呼倫貝爾地區牛體表寄生蜱中羊種布魯氏菌的分離與鑒定

黃天鵬，郭旭，孫長云，陳經雕，朝木麗格，武婕，格日勒圖?

1內蒙古農業大學獸醫學院，呼和浩特 010018；2額爾古納市動物疫病預防控制中心，內蒙古額爾古納市 022250；3廣東省疾病預防與控制中心，廣州 511430

0 引言

【研究意義】布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏桿菌感染而引起的人畜共患傳染病。布魯氏菌病的影響及危害較為嚴重，據報道世界上每年大約新增布魯氏菌病患者達50萬人，被WHO稱之為“再度肆虐”的傳染病之一[1-2]。目前，全國有23個省份（自治區）均都有人間布魯氏菌病陽性病例的發生，特別是近期甘肅省蘭州市發生了一起大規模人感染布魯氏菌的事件，內蒙古地區是我國布魯氏菌病發病流行最為嚴重的疫區之一[3-5]。隨著內蒙古畜牧養殖業規模的形成，促使牛羊養殖模式發生改變，市場上畜產品加工和流通都發生了變化。其中值得一提的是，布魯氏菌病的宿主范圍較為廣泛，除了家畜牛、羊以外還包括野生動物、鳥類、魚類、兩棲類甚至人類等[6-9]。更為有趣的是據文獻報道，一些吸血節肢動物如蜱蟲等也可能成為布魯氏菌的適宜宿主，增加了布魯氏菌病在不同動物之間的傳播風險[10]?！厩叭搜芯窟M展】布魯氏菌病的持續存在和死灰復燃的流行態勢可能與儲存宿主的數量有關，在多種儲存宿主中蜱蟲也是重要的組成部分。1943年，ZOTOVA等[11]通過體外試驗證實，邊緣璃眼蜱（Hyalomma marginatum）屬于布魯氏菌病的傳播媒介，其可以儲存并傳播該病原給健康動物。1951年，ZOTOVA等[12]再次通過實驗室的檢測證實，邊緣璃眼蜱（Hyalomma marginatum）可以作為布魯氏菌的寄生宿主?！颈狙芯壳腥朦c】將采集的蜱蟲放置在患有布魯氏菌病的豚鼠體表進行吸血，隨后取下飽血蜱蟲進行研磨，并將研磨后的組織液注入豚鼠體內，而培養一段時間后的蜱蟲研磨成乳濁液，將乳濁液注射給健康的豚鼠，一段時間后檢測豚鼠血清學顯示布魯氏菌陽性。該結果表明邊緣璃眼蜱和薩氏璃眼蜱可以作為布魯氏菌的貯存媒介，并存在傳播布魯氏菌病的潛在風險?！緮M解決的關鍵問題】本文為了確定呼倫貝爾地區主要分布的蜱蟲種型以及闡明牛體表寄生草原革蜱與牛羊布魯氏菌病的相關性。通過傳統形態學及分子生物學相結合的方法鑒定出該地區的優勢蜱種。同時，首次在呼倫貝爾地區蜱體內成功分離到4株布魯氏菌，其中2株菌為羊種2型，2株菌為羊種3型布魯氏菌。本試驗為內蒙古地區布魯氏菌的溯源和有效防控提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 蜱蟲樣本的采集

2020年4至5月，在內蒙古呼倫貝爾盟的新巴爾虎右旗選擇兩個牧區點（包括貝爾蘇木和克爾倫蘇木）進行蜱蟲的采集工作。從40只自然放牧的牛體表共采集191只蜱蟲，每頭牛體表采集寄生蜱蟲3—5只。

1.2 蜱蟲傳統形態學觀察

應用解剖顯微鏡對采集的蜱蟲分別進行形態觀察與記錄。觀察部位主要包括假頭基、盾板、須肢、生殖孔、足轉節、肛溝和氣門板等。參照鄧國藩等[13]、HORAK等[14]和巴音查汗等[15]的方法，完成蜱蟲的初步鑒定。

1.3 蜱蟲的分子生物學鑒定

1.3.1 蜱蟲線粒體16S rRNA基因和CO ?基因引物的設計 在Genbank數據庫中下載不同蜱種類（主要包括草原革蜱、森林革蜱和全溝硬蜱等）的線粒體 16S rRNA基因序列，經過Genetyx生物軟件對下載序列進行同源性比對分析，確定16S rRNA基因序列中相對保守的區域。借助Primer 5.0軟件，設計16Sf和16Sr引物對。針對蜱蟲的CO ?基因，參考FOLMER等[16]報道的引物對（包括LCO1490和HCO2198）。上述兩對引物委托上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如下所示（表1）。

表1 蜱線粒體PCR引物設計序列Table 1 Primers sequences for PCR of mitochondria

1.3.2 蜱蟲線粒體16S rRNA基因和CO I基因的克隆設定 PCR 反應體系為 50 μL：2×Taq PCR Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，模板DNA 4 μL，剩下用雙蒸水補足50 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環；72 ℃延伸 10 min。取10 μL PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。將PCR產物送至生工生物工程（上海） 股份有限公司進行基因測序，并將測序結果于NCBI數據庫中進行對比分析，用MEGA 7.0軟件建立系統發育樹。

1.4 布魯氏菌分離培養與鑒定

1.4.1 布魯氏菌分離培養 收集蟲卵和消毒的蜱蟲，放于1.5 mL無菌EP管中，用滅菌研磨棒進行研磨，加200 μL生理鹽水進行混勻，將混合液加入到布氏肉湯培養基，放入37℃恒溫箱進行培養3 d。將培養物劃線于布魯氏菌選擇性培養基中，并放入37℃恒溫箱中進行培養，隔日觀察，持續培養30 d以上。對分離的菌落進行觀察，并對該菌落進行革蘭氏染色和柯氏染色。

1.4.2 布魯氏菌Bcsp31和Omp22檢測及序列分析參考QUEIPOORTUNO等[17]針對布魯氏菌Bcsp31序列設計的特異性引物，和參考TANG等[18]針對布魯氏菌Omp22序列設計的特異性引物，委托上海桑尼生物科技有限公司合成。引物序列如表2所示。

表2 引物序列Table 2 The primer sequence

1.5 布魯氏菌分型鑒定

1.5.1 布魯氏菌常規分型鑒定 布魯氏菌血清凝集、染料抑菌以及噬菌體裂解試驗屬于布魯氏菌常規鑒定內容。其中血清凝集試驗包括布病陽性血清凝集和A、M和R單因子血清凝集；染料抑菌試驗包括堿性復紅和硫瑾抑菌試驗；噬菌體裂解實驗包括 BK2、104Tb 和 Tb 3種噬菌體裂解試驗。另外，還有硫化氫產生試驗、CO2需要。試驗采用雙層瓊脂平板法，具體操作按照布魯氏菌常規鑒定標準方法執行。

1.5.2 AMOS-PCR布魯氏菌分型鑒定 AMOS-PCR引物參照參考文獻[19]，委托上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如表3所示；擴增參數為：預變性96 ℃ 5 min，變性96 ℃ 50 s，退火60 ℃ 50 s，延伸72 ℃ 90 s；35個循環；終末延伸72 ℃ 7 min，產物經2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表3 AMOS-PCR引物序列Table 3 The primer sequence of AMOS-PCR

2 結果

2.1 蜱蟲的形態學鑒定

經解剖顯微鏡（OLYMPUS SZ51）觀察，雄性草原革蜱：蟲體為卵圓形、假頭短且呈矩形、須肢外緣呈弧形、盾板有較淡的琺瑯彩、有緣垛且緣垛上有琺瑯斑，還有混雜不均一的銀白色花斑、雄蜱腹面無幾丁質板、各足基節順序增大，4對足粗短，第1對足基節內外距近相等，第4對足基節最大且其外距不超過該節后側緣，肛門后部有明顯的肛溝圍繞。雌性草原革蜱：蟲體為卵圓形、孔區較大、有濃厚的琺瑯彩、背緣無幾丁質增厚部、其它形狀與雄性蜱蟲一樣（圖1）。

圖1 草原革蜱的形態學鑒定Fig.1 Morphology of identification D.nuttalli specimens

2.2 草原革蜱的分子生物學鑒定

草原革蜱的 16S rRNA基因序列遺傳進化樹結果利用 MEGA 7.0軟件成功構建了草原革蜱 16S rRNA基因和CO ?基因序列的系統進化樹。根據草原革蜱16S rRNA基因的系統進化樹可見，呼倫貝爾地區采集的蜱蟲與 NCBI中已注冊的俄羅斯地區、新疆地區和河北地區草原革蜱在同一個進化分支上（圖2）。根據草原革蜱CO ?基因的系統進化樹可見，呼倫貝爾地區采集的蜱蟲與NCBI中已注冊的內蒙古、新疆、吉林、河北和甘肅地區的草原革蜱在同一進化分支上，且與內蒙古地區草原革蜱進化關系最近，而與其他種屬的蜱蟲形成分支（圖3）。上述結果也表明，本試驗采集的蜱蟲種型為草原革蜱。

圖2 基于16S rRNA 基因序列NJ法種系發育進化樹Fig.2 Evolutionary relationships by NJ methods analysis in 16S rRNA gene sequences

2.3 細菌分離培養與形態學觀察

成功在飽血蜱蟲中分離4株布魯氏菌，分別命名為 B.melitensis IMHT5、B.melitensis IMHT6、B.melitensis IMHT7、B.melitensis IMHT8。經血平板培養基和布魯氏菌選擇性培養基中培養出針尖狀小菌落，菌落呈無色半透明，邊緣濕潤光滑（圖 4）。經革蘭氏染色，細菌呈革蘭氏陰性短桿菌。經柯氏染色后菌體呈紅色（圖5）。

圖4 分離菌的菌落形態Fig.4 Colony morphology of isolated bacteria

圖5 分離菌革蘭氏染色及柯氏染色鏡檢Fig.5 Gram staining and Kirschner staining microscopic examination of isolated bacteria（×100）

2.4 分離菌株的Omp22序列遺傳進化樹結果

根據布魯氏菌的Omp22構建的進化樹可見，此次分離的4株布魯氏菌株聚集在同一末端分支上，與新疆的分離菌聚類在同一分支上，而與西班牙、德國和印度的分離株相對距離較遠（圖6）。

圖6 基于布魯氏菌Omp22構建的系統進化樹Fig.6 phylogenetic tree based on Omp22 of Brucella

2.5 牛種布魯氏菌的AMOS-PCR分型

經AMOS-PCR方法鑒定后發現，分離的4株布魯氏菌與羊種布魯氏菌處于同一預期大小，條帶大小為731 bp。而且電泳檢測結果顯示牛種和豬種布魯氏菌分別在498 bp和285 bp處擴增出預期條帶，陰性對照未見擴增結果（圖7）。該結果表明分離的4株菌均屬于羊種布魯氏菌。

圖7 布魯氏菌 AMOS-PCR鑒定Fig.7 Identificated of Brucella by AMOS-PCR

2.6 布魯氏菌常規分型試驗

經常規分型試驗證實2株分離布魯氏菌為羊種3型菌株（表4），具有以下特征：CO2（-）、H2S（-）；單項特異性血清凝集A（+）、M（+）、R（-）；染料抑菌硫堇和堿性品紅（+）、噬菌體裂解BK2（+）、Tb（-）、104Tb（-）。而其它2株菌為羊種2型布魯氏菌，具有以下特征：CO2（-）、H2S（-）；單項特異性血清凝集 A（+）、M（-）、R（-）；染料抑菌硫堇和堿性復紅（+）、噬菌體裂解BK2（+）、Tb（-）、104Tb（-）。

表4 布魯氏菌分型鑒定Table 4 The results of classification and identification of Brucella

3 討論

近十年以來，隨著氣候變化內蒙古各個地區的家畜嚴重遭受蜱蟲攻擊。不僅給家畜帶來皮膚等組織的直接損傷，而且增加了蜱傳疾病發病流行的風險。據王建軍等報道[20]，認為呼倫貝爾地區僅存在長角血蜱（Haemaphysalis Iongicornis）和全溝硬蜱（Ixodes persuleatus）。在近幾年調研結果中發現，呼倫貝爾地區蜱蟲種類的變化相當突出，不只存在上述兩種硬蜱。2020年4—5月，筆者選擇內蒙古呼倫貝爾盟的新巴爾虎右旗兩個牧區點進行蜱蟲的采集工作。在40只自然放牧的牛體表共采集191只蜱蟲，每頭牛體表采集寄生蜱蟲3—5只。借助解剖鏡對采集蜱蟲的特殊器官進行觀察和圖像采集，根據鄧國藩等[13]對蜱蟲的形態學描述方法進行鑒定，發現在這個季節呼倫貝爾地區活躍的優勢蜱種為草原革蜱（D.nuttalli）。這結論與筆者 2015年以來所得到的蜱蟲種型信息相吻合[21]。雖然傳統形態學方法一直是研究者們對蜱蟲種型鑒定工作中采取的主要手段之一，但這種鑒定方法不僅容易受到主觀因素的影響，而且對蜱蟲的多樣性和遺傳進化研究存在局限性[22]?；谏鲜鲆蛩乜紤]，本研究選擇了蜱蟲遺傳保守性基因16S rDNA和CO I基因，進行種型和遺傳進化分析[23]。2種靶基因序列經過克隆和測序后再與GenBank上注冊的參考序列比對后發現，與已知的草原革蜱相同序列同源性均達到99%以上。用Mega 7.0軟件分析根據2種基因繪制出的遺傳進化樹發現，我們鑒定的草原蜱蟲種與俄羅斯地區、新疆地區和河北地區草原革蜱的參考序列處在同一個進化分支上，而與其他種屬的蜱蟲相距甚遠。該結果可能提示，上述3個地區存在同一種草原革蜱來源的祖先蜱蟲，這一發現對蜱傳疾病的溯源具有重要的意義。

眾所周知，布魯氏菌病是一類古老的人畜共患病。早在1943年，ZOTOVA等[11]闡述通過體外試驗的方法證明，邊緣璃眼蜱（H.marginatum）可以儲存布魯氏菌并能夠將該病原傳播給健康動物。最近，HOSSEINI等[24]應用分子生物技術檢測到微小牛蜱（Boophilus microplus）中的布魯氏菌基因產物，認為微小牛蜱在布魯氏菌病傳播過程中可能發揮媒介作用。目前，文獻報道的PCR檢測布魯氏菌的方法很多，在布魯氏菌屬的水平檢測一般選用單對引物PCR，其中主要是以Bcsp31、Omp22和IS711等作為靶基因設計引物[17-18，25]。本試驗在呼倫貝爾地區的牛體表上采集191只蜱蟲，以常規方法率先成功分離出4株羊型布魯氏菌。然后選擇了Bcsp31和Omp22對分離菌進行鑒定，而后在種及生物型水平的鑒定則選用多對引物的多重PCR方法，比如AMOS-PCR和多位點串聯重復序列分析方法（MLVA）等[26-28]。結果顯示4株分離菌與羊源、牛源和豬源布魯氏菌的Bcsp31同源性為99%以上。而且，根據布魯氏菌的Omp22構建的進化樹中可見，本試驗分離的4株布魯氏菌株聚集在同一末端分支上，與新疆的分離菌聚類在相同分支，而與西班牙、德國和印度等國外的布魯氏菌分離株也不甚遠。該結果表明，4株布魯氏菌分離株均屬于相同布魯氏菌屬成員，均為我國國內主要流行菌株，但并非國外輸入菌株。

AMOS-PCR是布魯氏菌種型鑒定的常規方法之一，文獻報道該方法可鑒定羊種1、2、3型布魯氏菌，牛種1、2、4型布魯氏菌,豬種1型布魯氏菌和綿羊附睪種布魯氏菌[29]。本試驗經 AMOS-PCR方法鑒定了4株分離菌的生物型，并與常規分型鑒定試驗結果進行了比較。結果發現4株布魯氏菌分離株分別鑒定為2株符合羊種3型布魯氏菌和2株符合羊種2型布魯氏菌特點，2種方法鑒定結果符合率為100%。本試驗成功分離到的4株布魯氏菌來源于3頭牛體表的寄生蜱體內，其中兩株布魯氏菌（B.melitensis NMT6和B.melitensis NMT7）來源于同一頭牛體表的寄生蜱體內，其余兩株布魯氏菌（B.melitensis NMT5和 B.melitensis NMT8）分別來源于不同的牛體表的寄生蜱體內。該試驗結果提示，在牧區流行的羊種3型布魯氏菌和羊種2型布魯氏菌不僅可以在牛羊等家畜體內存在[30]，而且可以在草原革蜱體內存活。這對動物布魯氏菌的溯源研究具有重要意義。

4 結論

通過傳統形態學和分子生物學相結合的辦法，鑒定出呼倫貝爾地區4—5月優勢蜱種為草原革蜱。并首次從牛體表采集的草原革蜱樣本中分離到4株羊種布魯氏菌。為內蒙古地區布魯氏菌病傳播媒介調查以及溯源研究提供科學的基礎數據。