聚苯乙烯微塑料與銅離子單一和復合污染對THP-1細胞的DNA損傷效應研究

尹 艷，王海燕*，韓大雄，林 彩，林錫煌，單 柏

(1.自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門 361005； 2.廈門大學藥學院，福建 廈門 361102)

塑料制品由于它的便捷和經濟性而被廣泛使用，然而塑料在自然環境中的降解十分緩慢，在外力、風化、細菌、生物分解等作用下，大塊的塑料被破碎成更小的碎片，學界將5 mm以下的塑料定義為微塑料[1-2]。研究人員在西北太平洋表層海水、北極深海沉積物中發現數量可觀的微塑料[3-4]。重金屬是環境中常見的持久性污染物，工業活動中的礦產冶煉、電子加工、電鍍等產生的廢氣廢水中包含大量的重金屬離子。若處理不當，排入海洋環境中的重金屬對生物的危害巨大，并且某些重金屬可以在生物體內蓄積，在食物鏈中不斷積聚，其毒性被放大，最終對人類健康造成巨大威脅。研究發現，高銅環境下細胞更容易轉變為腫瘤細胞，血銅濃度越高，死于癌癥的風險越高[5]。Wang等(2020)也證實了相較于Cd2+和Hg2+，Cu2+的毒性更大[6]。真實環境中對生物體造成危害不可能是單一污染，而是復合污染，而且復合污染的危害性可能更大。研究發現微塑料在環境中可以充當載體吸附其他污染物，從而加重其他污染物的毒性[7-8]。如今對微塑料的研究多數停留在調查研究的層面，對其生物毒性方面的研究還處于探索階段。而對微塑料的生物毒性研究重點放在檢測微塑料的體內積累[9]、對基因表達的影響[10]、載體作用[8]等，無法量化反映生物體實際承受的傷害。由于傳統的環境污染評估的滯后性無法檢測早期的生物毒性，相對而言“生物標志物”技術的應用可以在污染物產生危害的早期就可以檢測其毒性，DNA損傷作為檢測基因毒性參數的一種手段，已經被廣泛應用于環境污染物的早期預警，而目前對微塑料和重金屬及其復合污染下細胞承受的DNA損傷效應的研究較少。因此利用該手段檢測微塑料及其復合毒性效應是非常有必要的。

單細胞凝膠電泳(Single Cell Gel Eletrophoresis，SCGE)，又稱彗星實驗(Comet Assay)，是檢測細胞DNA損傷的一種成熟技術。由于它具有快速、靈敏、經濟等優點，自1984年方法建立以來，被廣泛地應用于檢測生物體的基因毒性[11-14]。人單核細胞白血病(Human Acute Monocytic Leukemia, THP-1)細胞由于其易在實驗室中培養和擴增，且具有較穩定的基因背景，不存在外周血單核細胞的個體差異性問題，利于實驗結果的重現[15]，因此，THP-1細胞是各大實驗室常用的細胞系，Wang等也證實THP-1細胞對污染物具有較高的敏感性[6]。本研究采用優化后的單細胞凝膠電泳實驗方法，探究Cu2+、聚苯乙烯微塑料(Polystyrene， PS)以及兩者復合污染條件下對THP-1細胞的DNA損傷效應，為海洋環境的污染監測與評價提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

THP-1細胞由廈門生命互聯科技有限公司提供。THP-1細胞用含體積分數為10%的胎牛血清(FBS)、1%雙抗(Penicillin-Streptomycin)的RPMI-1640培養基，在37 ℃，體積分數為5%的二氧化碳培養箱中培養，每隔1～2 d傳代1次，用0.4%臺盼藍染色檢測細胞存活率。采用存活率在95%以上的對數生長期的細胞用于實驗。

1.2 實驗材料

低熔點瓊脂糖凝膠(Low Melting Point Agarose Gel， LMA)購于麥克林生化科技有限公司；10×PBS、RPMI-1640培養基、胎牛血清和雙抗購于HyClone公司；無水乙醇購于廣東光華科技股份有限公司；溴化乙錠(EB)購于Sigma公司；Na2EDTA、NaOH、Triton X-100、DMSO、NaCl、Tris-base、50×TAE、CuCl2均為國產分析純；H2O2溶液購于廈門萊奧生物科技有限公司；PS購于天津大鵝公司。

1.3 細胞染毒

Cu2+和PS用超純水配置成一定濃度的儲備液。Cu2+濃度設置參照《生活飲用水衛生標準》[16]和《地下水質量標準》[17]，本研究濃度選擇涵蓋了上述標準中涉及的濃度范圍，與實際環境濃度相近。PS濃度設置參考Espinosa 等(2019)的研究[18]。收集長勢較好的細胞(一般為對數生長期)，以1 000 r/min轉速離心5 min，棄上清，用PBS重懸兩遍。用PBS調節細胞濃度至5×105～8×105個/mL[19]。取180 μL細胞懸液，實驗組分別加20 μL污染物儲備液，使Cu2+終濃度為10、50、100、500、1 000、2 500、5 000 μg/L，PS(0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0 μm)終濃度為1、10、15、20、25 mg/mL。復合污染則各取10 μL的Cu2+儲備液和一定體積的PS儲備液(2.0 μm)，復合實驗分為兩組，一組固定Cu2+濃度為500 μg/L，改變PS濃度分別為1、10、15、20、25 mg/mL ，第二組固定PS濃度為25 mg/mL，改變Cu2+濃度分別為10、50、100、500、1 000、2 500、5 000 μg/L；實驗同時設一個空白對照組(加入20 μL PBS)、一個溶劑對照組(加入20 μL超純水)、一個陽性對照組(加入20 μL H2O2，終濃度為20 mmol/L)，所有對照組Cu2+濃度均為0 μg/L，PS濃度均為0 mg/mL。然后將污染物與細胞混勻，于恒溫培養箱中孵育1 h。每個實驗組以及溶劑、空白、陽性對照組均設置3個平行。孵育完成后離心去上清，加入PBS清洗1遍，清洗完畢用200 μL PBS重懸細胞用于后續彗星實驗。

1.4 單細胞凝膠電泳實驗

取24孔板的板蓋，剪去一組對邊，置于無水乙醇中24 h以上備用，臨用前冷風吹干。將上述細胞懸液與37 ℃的低熔點瓊脂糖凝膠按一定比例混勻(體積比為1∶3)。取70 μL混合液均勻鋪在24孔板板蓋的樣品孔中，置于4 ℃下冷卻5～10 min，使瓊脂糖凝膠完全固化。將膠板置于配好的細胞裂解液(2.5 mol/L NaCl，100 mmol/L Na2EDTA，10 mmol/L Tris-base，pH 為10，體積分數為1%的Triton X-100，體積分數為10% DMSO)中，于4 ℃避光裂解1 h。小心地將膠板從裂解液中取出，用超純水浸洗兩遍，緩慢地放入解旋液(1 mmol/L Na2EDTA，300 mmol/L NaOH，pH大于13)中，4 ℃解旋30 min。解旋完畢，電泳槽中加入1×TAE緩沖液(pH 為7.5)，在20 V、30～40 mA條件下電泳15 min。電泳完畢，取出膠板，放入超純水中中和10 min，重復3次。中和完畢，用濾紙吸去表面水分，置于預冷的無水乙醇中，于-20 ℃脫水2次，每次1 h。脫水完畢后置于陰涼干燥處，使其自然晾干。膠板上每個孔加入100 μL EB(1 μg/mL)，避光染色10 min。采用515 nm的綠光為激發波長，將染色完成的膠板放于倒置熒光顯微鏡下進行拍照分析[11]。每組觀察約100個細胞，圖片用于后續分析。

1.5 數據分析

本實驗采用CASP軟件分析圖像，用尾部DNA(Tail DNA)的占比(%)為損傷指標。DNA損傷值用平均值±標準偏差表示。實驗數據采用Sigmaplot14繪圖，用SPSS 25.0軟件單因素方差分析(One-way ANOVA)中的Dunnett檢驗進行顯著性差異分析。

2 結果與討論

2.1 Cu2+對THP-1細胞的DNA損傷效應

Cu2+對THP-1細胞的彗星實驗如圖1所示，可見典型的彗星拖尾現象，由于篇幅原因，其余彗星圖像暫不展示。不同濃度的Cu2+對THP-1細胞DNA損傷值如圖2所示。從圖中可見，與對照組相比(本實驗中，空白對照組與溶劑對照組無顯著性差異，因此圖中為溶劑對照組，下同)，低濃度Cu2+(50 μg/L)開始對THP-1細胞產生極其顯著的DNA損傷效應(p<0.01)。而且隨著Cu2+濃度的增大，彗星拖尾率(尾部DNA的占比)也增大，呈現明顯的劑量-效應關系(正相關關系)。參照Anderson等(1994)的DNA損傷分級方法[20]，將Cu2+對細胞的DNA損傷進行分級：以尾部DNA的占比進行分級，0%～10%，0級；>10%～25%，I級；>25%～50%，II級；>50%～75%，III級；>75%～100%，IV級。結果如表1所示。除最低濃度10 μg/L組外，其余濃度Cu2+都對THP-1細胞造成I級或II級損傷。

圖1 Cu2+對THP-1細胞的彗星實驗圖像Fig. 1 Comet assay image of DNA damage in THP-1 cells by Cu2+

圖2 不同濃度Cu2+對THP-1細胞的DNA損傷效應Fig. 2 DNA damage effects of different concentrations of Cu2+ on THP-1 cells圖中“**”代表p<0.01極顯著性差異，下同。

表1 不同濃度Cu2+對THP-1細胞DNA損傷分級表Tab. 1 Classification of DNA damages in THP-1 cells by different concentrations of Cu2+

2.2 不同粒徑的PS對THP-1細胞的DNA損傷效應

不同粒徑的PS對THP-1細胞的損傷效應如圖3所示。2.0 μm PS組從10 mg/mL時與對照組產生極顯著差異(p<0.01)，隨著濃度的增大，DNA損傷程度增加，且均與對照組產生統計學差異。2.0 μm組的損傷分級見表2，除1 mg/mL外，其余各組都對THP-1細胞產生了不同等級的DNA損傷，最高濃度組(25 mg/mL)產生了II級損傷。與對照組相比，0.1～1.0 μm粒徑的PS雖然對THP-1細胞產生了一些損傷，但并未呈現顯著的統計學差異。

圖3 不同粒徑的PS對THP-1細胞DNA損傷效應Fig. 3 DNA damage effects of different particle sizes of microplastics on THP-1 cells

表2 不同濃度的PS (2.0 μm)對THP-1細胞DNA損傷分級表Tab. 2 Classification of DNA damages in THP-1 cells by different concentrations of PS (2.0 μm)

2.3 Cu2+與2.0 μm PS復合對THP-1細胞的DNA損傷效應

選取不同濃度的2.0 μm PS與Cu2+復合，探究兩種污染物共同作用下對THP-1細胞的DNA損傷效應。圖4(a)顯示固定Cu2+濃度為500 μg/L而改變PS濃度，二者復合后對DNA的損傷效應，圖4(b)則顯示固定PS濃度為25 mg/mL，同時改變Cu2+濃度，二者復合后對DNA的損傷效應。由圖4可知，兩種不同復合污染方式，產生的作用都是一致的，即：PS與Cu2+復合后，DNA損傷值顯著高于單一污染(PS或Cu2+)的損傷值。復合污染后的DNA損傷值和DNA損傷分級列于表3、4，從表中可見：二者復合后，最高DNA損傷值為71.9%，產生了III級損傷。 而Cu2+、PS兩者單一污染時，500 μg/L Cu2+的損傷級數為I級，25 mg/mL PS(2 μm)的損傷級數為II級，而復合污染后的損傷級數則增大為III級。通過表3、4對兩種污染物的理論加和值和實際損傷值比較還發現，大多數濃度組的實際損傷值大于理論加和值，呈現一定的劑量-效應關系，且復合污染的DNA損傷值與單一污染的DNA損傷值存在極顯著性差異(p<0.01)。從DNA損傷值和損傷分級來看，微塑料的加入導致Cu2+產生更大的DNA損傷效應。

圖4 PS (2.0 μm)與Cu2+單一和復合污染對THP-1細胞的DNA損傷效應Fig. 4 DNA damage effects of single and combined contamination of PS (2.0 μm) and Cu2+ on THP-1 cells(a)固定Cu2+濃度為500 μg/L，改變PS濃度；(b)固定PS濃度為25 mg/mL，改變Cu2+濃度。

表3 2.0 μm不同濃度PS與500 μg/L Cu2+復合污染的DNA損傷分級表Tab. 3 Classification of DNA damages by different concentrations of PS (2.0 μm) combined with 500 μg/L Cu2+

表4 不同濃度Cu2+與25 mg/mL PS (2.0 μm)復合污染的DNA損傷分級表Tab. 4 Classification of DNA damages by different concentrations of Cu2+ combined with 25 mg/mL of PS (2.0 μm)

2.4 討論

2.4.1 金屬離子對DNA損傷機理的探究 DNA損傷是評價基因毒性的常用手段之一，常用于檢測環境中污染物的生物毒性[21-23]。本研究結果表明Cu2+對THP-1細胞產生顯著的DNA 損傷效應，且污染物濃度越高尾部DNA占比也越大，表明DNA損傷程度越大，呈現良好的劑量-效應響應關系。劉秋妤等(2018)將Cu2+與錦鯉(Cyprinuscarpio)共暴露，發現隨著Cu2+濃度的增加，DNA損傷越嚴重，表現在血細胞微核率顯著升高[24]，本研究與其結果相似。Alak等(2019)發現虹鱒(Oncorhynchusmykiss)在與不同濃度的Cu2+共暴露下，其血細胞產生DNA損傷，且Cu2+濃度越大，損傷程度越嚴重[25]。

金屬誘導DNA損傷的機制主要是通過誘導活性氧自由基 (Reactive Oxygen Species，ROS)生成，破壞抗氧化系統，從而引起ROS清除效率降低，導致DNA損傷[26]。ROS不僅可以攻擊DNA上的堿基，直接導致DNA損傷，而且可以攻擊脂質，生成的不穩定物質再與DNA堿基配對，造成間接損傷[27]。此外，金屬離子由于其帶正電的特性，易與DNA鏈上的負基團發生反應，導致DNA結構發生變化，從而破壞DNA雙鏈的完整性[28]。研究還證實：金屬能干擾DNA修復系統的正常運行，導致不穩定位點的積累，從而導致DNA損傷加劇[29]。

2.4.2 微塑料對DNA損傷效應機理的探究 微塑料作為近年來出現的新型污染物，其生物毒性備受關注[18,30-31]。我們使用THP-1細胞作為受試細胞模型，探討在微塑料單一和復合污染下對細胞的DNA損傷情況。Prietl等(2014)研究了不同種類細胞在不同粒徑的羧基聚苯乙烯微粒的作用下各種生物指標的變化情況，結果表明，未分化的THP-1細胞靈敏度更高，證實了本實驗使用THP-1細胞作為受試細胞模型的可靠性[32]。而且細胞分泌的炎癥因子IL-6與羥基聚苯乙稀微粒粒徑大小呈顯著正相關。本研究結果表明，微塑料粒徑與細胞的DNA損傷相關。實驗組中最大粒徑的2.0 μm PS組對THP-1細胞產生顯著的DNA損傷，而小于2.0 μm PS組則未產生顯著的DNA損傷。Wu等(2019)研究了PS對Caco-2的細胞毒性發現，5.0 μm 和0.1 μm PS均可誘導細胞產生大量的ROS，然而5.0 μm PS在1 μg/mL時顯著降低線粒體膜電位，而0.1 μm PS在20 μg/mL時才能顯著降低線粒體膜電位，表明5.0 μm PS產生了更大的細胞毒性[33]。本研究中，2.0 μm PS對THP-1細胞產生DNA損傷效應的原因可能是粒徑較大的2.0 μm PS更容易破壞線粒體膜電位的穩定，誘導細胞產生大量ROS，導致細胞毒性增強，從而造成DNA損傷。微塑料造成DNA損傷的機制尚不明確，更多機理還需要進一步研究。

2.4.3 復合污染下DNA損傷效應機理的探究 實際上，環境中，單一存在的污染物非常少，往往都是多種類和多濃度的污染物共同作用。它們同時對環境和生物產生影響，如果僅根據單一污染物的毒性去評估環境質量，則有可能低估污染物的危害。因此，對污染物的復合毒性效應進行研究是非常有必要的。Zhu等(2019)發現菲與納米ZnO顆粒共暴露對小麥幼苗根系造成更大傷害[34]。越來越多的證據表明，微塑料在環境中可以作為“載體”而吸附其他污染物，導致被吸附的污染物毒性增強。Lu等(2018)綜合各項生物指標后得出，微塑料的加入增加了Cd對斑馬魚(Danioreriovar.)的毒性[35]。熒蒽在微塑料的作用下增加了貽貝(Mutilus)細胞中活性氧的產生，在細胞和分子水平上產生毒性[31]。滕瑤(2018)觀察到與單一十溴聯苯醚暴露相比，在加入2 μm聚苯乙烯后，櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)細胞的DNA損傷值顯著增加[36]。Deng等(2018)研究表明微塑料加重了有機磷阻燃劑對小鼠的毒性[37]。與上述實驗結果類似，我們研究發現微塑料的加入顯著加重了Cu2+對THP-1細胞的毒性，而且DNA損傷值大于兩者單一污染時產生損傷值的加和值，兩者相互作用呈現交互增強作用?？梢姯h境中多種污染物在微塑料的共同作用下，對生物體的危害程度將大大增加。因此，在將污染物納入風險指標時，應該考慮其他因素的復合影響，例如微塑料存在下的復合影響。復合污染的危害尚不明確，目前還鮮有研究報道。我們推測可能是微塑料和金屬離子復合后，兩者同時誘導產生過量ROS，而ROS未能及時清除，會進一步破壞抗氧化系統，導致DNA損傷加劇。當然，具體機理還需要進一步研究。

3 結論

本研究采用單細胞凝膠電泳實驗的方法，探究了新型污染物PS和典型污染物Cu2+對THP-1細胞的DNA損傷毒性，并探究兩種污染物復合作用下的DNA損傷效應。結果表明無論是新型污染物PS還是典型污染物Cu2+均對THP-1細胞產生DNA損傷。不同濃度的Cu2+脅迫下的DNA損傷存在一定劑量-效應關系。2.0 μm粒徑的PS對THP-1細胞也產生一定的毒性，對細胞造成了II級DNA損傷。而且在2.0 μm粒徑的PS 存在下， Cu2+對THP-1細胞產生了更嚴重的DNA損傷。在環境污染物大量出現和累積的今天，本研究為快速、有效地補充新型污染物毒性效應數據和評估環境質量提供科學依據的同時，也為海洋環境中復合污染存在下標準的制定提供一定的數據支持。