瘤胃微生物對硝基化合物的代謝轉化與脫毒機制研究進展

張振威 楊紅建 王長法

(1.聊城大學毛驢高效繁育與生態飼養研究院，聊城 252000；2.中國農業大學動物科技學院，動物營養學國家重點實驗室，北京 100193)

據報道，全球范圍內反芻動物每年的甲烷排放量為100萬t左右，約占全球甲烷排放總量的20%，對全球氣候變暖具有很大威脅[1]。此外，反芻動物甲烷排放會造成飼料能量的浪費，降低飼料轉化效率[2]。近年來，體內和體外的試驗研究均發現不同種類的硝基化合物具有高效的甲烷抑制作用[3-7]，而且硝基化合物還能夠抑制沙門氏菌、大腸桿菌和幽門彎曲桿菌等多種病原菌[8]。

雖然硝基化合物能夠通過降低反芻動物甲烷排放和抑制病原菌而對畜牧業生產和環境保護具有重要意義，但是黃芪、冠花、木蘭屬等牧草植物由于含有硝基化合物而引起動物不同程度的中毒。Anderson等[9]綜述了含有3-硝基丙醇和3-硝基丙酸的牧草植物對家畜的毒性及其代謝的研究，發現硝基毒素能夠不可逆地抑制琥珀酸脫氫酶而阻礙動物機體的能量(ATP)合成。但是瘤胃微生物能夠代謝轉化這些硝基毒素而達到脫毒作用，這為硝基化合物在反芻動物甲烷減排方面的實踐應用提供了理論基礎。此外，目前關于化學工業合成的硝基化合物(包括硝基烷烴、硝氧基化合物、芳香族硝基化合物等)的代謝脫毒研究資料較少。本文主要介紹了硝基化合物的分類，并綜述了硝基化合物的毒性及其在動物機體的代謝脫毒機制研究進展。

1 硝基化合物

硝基化合物是指化學結構中含有硝基官能團的化合物，即烴分子中的氫原子被硝基官能團取代生成的衍生物[10]。硝基化合物的化學結構式為R-NO2，R為芳香烴或脂肪烴，硝基基團與碳原子以共價鍵結合，由于硝基基團為強吸電子基團，通常使其相連的α碳原子的氫原子解離為H+而具有酸性[8]。硝基化合物是極性化合物，一般為無色或淡黃色液體，微溶于水，可用作醫藥、染料、香料、炸藥等工業的化工原料及有機合成試劑[8]。

1.1 硝基烷烴

硝基烷烴是指烷烴的氫原子被硝基官能團取代后生成的化合物，一般不存在天然的生物合成的硝基烷烴，多為化學工業合成途徑制得[8]。硝基烷烴在工業生產中有多種用途：藥品和農藥的合成，油漆和涂料的交聯劑，鹵代烴的穩定劑以及電路板的清洗劑[8]。目前，較為常見的硝基烷烴多為短鏈硝基烷烴，如硝基甲烷、硝基乙烷、1-硝基丙烷和2-硝基丙烷等。

近年來，研究硝基乙烷具有較強的甲烷抑制作用，受到人們的關注。Anderson等[11]、Gutierrez-Bauelos等[12]、Bo?ic等[13]、Zhou等[14]以及Zhang等[15]研究發現，硝基乙烷的甲烷抑制效率高達90%以上(表1)。

表1 體外培養條件下硝基化合物對甲烷生成的影響Table 1 Effects of nitrocompounds on methane production under in vitro culture condition

1.2 硝基烷烴取代物

硝基烷烴取代物主要包括硝基醇和硝基酸類化合物，即直鏈或支鏈碳鏈烷烴主鏈上含有硝基和1個羥基或羧基官能團的化合物。目前研究較多的硝基烷烴取代物主要包括硝基乙醇、硝基丙醇以及硝基丙酸。

硝基乙醇，其化學結構式為HO-CH2-CH2-NO2，淺黃色液體，其密度為1.27 g/mL，熔點和沸點均不高。Anderson等[11]發現，在100% CO2培養條件下，硝基乙醇的體外甲烷抑制效率高達95%。此外，Zhang等[15]研究發現，硝基乙醇能夠通過抑制瘤胃產甲烷菌以及甲烷生成所需的輔酶而抑制甲烷的生成，抑制效率在90%以上。

硝基丙醇包括2-硝基丙醇和和3-硝基丙醇，其化學結構式如圖1所示，均為淡黃色液體，有輕微的刺鼻性氣味，密度為1.185 g/mL。2-硝基丙醇多為化學合成，而3-硝基丙醇存在于黃芪、冠花、木藍屬等植物中。硝基丙醇的甲烷抑制效率在60%～90%[10,14]。

圖1 2-硝基丙醇(A)和3-硝基丙醇(B)的結構式Fig.1 Structural formula of 2-nitropropanol (A) and 3-nitropropanol (B)

硝基丙酸，較多研究的是3-硝基丙酸，為白色結晶化合物，其化學結構式為HOOC-CH2-CH2-CH2-NO2，密度為1.673 g/mL，溶于水、乙醇、乙酸乙酯及其他部分有機溶劑。3-硝基丙酸也存在于發紅的甘蔗、黃芪屬和冠花屬等牧草植物中(表2)[9]。此外，3-硝基丙酸是曲霉屬和青霉屬的少數菌種產生的有毒代謝產物。天然的3-硝基丙酸和3-硝基丙醇在牧草植物中通常以單體、二或三體糖甙或糖酯類共軛化合物形式存在，但二者不能同時存在于同一種牧草植物中[9]。這些天然的3-硝基丙酸和3-硝基丙醇植物代謝物既能夠抑制瘤胃內產甲烷菌的活性，還可以抑制一些病原菌(如沙門氏菌、大腸桿菌和彎曲桿菌等)[8]。

表2 含有3-硝基丙酸的牧草及其位置Table 2 Forage source containing 3-nitropropionic acid and its position[9]

1.3 硝氧基化合物

目前關于硝氧基化合物研究較多的是3-硝基酯-1-丙醇(3-NOP)。3-硝基酯-1-丙醇是無色液體，呈現弱堿性，密度為1.19 g/mL，是一種甲基輔酶M類似物[1]。在瘤胃發酵生成甲烷的過程中需要多種酶的參與，其中甲基輔酶M是甲烷生成的重要輔酶，而3-硝基酯-1-丙醇作為甲基輔酶M類似物，能夠替代甲基輔酶M結合輔酶B，從而減少甲基輔酶M還原生成的甲烷[16]。Soliva等[17]通過體外連續培養試驗對比研究了3-硝基酯-1-丙醇和溴乙烷磺酸對瘤胃發酵甲烷生成的影響，結果發現3-硝基酯-1-丙醇同溴乙烷磺酸一樣，能夠通過抑制甲基輔酶M而顯著降低甲烷生成。Martínez-Fernández等[18]在綿羊飼糧中添加100 mg/d的3-硝基酯-1-丙醇，顯著降低了綿羊瘤胃發酵甲烷的生成量(高達23.7%)。Reynolds等[19]研究發現，通過瘤胃瘺管直接向瘤胃內投喂500或2 500 mg/d的3-硝基酯-1-丙醇使泌乳奶牛的甲烷產量分別降低了6.6%和9.8%。而Haisan等[20]在泌乳奶牛飼糧中添加2 500 mg/d的3-硝基酯-1-丙醇，能夠通過降低瘤胃內甲烷菌的數量(2.69×108個/mL減少為0.95×108個/mL)而使泌乳奶牛的甲烷產量從17.8 g/kg DMI降至7.18 g/kg DMI。Hristov等[21]在荷斯坦奶牛飼糧中添加40～80 mg/kg DM 3-硝基酯-1-丙醇，通過12周的飼養試驗發現荷斯坦奶牛的甲烷排放量減少了40%。對于肉牛，Romero-Perez等[22]指出，安格斯肉牛的甲烷排放量隨飼糧3-硝基酯-1-丙醇添加水平的提高而呈線性下降。此外，Vyas等[5]對比研究了莫能菌素和3-硝基酯-1-丙醇對雜交閹牛甲烷排放的影響，結果發現，3-硝基酯-1-丙醇顯著降低了肉牛甲烷排放量(高達40%)，且提高了肉牛的飼料轉化效率。

此外，關于3-硝基酯-1-丙醇的衍生物3-硝基乙酯丙酸和2,2-二甲基-3-(硝氧基)丙酸的作用也有研究，這些硝氧基衍生物均具有降低瘤胃發酵甲烷生成的作用[16]。

1.4 芳香族硝基化合物

芳香族硝基化合物是指硝基基團直接與芳香環相連的化合物，其結構式為Ar-NO2，Ar為芳香烴。芳香族硝基化合物為無色或淡黃色高沸點液體或低熔點固體，不溶于水，有劇毒。芳香族硝基化合物常作為生產炸藥和油漆的原料。其生物活性包括抗菌、對動物機體和細胞有毒性。此外，Jin等[23]通過體外發酵試驗發現，芳香族硝基化合物的衍生物N-[2-(硝氧基)乙基]-3-吡啶甲酰胺(330.0 μmol/L)能夠抑制瘤胃發酵甲烷的生成，抑制率達90.4%。

2 硝基化合物的毒性及其代謝脫毒

2.1 硝基化合物的毒性

在20世紀早期，Marsh等[24]首次發現植物中含有硝基毒素。Stermitz等[25]在長葉黃芪中首次分離鑒定出含有3-硝基丙醇的糖甙化合物和含有3-硝基丙酸的葡萄糖酯類，這些糖甙類和糖酯類化合物被認為是硝基毒素。緊接著，大量的黃芪和冠花類牧草植物中也相繼被發現含有3-硝基丙醇或3-硝基丙酸的糖甙和糖酯類硝基毒素。含有3-硝基丙醇的糖甙化合物通常被稱為米瑟毒甙(miserotoxin)，而含有3-硝基丙酸糖酯類結合物被稱為狗角藤毒甙(karakin)。屬牧草植物木本黃芪(Astragalusmiservar.serotinus)中的硝基毒素多為米瑟毒甙，其含量為植物干物質含量的2%～6%，1頭500 kg的牛需采食3～9 kg的新鮮黃芪屬牧草植物才會引起中毒[26]。與3-硝基丙醇相比，3-硝基丙酸的毒性更強，但由于大部分含有3-硝基丙醇的牧草植物中硝基毒素含量較高，一般為3-硝基丙酸牧草植物的2倍，因此含有3-硝基丙醇的牧草植物與含有3-硝基丙酸的牧草植物的硝基毒性相當[9]。此外，牧草植物的硝基毒素含量受到日照時間、環境濕度、溫度以及生長季節的影響[9]。

研究表明，硝基毒素會引起不同動物(雞、鼠、豬、兔等)機體的中毒[27](表3)。此外，給牛、羊直接靜脈注射3-硝基丙醇，其半數致死量(LD50)分別為30和52 mg/kg BW[24](表3)，而給牛、羊經口灌服3-硝基丙醇時，其半數致死量分別增加至57和118 mg/kg BW[28](表3)。此外，與糖疳和糖酯類的米瑟毒甙或狗角藤毒甙相比，3-硝基丙醇的直接毒性更強，其對大鼠的半數致死量分別為2 500和77 mg/kg BW[29]。而且急性、高劑量的硝基毒性可能會引起大量的亞硝酸鹽產生，進而引起高鐵血紅蛋白癥。但是截至目前，3-硝基丙醇和3-硝基丙酸的中毒機制尚不完全明確，研究發現其對生物體內一些重要的酶系統如琥珀酸脫氫酶、過氧化氫酶、谷氨酸脫羧酶、單胺氧化酶等均有不同程度的抑制和失活，進而阻礙了三羧酸循環的進行，最終導致動物組織器官的損害[9]。

表3 部分硝基化合物的半數致死量Table 3 LD50 of some nitrocompounds

其他烷烴類硝基化合物(如硝基乙烷)及其衍生物(如硝基乙醇、硝基丙醇、硝基丙酸)和硝氧基化合物(如3-硝基酯-1-丙醇)多為化學工業合成的產物，近年來被認為具有高效的甲烷抑制作用[15, 21, 30]。這些硝基化合物一般對瘤胃產甲烷菌具有顯著的抑制作用，對于其他瘤胃微生物的毒性作用較小(表2)。Anderson等[31]通過飼養試驗發現，飼糧添加72和120 mg/kg BW的硝基乙烷和2-硝基丙醇只顯著降低了綿羊的瘤胃產甲烷活性，而對瘤胃VFA沒有顯著影響，這說明硝基乙烷和2-硝基丙醇對瘤胃微生物的發酵沒有明顯的毒性作用。Zhang等[7]對比研究了飼糧添加硝基乙醇和莫能菌素對育肥羔羊生長性能和產甲烷活性的影響，結果發現硝基乙醇更能夠通過降低瘤胃發酵甲烷的生成而提高育肥羔羊的飼料轉化效率。Vyas等[5]通過莫能菌素和3-硝基酯-1-丙醇的對比飼養試驗發現，3-硝基酯-1-丙醇能夠顯著降低雜交閹牛的甲烷排放(40%)而提高肉牛的飼料轉化效率。此外，這2個體內研究均未報道動物機體的中毒癥狀，這說明硝基乙醇和3-硝基酯-1-丙醇的硝基毒性對于反芻動物的生長性能可能沒有負面作用。

芳香族硝基化合物的硝基基團能夠被細菌或動物機體內的酶類(NADPH:細胞色素P450還原酶、NADP+鐵氧還原蛋白還原酶等)還原，而引起細菌、細胞和動物機體的氧化應激[8]。

2.2 硝基化合物的代謝轉化與脫毒

研究表明，給反芻動物靜脈注射或經口灌服3-硝基丙醇時，硝基毒素的致死量不同：靜脈注射時，3-硝基丙醇對牛、羊的致死量分別為30和52 mg/kg BW[26]；經口灌服時，3-硝基丙醇對牛、羊的致死量則分別顯著增加到57和118 mg/kg BW[28]，這表明瘤胃微生物確實具有代謝硝基化合物的能力，硝基毒素能夠被硝基代謝細菌所降解利用而達到脫毒作用。Majak等[32]通過嚴格厭氧技術，在瘤胃液中分離鑒定出10種能夠代謝硝基化合物的微生物：棲瘤胃擬桿菌(Bacteriodesruminicola)、脫硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)、埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)、反芻月形單胞菌(Selenomonasruminantium)、產堿韋榮菌(Veillonellaalcalescens)、梭菌屬(Clostridium)、糞球菌屬(Coprococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、枝桿菌屬(Ramibacterium)和消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)。此外，這些硝基毒素代謝微生物也被發現具有代謝亞硝酸鹽的能力。

2.2.1 硝基丙醇和硝基丙酸的代謝脫毒

關于硝基毒素代謝的研究最先起于牧草植物中的天然硝基化合物，即含有3-硝基丙醇的米瑟毒甙和含有3-硝基丙酸的狗角藤毒甙等(圖2)。由于反芻動物瘤胃內棲息著大量微生物，具有降解代謝硝基毒素的作用。瘤胃微生物通過分泌β-葡萄糖苷酶和酯酶將米瑟毒甙、狗角藤毒甙等水解釋放出3-硝基丙醇和3-硝基丙酸。其中，一小部分3-硝基丙醇和3-硝基丙酸被瘤胃上皮吸收進入血液循環，而大部分3-硝基丙醇和3-硝基丙酸被瘤胃微生物代謝生成3-氨基丙醇和β-丙氨酸。然后，β-丙氨酸能夠被瘤胃微生物進一步代謝利用，而3-氨基丙醇在瘤胃內的進一步代謝目前還沒有明確結論[9]。此外，Majak等[32]指出，瘤胃微生物在降解代謝3-硝基丙醇和3-硝基丙酸的脫毒過程中會伴隨有亞硝酸鹽的生成，而亞硝酸鹽作為中間代謝產物進一步被瘤胃微生物代謝還原生成氨而被利用。Zhang等[33]的體外批次發酵試驗也同樣證明，硝基乙烷、硝基乙醇和2-硝基丙醇在體外瘤胃微生物的代謝過程中確實存在亞硝酸鹽的生成。瘤胃微生物對硝基毒素和亞硝酸鹽的代謝速率排序為：3-硝基丙酸>3-硝基丙醇>亞硝酸鹽，而且瘤胃微生物對硝基毒素的代謝脫毒需要嚴格的厭氧環境[30]。

圖2 牧草植物在反芻動物瘤胃內的硝基毒素代謝Fig.2 Metabolism of nitrotoxin form forage in ruminants[9]

截止目前，脫毒脫氮桿菌(Denitrobacteriumdetoxificans)是唯一鑒定分離的具有專性代謝硝基化合物的瘤胃細菌[34]。正常情況下，反芻動物瘤胃內含有Denitrobacteriumdetoxificans約103個/mL，添加硝基化合物能夠顯著促進瘤胃內Denitrobacteriumdetoxificans的富集增長。Anderson等[34]在嚴格厭氧條件下純培養了Denitrobacteriumdetoxificans，并在培養液中添加3-硝基丙酸和3-硝基丙醇，培養結束后通過液相高效色譜法測定到3-硝基丙酸和3-硝基丙醇的代謝產物——β-丙氨酸和3-氨基-丙醇，以及少量的亞硝酸鹽。Ochoa-García等[6]在最近的研究中同樣發現，3-硝基丙酸在體外瘤胃培養液的代謝產物是β-丙氨酸。

對于非反芻動物，3-硝基丙酸能夠被前段消化道分泌的酯酶水解代謝，由于3-硝基丙酸在前段消化道的快速吸收，進而阻斷了3-硝基丙酸在后段消化道微生物的代謝分解[9]。此外，非反芻動物體內缺少水解米瑟毒甙、狗角藤毒甙的β-葡萄糖苷酶和酯酶，這導致了牧草植物的米瑟毒甙和狗角藤毒甙對非反芻動物的毒性比3-硝基丙酸的毒性較弱[9]。但是，3-硝基丙醇和2-硝基丙醇除瘤胃微生物代謝途徑外，還存在乙醇脫氫酶途徑將硝基丙醇和硝基乙醇代謝生成丙烯醛和亞硝酸鹽，丙烯醛是一種與蛋白質或其他單分子共價結合的不穩定親電體[8]。

2.2.2 硝基烷烴的代謝脫毒

目前，硝基烷烴的代謝脫毒機制研究資料較少。但是Gutierrez-Bauelos等[12]通過體外發酵試驗發現，添加硝基乙烷能夠顯著增加Denitrobacteriumdetoxificans的數量(高達1 000倍)，說明Denitrobacteriumdetoxificans可能具有降解代謝硝基乙烷的作用。在反芻動物體內，硝基乙烷的代謝脫毒可能與硝基丙醇和硝基丙酸的代謝脫毒過程一樣，硝基乙烷被瘤胃微生物主要代謝生成乙胺(ethylamine)以及少量亞硝酸鹽[34]，但是目前還沒有關于瘤胃微生物對硝基乙烷降解代謝產物的鑒定檢測。Machle等[35]給兔靜脈注射或經口灌服硝基乙烷，結果只檢測到17%～19%的硝基乙烷回收率，這說明硝基乙烷能夠被動物機體代謝。Scott[36-37]研究發現，硝基乙烷能夠在血液中生成乙醛和亞硝酸鹽，但是亞硝酸鹽的生成量很少，并能迅速氧化生成硝酸鹽。乙醛則被乙醛脫氫酶水解生成乙酸進入三羧酸循環(圖3)。

圖3 硝基乙烷在兔體內的代謝Fig.3 Metabolism of nitroethane in rabbits[8]

2.2.3 其他硝基化合物的代謝脫毒

芳香族硝基化合物的代謝是由NAD(P)H：硝基還原酶系統完成，芳香族硝基化合物通過生成中間體亞硝基化合物而進一步代謝生成羥胺化合物[38]。目前尚未有芳香族硝基化合物在反芻動物瘤胃內的代謝研究。此外，硝氧基化合物，主要是3-硝基酯-1-丙醇的動物飼養試驗表明，3-硝基酯-1-丙醇能夠抑制瘤胃產甲烷菌的活性，進而減少反芻動物的甲烷排放，但是3-硝基酯-1-丙醇對瘤胃總細菌和總原蟲數量沒有顯著影響[20]。此外，Martínez-Fernández等[18]和Romero-Perez等[22]報道，3-硝基酯-1-丙醇對綿羊和肉牛的瘤胃微生物區系也沒有顯著影響。這些體內研究發現，3-硝基酯-1-丙醇主要作為甲基輔酶M的替代物而對瘤胃產甲烷菌具有專性抑制作用，但是對其他瘤胃微生物以及動物健康都沒有不利影響，這間接說明3-硝基酯-1-丙醇的硝基毒性較低，可能能夠被瘤胃微生物降解代謝。但是目前關于3-硝基酯-1-丙醇的代謝研究資料確實較少，將來應該給予更多關注。

綜上所述，反芻動物瘤胃微生物對硝基化合物的代謝脫毒機制可能是：棲息在瘤胃內的Denitrobacteriumdetoxificans等細菌，通過氧化H2、甲酸或少量乳酸獲得能量以供自身生長，同時將作為電子受體的硝基化合物還原為各自的胺類(如3-硝基丙酸→β-丙氨酸、3-硝基丙醇→3-氨基丙醇、2-硝基丙醇→2-氨基丙醇和硝基乙醇→氨基乙醇)以及少量亞硝酸鹽，這些胺類和亞硝酸鹽進一步被瘤胃微生物降解利用而達到脫毒效果。

3 小 結

綜上所述，硝基化合物可以具體劃分為硝基烷烴、硝基烷烴衍生物(硝基醇、硝基酸)、硝氧基化合物以及芳香族硝基化合物。無論是牧草植物含有的天然硝基化合物還是化學工業合成的硝基化合物，均能夠高效抑制瘤胃發酵甲烷的生成，但硝基化合物含有的硝基毒素同時會引起動物機體不同程度的中毒。而瘤胃微生物具有代謝轉化硝基毒素的能力，能夠降解硝基化合物生成各自的胺類物質及少量亞硝酸鹽，這些代謝產物能夠被反芻動物瘤胃微生物進一步代謝利用而達到脫毒作用。但目前相關反芻動物瘤胃微生物對于硝基化合物代謝轉化過程及其最終代謝產物的研究資料較少，需要研究學者做進一步的深入研究。