堿性蛋白酶酶解芝麻粕制備蛋白肽的工藝優化

邵家威 ，汪慧慧，李慶騰，張桂香張炳文*，王明輝

1. 濟南大學食品科學與營養系（濟南 250000）；2. 山東百脈泉酒業股份有限公司，食品發酵工程研究中心（濟南 250200）

芝麻（Sesamum indicumLinn.），又稱油麻、脂麻，是人類生產食用最早的胡麻科油料作物[1-2]。研究發現，芝麻中蛋白質和脂肪含量高達21.9%和61.7%，同時因其蘊含豐富的Fe、Ca等礦物質，有“全能營養庫”“八谷之冠”之美譽[3-4]。芝麻餅粕是芝麻經過榨油之后得到的副產物，含有大量的蛋白質[5-6]。低溫加工制油會極大保留芝麻油中的生物活性成分，可使芝麻粕中蛋白質資源不被破壞，增加產業鏈高值化利用[7]。生物活性肽是具有多種生物學功能的多肽，在人體中發揮重要的生理調節作用，例如與礦物質結合、參與體內免疫調節、抑菌、抗氧化、溶解血栓、降低膽固醇和降血壓作用[8-9]。該試驗研究了堿性蛋白酶酶解亞臨界芝麻粕對芝麻蛋白肽制備得率的影響，并通過響應面法對其參數進行模型優化，以期為芝麻粕的深加工研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞臨界芝麻粕（SSM、粗蛋白含量為37.22%，河南省亞臨界生物技術有限公司）。

無水乙醇、HCl、H2SO4、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、亞甲基藍、氫氧化鈉、三氯乙酸、硫酸銅（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；Gly-Gly-Tyr-Arg標準品（Sigma公司）；堿性蛋白酶（上海源葉生物有限公司）。

1.2 儀器與設備

WZJ-6J振動式藥物超微粉碎機（濟南倍力粉技術工程有限公司）；PHS-3B pH酸度計（賽多普利斯科學儀器有限公司）；702A紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；GZX-9240MBE電熱鼓風干燥箱（上海博涵實業有限公司設備廠）；TGL-16M冷凍醫用離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（上?；ゼ褍x器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

將SSM于50 ℃烘干至恒重，粉碎至0.425 mm，置于自封袋中保存備用。

1.3.2 繪制Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準曲線

參考魯偉等[10]的方法，采用雙縮脲法測定多肽含量。分別精確配制0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6和1.8 mg/mL四肽標準溶液（5% TCA定容）。分別取6 mL標準溶液，然后加入4 mL雙縮脲試劑，渦旋混勻靜置10 min，在2 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液于540 nm測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標、多肽含量（mg/mL）為橫坐標，得回歸方程：y=0.140 2x-0.003 2，R2=0.995 4。

1.3.3 肽得率測定

將2.5 mL樣品溶液與2.5 mL 10% TCA溶液充分混勻，靜置10 min后在4 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min。然后將上清液移入25 mL容量瓶中，用5% TCA定容，搖勻后備用。取6 mL上述溶液于試管中，然后按照1.3.2小節測定吸光度，將其代入標準曲線，按式（1）計算肽得率。

式中：Y為肽得率，%；C為樣品溶液的質量，mg；M為樣品干質量，mg；V1為反應體積，mL；V2為樣品體積，mL；V3為定容體積，mL；V4為取樣體積，mL。

1.3.4 堿性蛋白酶酶解制備芝麻蛋白肽

稱取烘干恒重后的芝麻粕，加入適量水配制成2%（以粗蛋白計）的SSM漿液，pH調至10，加入10 000 U/g底物的堿性蛋白酶，于50 ℃反應1 h。然后置于沸水浴10 min，在8 000 r/min、4 ℃條件下離心30 min，取上清液測定肽得率。

1.3.5 不同因素對堿性蛋白酶酶解制備芝麻蛋白肽的影響

1) SSM粒度對肽得率的影響。選取原粉以及0.425，0.180和0.075 mm粒徑的SSM粉，在底物濃度2%、pH 10、加酶量10 000 U/g底物、溫度50 ℃、酶解時間1 h的條件下，研究粒度對肽得率的影響。

2) 底物濃度對肽得率的影響。選取底物濃度1%，2%，3%，4%，5%和6%，在0.425 mm SSM粉、pH 10、加酶量10 000 U/g底物、溫度50 ℃、酶解時間1 h的條件下，研究底物濃度對肽得率的影響。

3) 溫度對肽得率的影響。選取溫度30，40，50，60和70 ℃，在0.425 mm SSM粉、底物濃度2%、pH 10、加酶量10 000 U/g底物、酶解時間1 h的條件下，研究溫度對肽得率的影響。

4) 加酶量對肽得率的影響。選取加酶量4 000，6 000，8 000，10 000，12 000和14 000 U/g底物，在0.425 mm SSM粉、底物濃度2%、溫度50 ℃、pH 10、酶解時間1 h的條件下，研究加酶量對肽得率的影響。

5) pH對肽得率的影響。選取pH 9.0，9.5，10.0，10.5，11.0和11.5，在0.425 mm SSM粉、底物濃度2%、溫度50 ℃、加酶量10 000 U/g底物、酶解時間1 h的條件下，研究pH對肽得率的影響。

6) 酶解時間對肽得率的影響。選取酶解時間0.5，1，1.5，2和2.5 h，在0.425 mm SSM粉、底物濃度2%、溫度50 ℃、加酶量10 000 U/g底物、pH 11.0的條件下，研究酶解時間對肽得率的影響。

1.3.6 模型優化工藝設計

在單因素試驗的基礎上，選取溫度、加酶量、pH、酶解時間為考察因素，以芝麻多肽得率為響應值進行Box-Behnken的中心組合設計，見表1。通過Design Expert軟件進行數據分析和試驗設計，優化堿性蛋白酶酶解SSM制備芝麻蛋白肽的工藝條件。

表1 Box-Behnken的中心組合因素水平

2 結果與討論

2.1 不同因素對堿性蛋白酶酶解制備SSM多肽的結果分析

2.1.1 SSM粒度對肽得率的影響

如圖1所示，隨著SSM粒度的不斷增大，SSM多肽得率變化較為不顯著。當SSM未進行粉碎時，多肽得率為8.53%±0.07%；利用0.425 mm SSM粉進行制備多肽時的得率為8.93%±0.12%，增加了0.4個百分點。當利用0.075 mm SSM粉時，多肽得率為9.46%± 0.16%，比利用0.425 mm和0.180 mm SSM粉分別增加了0.53和0.39個百分點。由此看出，SSM粒度對多肽得率影響較??；這是因為物料粒度越小，與溶劑間的接觸面積就越大，其中的蛋白質溶出速度可能會增加，但蛋白質中的酶切位點是一定的，不會隨粒度變化而增加或減少。因此，SSM粒度對多肽得率影響不大，但全面考慮試驗過程，采用0.425 mm SSM粉進行后續試驗。

圖1 SSM粒度對肽得率的影響

2.1.2 底物濃度對肽得率的影響

如圖2所示，隨著底物濃度的增大，SSM多肽的得率呈現下降趨勢。當底物濃度為2%時，多肽得率為9.07%±0.30%，較底物濃度為1%時的多肽降低了0.2個百分點；較底物濃度為3%時的多肽得率高1.17個百分點；當底物濃度為6%時，多肽得率最低，為6.33%±0.02%。這可能是因為，在底物濃度增加后，原料中一些植酸類物質會加劇對蛋白酶的抑制作用。出于節省成本的目的，后續試驗中采用的底物濃度條件為2%。

圖2 底物濃度對肽得率的影響

2.1.3 溫度對肽得率的影響

如圖3所示，隨著溫度的不斷提高，SSM多肽得率呈現先升高后下降的趨勢。酶解反應溫度從30 ℃升高至50 ℃區間內，多肽得率急劇升高，在溫度為50 ℃時達到最高值9.09%±0.03%，較溫度為30 ℃時增加3.39個百分點。在酶解反應溫度達到60 ℃時，多肽得率達到8.43%±0.18%，下降了0.66個百分點；當反應溫度為70 ℃時，多肽得率最低。堿性蛋白酶作為一種酶制劑來說，在酶解反應時都會有一個最適溫度，在此試驗中可明顯看出反應溫度50 ℃是該蛋白酶的最適溫度。因此確定反應溫度50 ℃，為堿性蛋白酶酶解SSM制備多肽的最佳工藝條件。

圖3 酶解溫度對肽得率的影響

2.1.4 加酶量對肽得率的影響

如圖4所示，蛋白酶添加量對多肽得率的影響較大，呈現先上升后下降的趨勢。加酶量為10 000 U/g底物時，得率達到峰值9.03%±0.03%。加酶量為4 000～ 10 000 U/g底物時，隨著蛋白酶的增加，多肽得率逐漸升高。加酶量大于10 000 U/g底物以后，多肽得率反而急劇下降，可能是在相同單位時間的情況下，隨著蛋白酶添加量增大，底物減少導致多肽被進一步酶解成為氨基酸，導致多肽得率減少[11]。因此，選擇蛋白酶添加量10 000 U/g底物，進行下一步試驗優化。

圖4 蛋白酶添加量對肽得率的影響

2.1.5 pH對肽得率的影響

如圖5所示，pH對多肽得率的影響較為顯著。當pH從9.0增大至11.0時，多肽得率不斷上升，并達到最大值10.04%±0.07%；當pH大于11.0時，多肽得率略有下降；因此體系pH 11.0是該反應的最適pH。所以選取pH 11.0為下一步優化試驗的酶解pH。

圖5 pH對肽得率的影響

2.1.6 酶解時間對肽得率的影響

如圖6所示，酶解反應時間對多肽得率的影響較大，呈現先上升再下降的趨勢。反應時間為2 h（120 min）時，得率達到峰值12.18%±0.18%。反應時間為0.5～2 h時，隨著酶解反應時間的增加，多肽得率逐漸升高。反應時間大于2 h以后，多肽得率下降，可能是因為隨著酶解反應的進行，底物逐漸減少，產物不斷積累對蛋白酶產生抑制作用。因此，堿性蛋白酶酶解制備芝麻蛋白肽的反應時間的最佳條件是2 h（120 min）。

圖6 反應時間對肽得率的影響

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 響應面結果分析

試驗研究加酶量、溫度、pH、酶解時間4個單一因素對堿性蛋白酶酶解SSM制備芝麻蛋白肽得率的影響，通過Box-Behnken試驗設計出29個試驗，5個中心點重復試驗用來預測試驗的誤差，試驗設計與結果見表2。

表2 響應面分析設計及結果

2.2.2 二次回歸模型擬合及方差分析

通過設計分析試驗，得到各個因素之間相互作用的響應面圖。各個因素經過回歸擬合，得到加酶量、溫度、pH、酶解時間對堿性蛋白酶酶解SSM制備芝麻蛋白肽得率的二次多項回歸方程：Y=12.34-0.39A-0.47B+0.18C+0.075D-0.030AB+0.27AC+0.077AD-0.22BC+0.13BD-0.095CD-1.35A2-1.18B2-0.99C2-0.75D2。

對表2數據進行回歸分析，結果見表3。由表3得出，模型p＜0.000 1，表明該模型顯著，失擬項p= 0.091 8＞0.05，說明失擬項不顯著。模型確定系數R2較高（R2=0.910 1），則說明這個回歸方程的近似模擬性比較好，能夠較為真實地反映實際情況，實測值和預測值的擬合度比較好。綜上所述，此模型可用于堿性蛋白酶酶解SSM制備芝麻蛋白肽的條件的分析和預測。由表3方差分析結果得出，模型中的二次項A2、B2、C2對試驗結果的影響極其顯著（p＜0.000 1），即表示蛋白酶添加量、pH和溫度三因素的二次項對多肽得率具有較為顯著的影響。

表3 回歸方程系數及顯著性檢測

2.2.3 響應面交互作用分析

通過響應面垂直曲面的陡峭程度可以直觀反映因素之間交互作用對堿性蛋白酶酶解制備SSM多肽得率的影響，等高線的等高差額可以反映各因素之間交互作用的強弱。根據圖7分析，根據陡峭程度，程度從高到低為pH＞加酶量＞溫度＞酶解時間，因此各因素對SSM多肽得率影響順序為pH＞加酶量＞溫度＞酶解時間。以上分析皆同試驗模型方差分析結論相吻合。

圖7 各因素兩兩交互影響響應曲面

2.2.4 堿性蛋白酶酶解制備SSM多肽的工藝條件確定與驗證

為進一步改進SSM多肽的酶解制備最佳試驗條件，利用Design Expert軟件設計結果SSM多肽制備的最優試驗參數：pH 10.9、蛋白酶添加量9 700 U/g底物、溫度51 ℃、反應時間2 h。因此確定堿性蛋白酶酶解制備SSM多肽的最佳工藝：SSM粒度0.425 mm、底物濃度2%、pH 10.9、蛋白酶添加量9 700 U/g底物、溫度51 ℃、反應時間2 h。

為了進一步檢測響應面法得到的結果是否科學，在試驗確定的最優參數下，進行平行試驗。結果顯示，SSM多肽的得率是12.38%±0.13%，與12.34%這一理論值接近，說明利用響應面得到的模型能很好地體現出堿性蛋白酶酶解制備SSM多肽的工藝條件。

3 結論

以亞臨界芝麻粕（SSM）為原料，以多肽得率為指標，通過探究相關因素對堿性蛋白酶酶解SSM的影響，并通過響應面法優化提取條件，得出最佳制備工藝條件：SSM粒度0.425 mm、底物濃度2%、pH 10.9、蛋白酶添加量9 700 U/g底物、溫度51 ℃、反應時間2 h，在此條件下得率為12.38%±0.13%。研究結果表明，芝麻粕中豐富的蛋白資源具有較好的開發價值，為進一步研究芝麻蛋白肽提供了理論基礎。