 （s， 1H）， 8.29 （s， 1H）， 7.72 （d， J=8.3 Hz， 2H）， 7.66 （s， 1H）， 7.31 （d， J=8.5 Hz， 2H）， 4.46 （t， J=5.0 Hz， 1H）， 4.09 （s， 3H）， 3.74 （s， 3H）， 3.45 （t， J=7.4 Hz， 2H）， 3.34 （t， J=1.6 Hz， 4H）， 3.24-3.17 （m， 2H）， 3.09-3.01 （m， 2H）， 1.97 （s， 3H）， 1.84-1.70 （m， 4H）， 1.53-1.40 （m， 4H）， 1.29-1.23 （m， 2H）， 1.04 （t， J=7.3 Hz， 6H）。HRMS（ESI） m/z： 580.3360 [M+H]+。

2.2.10 ?（R）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二丁基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12j） ?白色固體，收率：46.2%。熔點：171.9～173.8 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.57 （s， 1H）， 8.32 （s， 1H）， 7.71 （d， J=8.2 Hz， 2H）， 7.31 （d， J=8.8 Hz， 2H）， 7.27 （s， 1H）， 4.46 （t， J=6.3 Hz， 1H）， 4.09 （s， 3H）， 3.75 （s， 3H）， 3.47-3.44 （m， 2H）， 3.24-3.22 （m， 4H）， 3.20-3.19 （m， 2H）， 2.43-2.38 （m， 2H）， 1.98 （s， 3H）， 1.82-1.74 （m， 4H）， 1.64-1.61 （m， 2H）， 1.51-1.44 （m， 4H）， 1.03 （t， J=7.4 Hz， 6H）。HRMS（ESI） m/z： 580.3364 [M+H]+。

2.2.11 ?2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二丁基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12k） ?白色固體，收率：51.2%。熔點：184.2～186.6 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.63 （s， 1H）， 8.25 （s， 1H）， 7.71 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.32 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.28 （s， 1H）， 4.44 （t， J=5.5 Hz， 1H）， 4.09 （s， 3H）， 3.73 （s， 3H）， 3.49-3.41 （m， 2H）， 3.35-3.30 （m， 4H）， 3.25-3.18 （m， 2H）， 3.07-2.99 （m， 2H）， 2.42-2.32 （m， 2H）， 1.96 （s， 3H）， 1.82-1.71 （m， 4H）， 1.52-1.39 （m， 4H）， 1.03 （t， J=7.4 Hz， 6H）。HRMS（ESI） m/z： 580.3368 [M+H]+。

2.2.12 ?3-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二丁基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12l） ?白色固體，收率：43.3%。熔點：152.6～153.9 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.64 （s， 1H）， 8.21 （s， 1H）， 7.74 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.45 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.27 （s， 1H）， 5.40 （t， J=7.4 Hz， 1H）， 4.43 （s， 3H）， 4.14-4.09 （m， 2H）， 4.08 （s， 3H）， 3.46 （t， J=7.7 Hz， 2H）， 2.90-2.80 （m， 2H）， 2.40-2.35 （m， 4H）， 1.98 （s， 3H）， 1.51-1.43 （m， 8H）， 1.22 （t， J=7.1 Hz， 2H）， 1.03 （t， J=7.4 Hz， 6H）。HRMS（ESI） m/z：580.3367 [M+H]+。

2.2.13 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二乙氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12m） ?白色固體，收率：40.4%。熔點：176.3～177.9 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.43 （s， 1H）， 7.79 （s， 1H）， 7.51 （d， J=8.2 Hz， 2H）， 7.24 （d， J=8.3 Hz， 2H）， 7.09 （s， 1H）， 4.48 （t， J=4.9 Hz， 1H）， 3.97 （s， 3H）， 3.44-3.38 （m， 2H）， 3.38 （s， 3H）， 3.34-3.27 （m， 4H）， 3.23-3.18 （m， 2H）， 3.10-3.01 （m， 2H）， 2.56-2.48 （m， 2H）， 1.97 （s， 3H）， 1.41 （t， J=7.3 Hz， 6H）。HRMS（ESI） m/z： 524.2720 [M+H]+。

2.2.14 ?2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二乙氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12n） ?黃白色固體，收率：48.8%。熔點：179.9～181.8 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.51 （s， 1H）， 7.67 （s， 1H）， 7.66 （d， J=8.5 Hz， 2H）， 7.30 （d， J=8.2 Hz， 2H）， 7.22 （s， 1H）， 4.81-4.73 （m， 1H）， 4.16-4.08 （m， 2H）， 4.06 （s， 3H）， 3.39 （s， 3H）， 3.30-3.23 （m， 4H）， 3.10-3.04 （m， 2H）， 2.57 （t， J=6.2 Hz， 2H）， 1.98 （s， 3H）， 1.31-1.24 （m， 6H）， 0.93-0.80 （m， 2H）。HRMS（ESI） m/z： 524.2716 [M+H]+。

2.2.15 ?3-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二乙氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12o） ?白色固體，收率：40.4%。熔點：166.6～168.3 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.41 （s， 1H）， 7.85 （s， 1H）， 7.64 （d， J=8.5 Hz， 2H）， 7.39 （d， J=8.5 Hz， 2H）， 7.11 （s， 1H）， 5.41-5.35 （m， 1H）， 4.50 （t， J=5.9 Hz， 2H）， 4.03 （s， 3H）， 3.97 （s， 3H）， 3.45-3.44 （m， 2H）， 2.87-2.77 （m， 4H）， 2.53-2.49 （m， 2H）， 2.02-1.97 （m， 6H）， 1.41 （t， J=7.2 Hz， 2H）， 1.28 （s， 3H）。HRMS（ESI） m/z： 524.2868 [M+H]+。

2.2.16 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二己基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12p） ?白色固體，收率：45.4%。熔點：186.3～188.9 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.41 （s， 1H）， 7.80 （s， 1H）， 7.52 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.25 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.10 （s， 1H）， 4.64-4.61 （m， 1H）， 4.48 （t， J=4.8 Hz， 2H）， 3.96 （s， 3H）， 3.38 （s， 3H）， 3.35-3.33 （m， 16H）， 3.22-3.18 （m， 2H）， 3.07-3.01 （m， 2H）， 2.50 （t， J=5.9 Hz， 4H）， 1.97-1.96 （m， 6H）， 1.95-1.93 （m， 2H）， 1.28 （s， 3H）。HRMS（ESI） m/z： 636.4132 [M+H]+。

2.2.17 ?2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二己基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12q） ?白色固體，收率：40.5%。熔點：191.1～193.6 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.58 （s， 1H）， 8.12 （s， 1H）， 7.64 （d， J=8.3 Hz， 2H）， 7.34 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.20 （s， 1H）， 4.75-4.72 （m， 1H）， 4.54 （t， J=5.9 Hz， 2H）， 4.08 （s， 3H）， 4.04 （s， 3H）， 3.89-3.82 （m， 2H）， 3.35-3.31 （m， 16H）， 3.30-3.19 （m， 4H）， 3.02-3.00 （m， 2H）， 1.95 （s， 3H）， 1.28 （t， 6H）， 0.95-0.87 （m， 2H）。HRMS（ESI） m/z： 636.4010 [M+H]+。

2.2.18 ?3-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二己基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12r） ?白色固體，收率：48.5%。熔點：191.3～192.9 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.61 （s， 1H）， 8.22 （s， 1H）， 7.71 （d， J=8.2 Hz， 2H）， 7.43 （d， J=8.3 Hz， 2H）， 7.23 （s， 1H）， 5.57-5.17 （m， 1H）， 4.55 （t， J=5.5 Hz， 2H）， 4.04 （s， 3H）， 3.67 （s， 3H）， 3.66-3.60 （m， 4H）， 3.35-3.31 （m， 8H）， 3.00-2.76 （m， 10H）， 1.99 （s， 3H）， 1.41-1.33 （m， 2H）， 1.19 （t， J=7.0 Hz， 6H）， 0.93 （t， J=6.9 Hz， 2H）。HRMS（ESI） m/z： 636.4010 [M+H]+。

2.2.19 ?（S）-2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二辛基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12s） ?白色固體，收率：43.3%。熔點：202.6～204.1 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.43 （s， 1H）， 7.82 （s， 1H）， 7.54 （d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.27 （d， J=8.3 Hz， 2H）， 7.10 （s， 1H）， 4.69-4.65 （m， 1H）， 4.50 （s， 3H）， 3.98 （s， 3H）， 3.46-3.44 （m， 2H）， 3.36-3.31 （m， 24H）， 3.24-3.18 （m， 2H）， 3.08-3.00 （m， 4H）， 2.55-2.44 （m， 2H）， 1.98-1.94 （m， 6H）， 1.28 （s， 3H）， 0.96-0.77 （m， 2H）。HRMS（ESI） m/z： 692.4746 [M+H]+。

2.2.20 ?2-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二辛基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12t） ?白色固體，收率：44.5%。熔點：206.0～208.9 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.20 （s， 1H）， 7.90 （s， 1H）， 7.75 （d， J=7.6 Hz， 2H）， 7.64 （d， J=7.4 Hz， 2H）， 7.54 （s， 1H）， 4.16-4.14 （m， 1H）， 4.11-4.08 （m， 2H）， 3.74 （s， 3H）， 3.57 （s， 3H）， 3.46-3.43 （m， 2H）， 3.39-3.33 （m， 24H）， 3.22-3.21 （m， 4H）， 2.70 （s， 2H）， 1.30-1.25 （m， 6H）， 0.89 （s， 3H）， 0.87-0.86 （m， 2H）。HRMS（ESI） m/z： 692.3880 [M+H]+。

2.2.21 ?3-乙酰氨基-3-（4-（（6-（3-（二辛基氨基）丙氧基）-7-甲氧基喹唑啉-4-基）氨基）苯基）丙酸甲酯（12u） ?白色固體，收率：43.2%。熔點：199.7～201.4 ℃。1H NMR （600 MHz， CD3OD） δ 8.39 （s， 1H）， 7.81 （s， 1H）， 7.63 （d， J=7.8 Hz， 2H）， 7.39 （d， J=7.5 Hz， 2H）， 7.11 （s， 1H）， 5.38-5.34 （m， 1H）， 4.48 （s， 3H）， 3.96 （s， 3H）， 3.33 （s， 24H）， 3.03-2.98 （m， 2H）， 2.90-2.85 （m， 2H）， 2.82-2.73 （m， 4H）， 2.53-2.48 （m， 2H）， 2.01-1.95 （m， 6H）， 1.32-1.24 （m， 2H）， 0.88 （s， 3H）。HRMS（ESI） m/z： 692.4747 [M+H]+。

2.3 體外抗腫瘤活性實驗

采用CCK-8法測定目標化合物12a～12u對非小細胞肺癌細胞A549的體外抗腫瘤增殖實驗，以吉非替尼為陽性對照藥物。將處于對數生長期的A549癌細胞消化種于96孔板中（8×104個·mL-1），置于37 ℃、5% CO2條件下的培養箱中貼壁培養24 h，棄去原培養基。設置空白對照組、陽性藥對照組以及藥物組，按照濃度梯度0.5、1、5、10、25、50、100 μmol/L給藥（每個藥物濃度設6個復孔），每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養（一塊96孔板測定1個目標化合物，且每塊板均有陽性對照物）。細胞培養48 h后，每孔加入CCK-8

10 μL培養基置于培養箱中繼續培養1 h后，用酶標儀在450 nm波長下測其OD值，并計算各化合物的IC50值。IC50值見表1。

2.4 ?目標化合物的分子對接

查閱文獻并從RCSB[20]蛋白庫網站（https：//www.rcsb.org/）獲取EGFR蛋白的X-衍射晶體結構（PDB編號為2ITY[21]），利用LeDock軟件對目標化合物和EGFR進行分子對接。（1）利用Chemdraw 3D軟件對目標化合物進行能量優化，并保存為mol2格式。（2）根據下載的EGFR蛋白分子的配體的位置確定對接盒子的對接參數。（3）通過LeDock軟件進行分子對接，得出目標化合物與EGFR蛋白分子的最低結合自由能（表2）。（4）通過Pymol軟件展示和分析目標化合物與EGFR蛋白分子對接的具體情況。對接結果表明，大部分目標化合物都是與氨基酸殘基ASP-855和LYS-745形成氫鍵，少部分與氨基酸殘基ASP-800、LYS-716和LYS-728形成氫鍵。L構型的目標化合物的最低結合自由能△G（kcal·mol-1）普遍比DL構型和D構型的目標化合物高。其中目標化合物12u的最低結合自由能最小△G=-9.13 kcal·mol-1，它能很好地插入蛋白的結合口袋并與不同的氨基酸發生相互作用，主要為疏水作用和氫鍵作用（圖2A-B）。12u結構中乙?；糠值牡脱醴謩e與ASP-855和LYS-745形成氫鍵，碳鏈和苯環部分與VAL-726、LEU-718和LEU-792形成疏水作用。與活性最差的目標化合物12q相比，盡管目標化合物12u/吉非替尼（圖2C）與目標化合物12q/吉非替尼（圖2D）對接疊合的整體結構相似，但苯環上側鏈之間的相對位置略有變化，12u/吉非替尼對接疊合比12q/吉非替尼對接疊合更緊密，能更加嚴密地鑲嵌在靶點中。LeDock軟件對接結果與體外抗腫瘤活性實驗結果基本符合，推測目標化合物的作用靶點為EGFR蛋白。

3 討論

本文以DL-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和3-氨基-3-苯基丙酸為原料，經乙?；?、硝化、酯化和還原，得到4個重要中間體，通過氨基將中間體引入7-甲氧基-6-乙酰氧基-4氯喹唑啉的4位，并對喹唑啉6位羥基脫保護后進行修飾得到21個目標化合物，經1H NMR、LC-MS進行結構表征。

CCK-8法體外抗腫瘤活性實驗結果表明，與DL構型和D構型目標化合物相比，L構型目標化合物的抗腫瘤活性更好，這可能是因為L構型的目標化合物是由L-苯丙氨酸合成的，而L-苯丙氨酸是人體必需氨基酸。通過對比L構型目標化合物的IC50，發現抗腫瘤效果12e>12i>12p>12a>12m、12s，其C-6位的取代基分別為3-嗎啉丙氧基、3-二丁胺丙氧基、3-二己胺丙氧基、3-二甲胺丙氧基、3-二乙胺丙氧基、3-二辛胺丙氧基。而由3-氨基-3-苯基丙酸合成的目標化合物的抗腫瘤活性與L構型目標化合物恰好相反，其抗腫瘤效果12u>12o>12d>12r>12l、12h，其6位的取代基分別為3-二辛胺丙氧基、3-二乙胺丙氧基、3-二甲胺丙氧基、3-二己胺丙氧基、3-二丁胺丙氧基、3-嗎啉丙氧基。其中12u和12o的抗腫瘤活性與陽性對照藥吉非替尼相當。分子對接結果表明21個目標化合物與EGFR蛋白均有較好的結合效果，目標化合物最低結合自由能與體外抗腫瘤活性實驗結果基本一致。

4 結論

設計、合成了一系列含喹唑啉的氨基酸抗腫瘤衍生物，通過喹唑啉與氨基酸衍生物連接，并對喹唑啉結構進行修飾得到21個目標化合物，通過1H NMR、LC-MS認證其結構。通過體外抗腫瘤活性實驗，發現目標化合物12u和12o的抗腫瘤活性與陽性對照藥吉非替尼相當，分子對接結果與體外抗腫瘤活性基本一致，為開發新型含喹唑啉結構的氨基酸抗腫瘤藥物提供新思路。

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