Jagged1在增生性糖尿病視網膜病變纖維血管膜中的表達及其意義

郭慶敏 孟旭霞 楊堃 余川

1青島大學附屬醫院眼科 266000；2青島大學附屬醫院中心實驗室 266000；3鄭州大學第一附屬醫院眼科 450052

郭慶敏現在河北省眼科醫院 河北省眼科學重點實驗室 河北省眼部疾病臨床醫學研究中心，邢臺054001

Notch信號通路是一條進化上高度保守、通過調節細胞間相互作用來調控細胞命運的信號通路[1]。Notch的配體Delta樣配體4(Delta-like 4，Dll4)和Jagged1主要表達于血管內皮細胞，并在血管發育中發揮重要作用[2]。有研究證實Jagged1不僅能促進腫瘤血管生成，還可通過拮抗Dll4/Notch信號通路發揮較強的血管生成調節作用[3-6]。增生性糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)是以眼底新生血管形成為主要病理改變的眼底病變，Jagged1是否參與人類PDR新生血管的發生尚不清楚。本研究擬檢測PDR患眼纖維血管膜病理標本中Jagged1、Dll4和Notch1的表達，探討Jagged1在PDR新生血管形成中的作用及其與Dll4/Notch信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本來源及分組 于2014年7月至2015年7月收集在青島大學附屬醫院眼科行睫狀體扁平部23G標準三通道玻璃體切割手術的PDR患者57例60眼術中纖維血管膜標本，其中男32例34眼，女25例26眼；年齡36～73歲，平均(54.93±6.42)歲；糖尿病病程8～20年，平均(15.72±3.51)年。所有患者均符合2型糖尿病診斷標準及PDR診斷標準[7-8]。排除標準：肺部疾病、嚴重肝腎功能不全、心腦血管病變、惡性腫瘤及自身免疫性疾病患者。根據術前是否行抗血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)藥物玻璃體內注射將標本分為未注藥組30例32眼和注藥組27例28眼，各組年齡和性別構成比差異均無統計學意義(t=4.642、3.964，均P>0.05)，注藥組于玻璃體切割術前2～7 d行雷珠單抗玻璃體內注射。同期選取特發性黃斑前膜患者18例18眼術中黃斑前膜標本作為對照組，排除標準：(1)有糖尿病及糖尿病家族史者；(2)有眼部及全身感染、急性炎癥反應及缺血缺氧性疾病史以及全身系統性疾病者。本實驗中未注藥組和注藥組患者控制血糖的全身用藥種類相同或相似，且均無其他全身用藥；所有患者術前均采用相同的質量濃度0.5%左氧氟沙星滴眼液(日本參天制藥有限公司)點眼清潔結膜囊，減輕眼部炎癥反應，以確保組間患者基線資料均衡。本研究經青島大學附屬醫院倫理審查委員會審查批準(批文號：QYFYWZLL25645)，所有患者或其家屬術前均簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑及儀器 兔抗Notch1(ab52627，英國Abcam公司)；鼠抗Dll4(A00875-1)、兔抗Jagged1(A00901-4)、生物素標記羊抗兔IgG(BA1003)(武漢博士德生物工程有限公司)。手術顯微鏡(VISU200p，德國Carl Zeiss公司)；Constellation玻璃體切割機(美國Alcon公司)；高速離心機(Allegra X-22，美國Beckman公司)；微量移液器(P4608-200°，美國Labnet公司)；熒光定量PCR系統(Light Cycler 96，羅氏診斷產品有限公司)；光學顯微鏡(DM6B)、石蠟切片機(RM2235)(德國Leica公司)；紫外分光光度計(DR6000，美國哈希公司)。

1.2 方法

1.2.1組織病理學染色觀察各組標本結構特征 取未注藥組新鮮標本10個、注藥組新鮮標本12個和對照組標本8個，置于質量濃度4%多聚甲醛溶液中固定5 h，無水乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，沿標本最大截面處行3 μm厚連續切片，行常規蘇木精-伊紅染色，于光學顯微鏡下觀察標本的組織結構。

1.2.2免疫組織化學染色法檢測各組標本中Jagged1、Dll4和Notch1蛋白表達 選取1.2.1部分的石蠟切片，每個病理標本選取截面最大處連續切片15張，各選取5張按照免疫組織化學試劑盒操作步驟進行Jagged1、Dll4和Notch1蛋白的免疫組織化學染色。具體步驟為將3 μm厚組織切片置于60 ℃恒溫烤片箱中烤片1 h；將切片浸于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各5 min進行脫蠟，梯度乙醇進行水化和除去二甲苯，自來水沖洗，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)沖洗2次，每次5 min；滴加體積分數3% H2O2室溫孵育10 min，0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min；滴加抗原修復液，室溫孵育10 min，0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min；滴加山羊血清封閉液，37 ℃恒溫水浴箱內孵育20 min，甩去多余液體；滴加稀釋后的Jagged1、Dll4和Notch1一抗(均1∶ 100稀釋)，37 ℃恒溫箱內孵育2.5 h。0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min；滴加生物素標記二抗(1∶ 50稀釋)，室溫孵育15 min。0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min；滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，37 ℃恒溫箱中孵育20 min，0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min；二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色3 min，PBS代替一抗作為陰性對照。細胞質內出現黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達。采用Image pro plus 6.0軟件計算每張切片中陽性染色區域的平均吸光度(A)值，以各組病理標本中蛋白表達的平均值作為相應蛋白的表達量。

1.2.3實時熒光定量PCR法測定標本中Jagged1、Dll4和Notch1 mRNA的表達 分別取未注藥組標本22個、注藥組標本16個和對照組標本10個，置于消毒的離心管中，-80 ℃超低溫冰箱中凍存。取50～100 mg標本置于玻璃管中，加入1 ml RNAiso plus裂解液，提取總RNA，采用紫外分光光度計檢測其質量濃度和純度，取A260/A280為1.7～2.1的樣本用于后續實驗。將提取的RNA逆轉錄成cDNA，采用雙鏈嵌合熒光染色法擴增相應基因。引物序列由北京六合華大基因科技有限公司合成。Jagged1引物：正向5’-AACTGGTACCGGTGCGAA-3’，反向5’-TGATGCAAGA TCTCCCTGAAAC-3’；Dll4引物：正向5’-CCCTGGC AATGTACTTGTGAT-3’，反向5’-TGGTGGGTGCAGTA GTTGAG-3；Notch1引物：正向5’-GTCAACGCCGTAG ATGACC-3’，反向5’-TTGTTAGCCCCGTTCTTCAG-3’；磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物：正向5’-CACGATGGA GGGGCCGGACTCATC-3’，反向5’-TAAAGACCTCTA TGCCAACACAGT-3’。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性3 s，60 ℃退火及延伸30 s，共40個循環。以GAPDH作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算各目的基因相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行統計分析。計量資料數據經Kolmogoror-Smimor檢驗證實呈正態分布，以mean±SD表示。未注藥組、注藥組和對照組標本間Jagged1、Dll4和Notch1蛋白及mRNA相對表達量差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。PDR纖維血管膜標本中Jagged1 mRNA相對表達量與Dll4和Notch1 mRNA表達量關系評估采用Pearson線性相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組標本中組織病理學表現

光學顯微鏡下可見PDR纖維血管膜中新生血管生成，注藥組纖維血管膜中血管管腔狹窄，部分管腔閉合；未注藥組纖維血管膜中血管管腔充盈，且形態較完整；對照組黃斑前膜組織疏密均勻，未見新生血管結構(圖1)。

圖1 各組病理標本中新生血管情況(HE ×100，標尺=100 μm) A：未注藥組纖維血管膜中可見新生血管管腔充盈(箭頭) B：注藥組纖維血管膜中血管管腔狹窄(箭頭) C：對照組黃斑前膜中未見新生血管Figure 1 Neovascularization in pathological specimens of each group(HE ×100,bar=100 μm) A:Dilated lumen (arrow) of new blood vessels was found in fibrovascular membranes of the non-injection group B:Narrow lumen (arrow) of new blood vessels was found in fibrovascular membranes of the injection group C：No neovascularization was found in macular epiretinal membranes of the control group

2.2 未注藥組與注藥組標本中Jagged1、Dll4和Notch1蛋白的表達比較

未注藥組10個標本血管內皮細胞中Jagged1、Dll4和Notch1蛋白表達均呈強陽性，主要表達在細胞質中，陽性細胞主要位于新生血管內皮組織，而非血管內皮部位的陽性染色考慮主要在切片及標本制作過程中，部分血管內皮細胞被牽拉移位至血管外部位所致；注藥組12個標本血管內皮細胞中Jagged1、Dll4和Notch1蛋白表達均呈弱陽性(圖2)。未注藥組纖維血管膜病例標本中Jagged1、Dll4和Notch1蛋白陽性區域平均A值明顯高于注藥組，差異均有統計學意義(t=5.168，P=0.014；t=6.012，P=0.008；t=3.453，P=0.030)(表1)。

圖2 未注藥組及注藥組纖維血管膜病理標本中Jagged1、Dll4和Notch1蛋白免疫組織化學染色圖(DAB ×400，標尺=50 μm) 未注藥組纖維血管膜中Jagged1、Dll4和Notch1蛋白均呈強陽性表達，注藥組纖維血管膜中各蛋白表達減弱 箭頭所示為染色陽性細胞Figure 2 Immunohistochemical staining images of Jagged1,Dll4 and Notch1 proteins in specimens of the two groups(DAB ×400,bar=50 μm) Strong positive expression of Jagged1,Dll4 and Notch1 proteins could be seen in the non-injection group,and attenuated expression of the three proteins was found in the injection group Arrows indicated the positively stained cells

表1 未注藥組與注藥組Jagged1、Dll4和Notch1蛋白免疫組織化學陽性染色平均A值比較(mean±SD)Table 1 Comparison of the average absorbance value of Jagged1,Dll4 and Notch1 between the two groups (mean±SD)組別樣本量陽性染色A值Jagged1Dll4Notch1未注藥組106.25±1.826.87±1.895.12±2.14注藥組121.46±0.371.55±0.241.32±0.53t值5.1686.0123.453P值0.0140.0080.030 注:(獨立樣本t檢驗) Dll4:Delta樣配體4 Note:(Independent samples t-test) Dll4:Delta-like 4

2.3 各組標本Jagged1、Dll4和Notch1 mRNA的表達比較

對照組、注藥組和未注藥組標本中Jagged1、Dll4和Notch1 mRNA相對表達量總體比較差異均有統計學意義(F=77.337、62.305、51.869，均P<0.01)；其中，未注藥組和注藥組標本中Jagged1、Dll4和Notch1 mRNA相對表達量明顯高于對照組，注藥組Jagged1、Dll4和Notch1 mRNA相對表達量明顯低于未注藥組，差異均有統計學意義(均P<0.05)(表2)。

表2 各組Jagged1、Dll4和Notch1 mRNA相對表達量比較(mean±SD)Table 2 Comparison of the relative expression levels of Jagged1,Dll4 and Notch1 mRNA among the three groups (mean±SD)組別樣本量各基因mRNA相對表達量Jagged1Dll4Notch1對照組101.89±0.182.20±0.751.24±0.17未注藥組2221.33±2.22a38.85±11.34a9.91±2.33a注藥組167.56±0.49ab10.24±1.36ab4.67±1.19abF值77.33762.30551.869P值<0.01<0.01<0.01 注:與對照組比較,aP<0.05;與未注藥組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) Dll4:Delta樣配體4 Note:Compared with the control group, aP<0.05;compared with the non-injection group, bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) Dll4:Delta-like 4

2.4 PDR患者纖維血管膜標本中Jagged1與Dll4 mRNA和Notch1 mRNA相對表達量的相關性

所有PDR患者纖維血管膜標本中Jagged1 mRNA相對表達量與Dll4和Notch1 mRNA相對表達量均呈顯著正相關，差異均有統計學意義(r=0.925、0.950，均P<0.05)(圖3)。

圖3 PDR患者纖維血管膜標本中Jagged1與Dll4和Notch1 mRNA相對表達量相關分析散點圖(Pearson線性相關分析，n=38) A：Jagged1 mRNA相對表達量與Dll4 mRNA相對表達量呈顯著正相關(r=0.925，P<0.05) B：Jagged1 mRNA相對表達量與Notch1 mRNA相對表達量呈顯著正相關(r=0.950，P<0.05) Dll4：Delta樣配體4Figure 3 Scatter diagram of the relative expression levels of Jagged1,Dll4 and Notch1 mRNA in fibrovascular membrane specimens from PDR patients(Pearson linear correlation analysis，n=38) A:The relative expression level of Jagged1 mRNA was positively correlated with that of Dll4 mRNA (r=0.925，P<0.05) B：The relative expression level of Jagged1 mRNA was positively correlated with that of Notch1 mRNA (r=0.950,P<0.05) Dll4:Delta-like 4

3 討論

糖尿病是一種常見的慢性疾病，約有70%的患者會并發全身小血管和微血管病變，其中糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常見的眼底微血管并發癥[9-10]。PDR可繼發玻璃體反復積血、纖維增生，繼而形成纖維條索，甚至出現牽拉性視網膜脫離，嚴重者可致盲[11]。

作為Notch信號通路的配體之一，Jagged1主要表達于血管內皮細胞，參與血管的生成和發育，其基因突變將導致Alagile綜合征，表現為嚴重的血管缺陷[12]，而卵巢癌及三陰乳腺癌的血管形成與Jagged1的表達上調密切相關[13-15]。Guo等[16]對2型糖尿病模型大鼠進行研究發現，缺氧可通過激活Jagged1-Notch1信號通路誘導腦部新生血管生成；而Zhao等[17]研究發現，細胞色素P450 2J2可通過激活Jagged1/Notch1信號通路促進心肌血管形成，進而改善心衰患者的心功能狀況。本研究結果顯示，Jagged1在PDR患者纖維血管膜中的表達顯著高于對照組，考慮可能由于黃斑前膜組織無新生血管的形成和出芽，而注藥組由于玻璃體內注射抗VEGF藥物，造成部分視網膜新生血管消退萎縮，因此其Jagged1表達量較未注藥組低。此外，本研究結果顯示Jagged1與Notch1 mRNA相對表達量呈顯著正相關，推測Jagged1與Notch1聯合發揮調控新生血管生成的作用。

有研究證實，Jagged1可促進血管增生，增加新生血管數量，Dll4則抑制無功能血管的過度增生，使其功能成熟，二者相互拮抗，并保持動態平衡，共同促進血管正常生長發育，以保證血液循環系統的有效建立[3,18]。同時，有研究發現，Jagged1可作用于Dll4/Notch1信號通路下游，激活相鄰細胞Notch3受體，參與平滑肌細胞分化過程并調節血管成熟；而內皮細胞特異性敲除Jagged1基因可導致血管平滑肌細胞分化障礙[19-20]。史少陽等[21]研究發現，Dll4在視網膜新生血管形成的過程中發揮重要作用，并可能通過對VEGFR的反饋抑制發揮抑制病理性新生血管過度形成的作用。而本研究結果顯示，注藥組患眼纖維血管膜組織Jagged1和Dll4 mRNA及蛋白的表達量均低于未注藥組，且PDR患眼纖維血管膜組織中Jagged1 mRNA與Dll4 mRNA表達呈正相關；Jagged1與Dll4蛋白陽性表達部位大體一致，均主要表達于血管內皮組織，推測Jagged1與Dll4相互調節、相互制約，共同調節PDR新生血管的形成。同時，本研究結果顯示，對照組黃斑前膜組織中無新生血管形成，Jagged1和Dll4蛋白及mRNA表達量也明顯降低，推測二者在促進病理性新生血管的發生和成熟過程中發揮一定作用。

本課題組前期研究發現，糖尿病模型大鼠視網膜中VEGF與Dll4和Notch1表達量均呈顯著正相關[22]；結合本研究中Jagged1與Dll4和Notch1的相關性，推測VEGF與Jagged1的表達同樣呈正相關。后續我們將繼續探索其他相鄰組織中VEGF等相關因子的表達，進一步評估其與Jagged1表達的相關性。

綜上所述，本研究結果表明Jagged1可能參與PDR病理性新生血管的形成與發育過程，并可能與Dll4/Notch1信號通路相互制約與調控。本研究入組標本較少，免疫組織化學染色過程中發現部分陽性表達蛋白位于血管內皮細胞之外，且在血管新生過程中，Jagged1與Dll4的表達并非完全同步。因此，未來我們將進一步行大樣本臨床試驗，采用免疫熒光雙標法確定細胞性質，并分析不同階段Jagged1與Dll4表達的相關性，以更準確地評估Jagged1在PDR病變組織中的表達及作用，為臨床預防和治療PDR提供新的思路和靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突