羊角拗莖的化學成分及其抗炎活性研究

于 淼，冉紅玲，梅文莉，黃圣卓，魏艷梅，蔡彩虹，戴好富，王 昊*

1中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所 海南省黎藥資源天然產物研究與利用重點實驗室；2海南熱帶農業資源研究院 海南省熱帶農業生物資源保護與利用重點實驗室，?？?71101

羊角拗(Strophanthusdivaricatus(Lour.) Hook.et Arn.)又名羊角扭、鯉魚橄欖、山羊角，為夾竹桃科(Apocynaceae)羊角拗屬(Strophanthus)植物，主要分布在我國海南、云南、貴州、廣東和福建等省份，老撾、越南等南亞國家也有分布，野生于丘陵山地、路旁疏林中或山坡灌木叢中[1]。羊角拗全株植物含毒，為藥用強心劑，可用于治療血管硬化、跌打扭傷、風濕性關節炎、蛇咬傷等癥，也可在農業上用作殺蟲劑[1]。研究表明羊角拗主要含有強心苷[2-4]，也含有倍半萜、三萜和木脂素等化學成分[5]，羊角拗的提取物具有強心、抗菌、抗氧化和殺蟲等作用[6-8]，強心苷類化合物具有抗腫瘤、強心等生物活性[9,10]。為了進一步完善羊角拗化學物質基礎研究，深入挖掘該植物的化學成分及其抗炎活性，本研究采用硅膠、Sephadex LH-20凝膠等多種色譜分離技術對羊角拗莖乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物分離研究，并采用LPS誘導小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7體外細胞炎癥模型對其化學成分進行體外抗炎活性測試。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker AV-500型超導核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)；Autospec 300質譜儀(英國VG公司)；分析型高效液相色譜儀(Agilent 1260)(美國安捷倫科技有限公司)；旋轉蒸發儀(Heidolph Laborota)；ELX-800酶標儀(美國寶特公司)；ZHJH-C1109C超凈工作臺(上海智誠分析儀器制造有限公司)；HHB11360-S CO2培養箱(上海躍進醫療器械廠)；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(德國Merck公司)；柱層析硅膠G(200～300目，60～80目)、薄層層析硅膠H(青島海洋化工廠)；氘代試劑(青島騰龍微波科技有限公司)；常用有機試劑為國產AR級試劑(天津市康科德科技有限公司)；色譜純甲醇和乙腈(天津市科密歐有限公司)；水為超純水；濃硫酸(山東淄博濱嶺化工有限公司)；RAW 264.7細胞株(購于中科院干細胞庫)；潔特96孔細胞培養板(TCP011096)(廣州潔特生物過濾股份有限公司)；磷酸緩沖液PBS、DMEM 高糖培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批號21010702)；青鏈霉素混合液(北京Solarbio公司)；胰蛋白酶(美國 Amresco公司)；脂多糖(LPS)、Griess試劑、槲皮素和四甲基偶氮唑藍(美國Sigma公司)。

1.2 材料

羊角拗莖于2019年9月采自海南省?？谑?，并經中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所黃圣卓博士鑒定為夾竹桃科(Apocynaceae)羊角拗屬(Strophanthus)植物羊角拗(Strophanthusdivaricatus(Lour.) Hook.et Arn.)，憑證標本(WANG202002)保存于中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取與分離

羊角拗莖(24.4 kg)，干燥粉碎后用95%乙醇浸泡提取3次，提取液減壓濃縮得到乙醇提取物(1.5 kg)。將提取物分散于水中成懸濁液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到石油醚萃取物(256.0 g)、乙酸乙酯萃取物(328.1 g)和正丁醇萃取物(438.0 g)。乙酸乙酯萃取物經正相硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(10∶1→0∶1)、丙酮梯度洗脫，洗脫液經薄層層析分析后，合并得流分A～H。在HPLC-UV的指導下，F經減壓硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(10∶1→0∶1)、丙酮梯度洗脫，得到12個流分(F1～F12)。F6經減壓硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(5∶1→0∶1)多次梯度洗脫后，通過Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)分離得到化合物2(4.6 mg)、3(4.5 mg)、8(1.3 mg)、9(4.8 mg)和10(2.1 mg)。 F7經減壓硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(10∶1→0∶1)梯度洗脫后，通過Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)分離，再經多次硅膠柱層析以石油醚-乙酸乙酯(5∶1)洗脫得到化合物4(3.1 mg)、6(3.8 mg)和7(1.0 mg)。F8經減壓硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(6∶1→0∶1)梯度洗脫后，通過Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)分離，得到化合物11(2.0 mg)、12(10.5 mg)和13(4.1 mg)，未純化部分再經多次硅膠柱層析以石油醚-乙酸乙酯(4∶1)洗脫后，通過制備薄層色譜得到化合物5(4.1 mg)。F10在甲醇中重結晶得到化合物1(115.0 mg)。

1.3.2 抗炎活性

采用脂多糖(LPS)誘導小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7模型對化合物1～13進行抗炎活性篩選[11,12]。實驗分為陽性對照組(槲皮素)、LPS誘導組、空白對照組和不同濃度的樣品組，并將待測樣品梯度稀釋為5個濃度：100、50、25、12.5、6.25 μM。RAW 264.7細胞復蘇后，采用含10%胎牛血清、1%的青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養液，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。選取對數生長期的RAW 264.7細胞，取100 μL細胞液以5×104個/mL密度接種于96孔板上，于37 ℃、5% CO2、90%以上濕度條件下培養24 h，再分別加入50 μL配制的LPS (終濃度0.5 μg/mL)和50 μL待測化合物溶液(100～6.25 μM)。繼續培養24 h后每孔取100 μL上清液于新的96孔板中，之后在每孔中加入100 μL的Griess試劑，于酶標儀540 nm處測定并記錄吸光度A，根據公式(1)計算出NO的抑制率，通過繪制化合物濃度-抑制率曲線圖，計算化合物對LPS誘導RAW 264.7細胞產生NO的半抑制濃度。

抑制率=(C2-C1)/(C2-C0)×100%

(1)

式中：C0、C1、C2分別為540 nm下測得的空白對照組、不同濃度的樣品組、LPS組的吸光度。

1.3.3 數據處理

用SPSS 25.0對實驗數據進行單因素方差分析，表中數據均用平均值±標準誤差表示。當P<0.05時，認為具有統計學顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

化合物1無色針狀晶體(甲醇)；C30H48O4，ESI-MS：m/z473.3 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：12.03(1H，s，28-OH)，5.16(1H，m，H-12)，4.40(1H，t，J= 4.1 Hz，23-OH)，4.16(1H，d，J= 4.9 Hz，3-OH)，3.42(1H，m，H-3)，3.31(1H，m，H-23a)，3.07(1H，dd，J= 10.5，4.1 Hz，H-23b)，2.74(1H，dd，J= 13.5，4.1 Hz，H-18)，1.09(3H，s，27-CH3)，0.86(3H，s，25-CH3)，0.86(3H，s，29-CH3)，0.86(3H，s，30-CH3)，0.71(3H，s，26-CH3)，0.52(3H，s，24-CH3)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：37.9(C-1)，26.6(C-2)，70.3(C-3)，41.4(C-4)，47.1(C-5)，17.5(C-6)，32.1(C-7)，38.8(C-8)，46.4(C-9)，36.3(C-10)，22.6(C-11)，121.6(C-12)，143.9(C-13)，41.9(C-14)，27.2(C-15)，22.9(C-16)，45.5(C-17)，40.8(C-18)，45.7(C-19)，30.4(C-20)，33.3(C-21)，30.2(C-22)，64.5(C-23)，12.7(C-24)，15.5(C-25)，16.9(C-26)，25.7(C-27)，178.6(C-28)，32.9(C-29)，23.4(C-30)。以上數據與文獻[13]報道對照基本一致，故鑒定化合物1為常春藤皂苷元(結構見圖1)。

圖1 羊角拗莖中化合物1～13的結構Fig.1 The structures of compounds 1-13 from the stems of S.divaricatus

化合物2黃色油狀；C11H16O3，ESI-MS：m/z197.2 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：5.75(1H，s，H-2)，4.22(1H，m，H-6)，2.42(1H，m，H-7a)，1.99(1H，m，H-5a)，1.74(1H，d，J= 4.0 Hz，H-7b)，1.53(1H，dd，J= 14.4，4.0 Hz，H-5b)，1.76(3H，s，H-10)，1.47(3H，s，H-11)，1.28(3H，s，H-9)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：174.4(C-1)，113.3(C-2)，185.7(C-3)，37.2(C-4)，47.9(C-5)，67.3(C-6)，46.4(C-7)，88.9(C-8)，31.0(C-9)，27.4(C-10)，26.9(C-11)。以上數據與文獻[14]報道對照基本一致，故鑒定化合物2為(-)-loliolide。

化合物3黃色油狀；C13H22O4，ESI-MS：m/z243.3 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.17(1H，d，J= 15.7 Hz，H-7)，6.18(1H，d，J= 15.7 Hz，H-8)，3.75(1H，m，H-3)，2.30(1H，d，J= 5.2 Hz，H-4a)，1.65(1H，dd，J= 9.1，5.2 Hz，H-4b)，1.57(1H，d，J= 11.9 Hz，H-2a)，1.26(1H，d，J= 11.9 Hz，H-2b)，2.28(3H，s，H-10)，1.19(3H，s，H-12)，1.18(3H，s，H-13)，0.96(3H，s，H-11)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：36.1(C-1)，47.6(C-2)，64.3(C-3)，41.3(C-4)，68.7(C-5)，70.8(C-6)，145.5(C-7)，133.8(C-8)，200.3(C-9)，27.5(C-10)，25.2(C-11)，29.8(C-12)，20.1(C-13)。以上數據與文獻[15]報道對照基本一致，故鑒定化合物3為(3S,5R,6S,7E)-3,5,6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one。

化合物4黃色油狀；C13H20O2，ESI-MS：m/z209.2 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.75(1H，dd，J= 15.7，9.5 Hz，H-7)，6.11(1H，d，J= 15.7 Hz，H-8)，5.55(1H，br s，H-4)，4.15(1H，m，H-3)，2.34(1H，d，J= 9.5 Hz，H-6)，1.60(1H，dd，J= 12.9，6.7 Hz，H-2a)，1.43(1H，dd，J= 12.9，9.5 Hz，H-2b)，2.25(3H，s，H-11)，1.62(3H，s，H-13)，0.97(3H，s，H-12)，0.88(3H，s，H-10)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：35.9(C-1)，41.0(C-2)，66.9(C-3)，127.7(C-4)，136.1(C-5)，55.5(C-6)，150.3(C-7)，133.4(C-8)，201.0(C-9)，29.6(C-10)，27.2(C-11)，27.0(C-12)，22.6(C-13)。以上數據與文獻[16]報道對照基本一致，故鑒定化合物4為(3R,6R,7E)-3-hydroxy-4,7-megastigmadien-9-one。

化合物5白色粉末；C20H22O6，ESI-MS：m/z359.3 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.94(2H，d，J= 1.7 Hz，H-2，H-2′)，6.80(2H，dd，J= 8.1，1.8 Hz，H-6，H-6′)，6.76(2H，d，J= 8.1 Hz，H-5，H-5′)，4.70(2H，d，J= 4.4 Hz，H-7，H-7′)，4.22(2H，m，H-9a，H-9a′)，3.82(2H，m，H-9b，H-9b′)，3.13(2H，m，H-8，H-8′)，3.84(6H，s，3-OCH3，3′-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：133.8(C-1，C-1′)，111.0(C-2，C-2′)，149.1(C-3，C-3′)，147.3(C-4，C-4′)，116.1(C-5，C-5′)，120.1(C-6，C-6′)，87.5(C-7，C-7′)，55.4(C-8，C-8′)，72.6(C-9，C-9′)，56.4(3-OCH3，3′-OCH3)。以上數據與文獻[17]報道對照基本一致，故鑒定化合物5為松脂素。

化合物6黃色粉末；C20H22O6，ESI-MS：m/z359.3 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.96(1H，d，J= 1.5 Hz，H-2)，6.91(1H，d，J= 1.5 Hz，H-2′)，6.89(1H，m，H-5)，6.89(1H，m，H-5′)，6.84(1H，dd，J= 8.1，1.5 Hz，H-6)，6.79(1H，dd，J= 8.1，1.5 Hz，H-6′)，4.86(1H，d，J= 5.3 Hz，H-7′)，4.43(1H，d，J= 7.1 Hz，H-7)，4.12(1H，d，J= 9.5 Hz，H-9a)，3.85(1H，m，H-9b)，3.85(1H，m，H-9a′)，3.33(1H，m，H-8′)，3.33(1H，m，H-9b′)，2.91(1H，dd，J= 14.8，7.0 Hz，H-8)，3.92(3H，s，5-OCH3)，3.90(3H，s，5′-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：133.2(C-1)，108.7(C-2)，146.9(C-3)，145.5(C-4)，114.4(C-5)，119.3(C-6)，87.9(C-7)，54.6(C-8)，71.1(C-9)，130.5(C-1′)，108.5(C-2′)，146.6(C-3′)，144.7(C-4′)，114.4(C-5′)，118.6(C-6′)，82.2(C-7′)，50.3(C-8′)，69.8(C-9′)，56.1(5-OCH3)，56.1(5′-OCH3)。以上數據與文獻[18]報道對照基本一致，故鑒定化合物6為表松脂素。

化合物7黃色粉末；C15H14O5，ESI-MS：m/z275.2 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.51(2H，d，J= 1.9 Hz，H-2，H-2′)，7.36(2H，dd，J= 8.3，1.9 Hz，H-6，H-6′)，6.89(2H，d，J= 8.3 Hz，H-5，H-5′)，3.94(6H，s，3-OCH3，3′-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：126.5(C-1，C-1′)，111.9(C-2，C-2′)，149.7(C-3，C-3′)，155.4(C-4，C-4′)，116.3(C-5，C-5′)，127.7(C-6，C-6′)，195.6(C-7)，56.4(3-OCH3，3′-OCH3)。以上數據與文獻[19]報道對照基本一致，故鑒定化合物7為4,4′-dihydroxy-3,3′-dimethoxybenzophen-one。

化合物8黃色粉末；C15H12O6，ESI-MS：m/z289.2 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.31(2H，d，J= 8.4 Hz，H-2′，H-6′)，6.81(2H，d，J= 8.4 Hz，H-3′，H-5′)，5.88(1H，s，H-8)，5.33(1H，dd，J= 12.9，3.0 Hz，H-2)，3.11(1H，dd，J= 17.1，12.9 Hz，H-3a)，2.69(1H，dd，J= 17.1，3.0 Hz，H-3b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：80.5(C-2)，44.1(C-3)，197.8(C-4)，159.0(C-5)，131.3(C-6)，164.9(C-7)，96.2(C-8)，165.4(C-9)，103.3(C-10)，131.1(C-1′)，129.0(C-2′)，116.3(C-3′)，165.5(C-4′)，116.3(C-5′)，129.0(C-6′)。以上數據與文獻[20]報道對照基本一致，故鑒定化合物8為6-羥基柚皮素。

化合物9黃色油狀；C10H8O4，ESI-MS：m/z193.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.90(1H，d，J= 9.4 Hz，H-4)，7.20(1H，s，H-5)，6.77(1H，s，H-8)，6.31(1H，d，J= 9.4 Hz，H-3)，3.81(3H，s，6-OCH3)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：160.7(C-2)，111.7(C-3)，144.5(C-4)，109.6(C-5)，145.3(C-6)，149.5(C-7)，102.8(C-8)，151.2(C-9)，110.6(C-10)，56.0(6-OCH3)。以上數據與文獻[21]報道對照基本一致，故鑒定化合物9為東莨菪素。

化合物10棕色粉末；C11H10O5，ESI-MS：m/z223.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.88(1H，d，J= 9.5 Hz，H-4)，6.75(1H，s，H-6)，6.35(1H，d，J= 9.5 Hz，H-3)，3.92(3H，s，8-OCH3)，3.91(3H，s，7-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：163.1(C-2)，115.3(C-3)，146.3(C-4)，101.0(C-5)，141.7(C-6)，151.7(C-7)，140.0(C-8)，139.8(C-9)，116.0(C-10)，56.6(7-OCH3)，61.4(8-OCH3)。以上數據與文獻[22]報道對照基本一致，故鑒定化合物10為6-羥基-7,8 -二甲氧基香豆素。

化合物11棕色粉末；C7H6N2，ESI-MS：m/z119.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.06(1H，d，J= 8.2 Hz，H-6)，7.93(1H，s，H-3)，7.42(1H，d，J= 8.2 Hz，H-7)，7.17(1H，m，H-4)，7.16(1H，m，H-5)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：132.7(C-3)，121.9(C-4)，121.8(C-5)，127.2(C-6)，112.5(C-7)，137.6(C-8)，121.3(C-9)。以上數據與文獻[23]報道對照基本一致，故鑒定化合物11為吲唑。

化合物12黃色粉末；C8H8O4，ESI-MS：m/z169.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.57(1H，overlapped，H-2)，7.57(1H，overlapped，H-6)，6.85(1H，d，J= 8.6 Hz，H-5)，3.91(3H，s，3-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：123.4(C-1)，114.1(C-2)，149.0(C-3)，153.0(C-4)，116.1(C-5)，125.6(C-6)，56.7(3-OCH3)，170.3(1-COOH)。以上數據與文獻[24]報道對照基本一致，故鑒定化合物12為香草酸。

化合物13白色粉末；C7H6O3，ESI-MS：m/z139.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.89(2H，d，J= 8.8 Hz，H-2，H-6)，6.84(2H，d，J= 8.8 Hz，H-3，H-5)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：122.7(C-1)，133.0(C-2，C-6)，116.0(C-3，C-5)，163.3(C-4)，170.1(1-COOH)。以上數據與文獻[25]報道對照基本一致，故鑒定化合物13為對羥基苯甲酸。

2.2 抗炎活性結果

化合物1～13的抗炎活性結果表明，僅化合物5能夠顯著抑制LPS誘導小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7產生NO，IC50值為18.09 ± 1.09 μM，略弱于陽性對照槲皮素(11.54±0.23 μM)。其他化合物未顯示明顯抗炎活性(見表1)。

表1 化合物1～13的對LPS誘導RAW 264.7細胞產生NO的半數抑制濃度(n = 3)

3 結論

本研究首次從羊角拗莖中分離鑒定13個化合物(1～4和6～13)，其中文獻報道五環三萜常春藤皂苷元(1)具有抗腫瘤、抗抑郁和抗菌等活性[26]，有待進一步研究。采用LPS誘導小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7模型的抗炎活性篩選結果表明，松脂素(5)具有顯著的抗炎活性，IC50值為18.09±1.09 μM。本研究豐富了羊角拗的化合物類型，也為其抗炎活性研究提供了依據。