表皮干細胞在組織修復中應用的研究進展

張苗苗 付倩倩 趙雅玫 周軍利 余小平

（1.甘肅中醫藥大學第一臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000；2.寧夏醫科大學臨床醫學院，寧夏 銀川 750000；3.甘肅省人民醫院燒傷科，甘肅 蘭州 730000）

皮膚是人體最大的器官和第一道免疫屏障，具有抵御病原體入侵、調節體溫、提供感覺等多種重要功能[1]。創面愈合是一個復雜且受到高度調控的過程，關系到組織的完整性和功能的恢復[2]。大面積燒傷、壓力性潰瘍等嚴重和廣泛的皮膚損傷以及糖尿病等疾病損害皮膚的再生能力，會導致局部細胞增殖異常、生長因子及干細胞減少，發生表皮再生障礙[3]。隨著糖尿病、血管性疾病和肥胖患者的日益增多，慢性創面發生率增加，但由于慢性創面治療策略有限，治療效果不理想，需要消耗大量醫療資源，醫療費用昂貴，使慢性創面正成為一個重大的全球問題[4-5]。皮膚及其附件中存在著不同類型的干細胞，它們在維持皮膚穩態、調節生理條件下的皮膚損傷過程中發揮著重要的作用。表皮干細胞(epidermal stem cells,ESCs)作為表皮層基底部的細胞參與了創面修復的過程。ESCs具有數量眾多且與胚胎干細胞相比容易獲得、不存在潛在的倫理學問題等優勢，因此，采用移植ESCs的方法進行創面修復具有良好的臨床應用前景[6-7]。自20世紀70年代以來，研究人員一直探索利用ESCs進行組織再生的方法，部分方法已被證明可以促進創面愈合或替代不可逆丟失的皮膚，比如，ESCs、間充質干細胞和脂肪源性干細胞結合絲質支架及ESCs與生物材料相結合的先進生物工程皮膚移植可以有效地促進皮膚創傷的修復和再生[8]。ESCs可以作為種子細胞是其用于各類皮膚退行性病變及皮膚再生研究的基礎和重點，其可在體外培養和所具有的增殖潛力使其成為皮膚生物工程的首選細胞。本文對ESCs的特點、在創面愈合過程中的作用機制以及ESCs在組織修復中應用的研究進展綜述如下，探討ESCs在臨床應用中的潛力和可行性。

1 ESCs的位置及標記

在皮膚表皮中存在多種干細胞，其中ESCs在表皮形成、表皮組織結構穩定和皮膚創傷愈合等方面發揮重要作用。ESCs類型包括毛囊間表皮干細胞（interfollicular epidermal stem cells, IFESCs）、毛囊干細胞（hair follicle stem cells，HFSCs）等。ESCs所處的特定微環境被稱為干細胞生態位，即干細胞的微環境，是控制干細胞增殖、分化和遷移的基礎[9-11]。在皮膚中已發現了3種不同的ESCs生態位，包括表皮基底層、毛囊隆突部和皮脂腺的基部[12]。位于不同生態位的ESCs有不同的生物標記物和功能，IFESCs位于濾泡間表皮（interfollicular epidermis，IFE）的基底層，并分化產生基底層細胞,高水平表達β1-整合素（CD34）和α6-整合素、富含leu的重復序列和免疫球蛋白樣結構域（LRIG）1以及黑色素瘤相關的硫酸軟骨素蛋白多糖；IFESCs不僅補充基底層，還產生非增殖的、具有轉錄活性的棘狀層和顆粒層，最后形成終末分化角質層的外層[13]。HFSCs位于毛囊外根鞘的隆突部并具有特異性膨大標志物，如CD34、LGR5和轉錄因子-3。毛囊的隆突部是角質形成細胞和毛囊細胞的來源。這些干細胞能夠再生包括毛發、皮脂腺和毛囊等許多皮膚結構，特異性細胞標志物有CD34、角蛋白15（cytokeratin，K15）、SRY-box（Sox）9等。

2 ESCs的特性

2.1 ESCs的可塑性 ESCs表現出相當大的分化潛能，具有可以在不同環境下轉化或分化為其他類型細胞的能力，被定義為可塑性[14]。皮膚損傷后IFESCs和HFSCs被招募到濾泡間表皮中時，它們逐漸失去最初的特性，分化為IFE；長壽命的IFESCs可以被招募到創面并促進創面的再上皮化。除IFESCs外，皮膚損傷后HFSCs也表現出可塑性，隆突部和漏斗部的HFSCs向上遷移、增殖并參與表皮修復過程，遷移的HFSCs逐漸失去其原來的特性，并采用IFE分化程序。然而，HFSCs在IFE中不能長時間存活，分化的基底層以上表皮細胞在受傷時可以去分化為干細胞。在創面愈合過程中，GATA6陽性細胞被動員，遷移到受傷的IFE，并從分化后的細胞去分化為干細胞，并獲得干細胞特性[14]。在毛囊中也觀察到了去分化現象。皮膚損傷后，隆突部位的HFSCs消失，已分化的漏斗部細胞或皮脂腺細胞可以重新填充干細胞生態位，并成為功能性HFSCs。干細胞可以產生分化細胞，也通過對稱或不對稱分裂來繁殖以維持恒定的干細胞池[15]。

2.2 ESCs的自我更新、動態增殖和遷移 在創面愈合過程中，ESCs通過增強對稱更新或減少分化細胞的比例實現組織更新。在胚胎發育過程中，大多數的基底細胞分裂是對稱的（由一個干細胞產生兩個相同的子細胞，表現出分化的表型），并平行于基底膜的軸，維持胚胎表皮的生長和確保上皮保持單層。而在成年后處于內穩態的基底細胞在上皮分層過程中，約70%的基底細胞的分裂是不對稱的（一個子細胞失去與基膜分泌的整合素和生長因子的接觸而發生分化，第二個子細胞保持與基膜的接觸而保持干細胞的特征）[16]，從而允許基底層細胞的發育和表皮的建立。創面愈合過程中可見角化細胞增殖增加，然而，細胞增殖只能在離創面邊緣0.5～1.5 mm的增殖區檢測到，而不能在創面邊緣檢測到；在創面邊緣，位于基底層和基底上層細胞以細胞薄片（傷口周圍的上皮組織在靠近傷口的地方形成一個遷移前沿，遠端被增殖細胞的同心圓包圍）的形式遷移[17-18]。細胞的增殖可以促進產生多余的細胞，隨后遷移到創面中心修復組織[19]。

3 ESCs的信號調節機制

ESCs可對多個信號系統的激活和抑制做出反應。ESCs相關信號通路中的Wnt和Notch信號通路對ESCs“生態位”發揮著關鍵作用[20-21]。當皮膚損傷時，在Wnt和Notch信號通路的調控下，干細胞生態位在細胞因子產生、參與細胞信號傳遞、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）改變等方面發生變化[22]。典型的Wnt通路通過抑制糖原合成酶激酶3β發揮作用，導致未磷酸化的catenin積累，隨后catenin作為DNA結合蛋白的淋巴增強子結合因子1/轉錄因子家族的核輔因子[23]，促進關鍵微管結合蛋白的積累，這些蛋白在活性狀態下穩定創面邊緣細胞的微管，從而促進創面修復。研究發現，Wnt和Notch信號的激活或抑制可通過靶向原癌基因Myc、堿性螺旋-環-螺旋（bHLH）轉錄因子(c-Myc)和Hes1影響ESCs的增殖、角質形成細胞的分化和遷移以及毛囊再生，最終導致創面愈合增強或延遲；若調節功能失控則會導致皮膚衰老或者腫瘤發生。另外，可通過吸引和排斥雙重機制對軸突生長和細胞遷移發揮導向功能的軸突導向因子Nertrin-1蛋白可通過調節ESCs功能，減輕紫外線B輻射誘導的氧化應激，改善線粒體功能障礙，減輕長期暴露于紫外線造成的皮膚損傷[24-25]。

ESCs的信號調節，既是ESCs發揮各種潛能的內在機制，也是全面認識ESCs特性及挖掘ESCs轉化應用的關鍵環節，有待于深入探討研究。

4 ESCs在組織修復中的應用

4.1 ESCs在燒傷創面修復中的應用 由于皮膚及其附件中存在多種干細胞類型，皮膚顯示出較強的修復潛力。研究表明，位于毛囊隆突部的干細胞是皮膚組織更新和創面修復的新細胞的重要來源[26]。ESCs可以完成理想的自我更新而形成新的表皮，并保持對局部信號的時空響應能力[27]。以ESCs為主體的燒傷創面的自體表皮移植物（cultured epidermal autografts ，CEAs）已經取得了良好的效果，并且CEA植入成功與否與ESCs含量的高低有關[8]。因此，通過富集ESCs可以促進皮膚替代物和CEAs的移植。還有研究顯示，在人α-防御素-5誘導的小鼠Ⅲ度燒傷模型中，毛囊膨出部的ESCs的激活加速了創面愈合，重要的是還誘導了毛發再生[28]，提示這種方法可能成為治療重度燒傷的新方法。同樣，通過熒光激活細胞分選分離的富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受體6（lgr6）陽性ESCs移植并注射到傷口中，可顯著促進再上皮化、毛發生長和血管生成。目前，采用表皮細胞懸液移植（主要移植ESCs）與刃厚皮網狀移植技術相結合，在緩解燒傷患者疼痛、減少供區損傷、降低住院費用及縮短住院時間方面具有優勢[29-30]；在治療大面積燒傷時，表皮細胞懸液還可以同富血小板纖維蛋白、富血小板血漿或富血小板白細胞凝膠結合或作為自體刃厚皮移植的輔助治療方案[14,31]，可以取得更加理想的療效。此外，通過使用模擬生態位力學特性的載體基質，可以提高ESCs的性能，提供正常的生理環境，優化ESCs的再生功能[8]。

4.2 ESCs在慢性創面修復中的應用 隨著糖尿病、肥胖、血管性疾病和人口老齡化的增加，慢性創面患者也在增加。由于慢性創面的發病機制復雜，許多皮膚替代物和移植物治療已被證明無效。糖尿病創面存在高度蛋白水解的微環境，基質金屬蛋白酶的持續升高導致ECM降解、炎癥失調和創面閉合障礙[28]。聶剛等[32]探討了高濃度葡萄糖對小鼠ESCs增殖的影響，研究結果表明，高濃度葡萄糖可明顯抑制小鼠ESCs 的增殖。此外，慢性創面還會導致創面ESCs數量的減少，這些ESCs會因細胞增殖的增加導致被大量消耗而減少，并且由于微環境異常而導致表皮無法再生[14]。然而，如果在與ECM具有生物相容性的底物上富集ESCs制備CEAs，再將其移植到慢性創面上，上述負循環可能會被打破，不僅可以解決ESCs減少的問題，還能提供ECM成分來穩定創面微環境。此外，有研究通過離散數量的基因校正ESCs再生了功能表皮，促進了難愈性皮膚潰瘍的修復[33-35]。

4.3 ESCs在尿道再生中的應用 在動物模型中采用干細胞治療膀胱功能障礙、壓力性尿失禁、勃起功能障礙和尿道損傷已經取得了令人鼓舞的結果。皮膚移植已經成為尿道再生的一種方法，如口腔黏膜尿道成形術，形成的尿道組織適應有尿液暴露的濕潤環境，具有較高的機械強度，并能通過傷口床的供血迅速實現血管化；缺點是可供采集的口腔黏膜數量有限，可能會出現供區出血、感染、疼痛、腮腺管損傷、移植物攣縮和麻木等并發癥。從膀胱培養尿道上皮是另一種方法，但它是一種侵入性的過程，會造成額外的損傷。干細胞具有很強的分化能力，可以分化或轉分化成所有相關的細胞表型，并可以通過旁分泌活動調節再生過程，因此，干細胞療法是一種很有前途的自體組織缺乏的修復方法，并可以減少與移植相關的并發癥[36]。HFSCs能夠分化為尿道上皮樣細胞[37]，缺點是在移植后的幾年里會在尿道腔內生長毛發[38]。利用干細胞或組織工程自體管狀尿道的工程化移植物(有或沒有支架)已經進行了嘗試。Raya-Rivera等[39]報道，在5名尿道缺陷的男孩中使用管狀尿道，將膀胱組織的干細胞植入合成管狀網，制成組織工程管狀尿道,再將其移植到5名尿道缺陷男性患兒體內，在平均71個月的隨訪中，成功率達100%。因此，使用富含ESCs的CEAs被認為是修復功能性尿道的理想方法，它不僅提供不長毛發的上皮細胞，而且可以很容易地獲取而不會產生二次損傷[40]。

4.4 ESCs用于角膜緣干細胞缺乏的修復 角膜緣干細胞或其生態位的破壞或功能障礙可導致角膜緣干細胞缺乏（limbal stem cells deficiency, LSCD）。LSCD綜合征的特征是存在角膜上皮穩態失衡，隨后出現潰瘍、結膜組織持續炎癥和慢性疼痛,最終會因角膜混濁導致視力喪失[41-42]。目前的治療方法主要包括角膜緣干細胞的移植及角膜緣干細胞的培養和移植[43]。角膜上皮與皮膚有許多相似之處，如典型的分層上皮形態和干細胞標記物p63的表達。動物研究表明，皮膚ESCs可以部分甚至完全恢復角膜透明度，重建的角膜上皮表達特異性標志物KRT3、KRT12[38]。HFSCs在模擬角膜緣微環境條件下培養，可以成功地在體外重新編程為角膜上皮細胞，但相關臨床研究有限[43]。

4.5 ESCs用于白癜風的治療 白癜風是一種慢性自身免疫性皮膚脫色疾病，在全世界患病率約為0.5%～2.0%[44]，其特點是黑色素細胞流失，導致皮膚出現典型的非鱗狀白斑。目前白癜風的治療方法有限，主要有308 nm單色準分子燈或激光靶向光療、富血小板血漿及JAK抑制劑（如ruxolitinib乳膏）等治療[45]。皮膚移植是一種常見的治療方法，但經常導致皮膚表面不平整，且改善色素沉著的效果并不理想。CEAs聯合或不聯合黑色素細胞治療白癜風已應用于臨床。研究發現，當CEAs與一定數量的黑色素細胞共同移植后，與現有皮膚融合良好，顏色匹配良好，創面愈合而不產生瘢痕。此外，在50%～90%的患者中，應用無黑色素細胞的CEAs，然后暴露在陽光下，可以實現病變部位的重新著色[46]。毛囊和表皮作為皮膚組織中產生色素的細胞來源，被認為是治療白癜風的有利細胞來源。HFSCs被認為在白癜風患者病變皮膚的色素沉著中起重要作用[37]。

4.6 ESCs用于大皰性表皮松解癥的治療 大皰性表皮松解癥（epidermolysis bullosa，EB）是一種由層黏連蛋白5或膠原蛋白7缺失等基因突變引起的嚴重皮膚病，特點是即使是輕微創傷也會反復出現皮膚起泡，由此產生的慢性皮膚傷口總是會發展成復發性感染和瘢痕，這極大地損害了患者的生活質量。EB只有對癥治療，沒有治愈療法，治療旨在緩解癥狀和誘導更穩定的上皮再生，如針對遺傳缺陷用轉基因干細胞替代表皮?；蛑委煼椒ò◤幕虍惓；颊咧刑崛SCs，通過基因轉移在體外糾正突變，然后將細胞移植回患者皮膚中[47]。從結膜炎性EB患者身上提取帶有層黏連蛋白亞單位β3（LAMB3）基因的ESCs可成功完成表皮再生，經ESCs治療后患者體內可檢測到功能性層黏連蛋白-5，在移植區可檢測到正常的貼壁表皮，這表明利用ESCs進行基因治療是一種有前景的遺傳病治療策略。

4.7 ESCs在抗衰老中的應用 老年人的皮膚常伴有表皮層和真皮層不同程度的萎縮變薄[48]，伴隨著衰老，干細胞數量也不斷減少[49]。ESCs具有多向分化的能力，可通過調控皮膚的再生、維持其穩態以及影響各種體液因子的活性來調控衰老的過程。衰老與干細胞的數量下降導致組織修復功能衰退有關[50]。體內研究表明，來自干細胞的外泌體不僅可以加速創面愈合和血管生成，而且對皮膚年輕化至關重要[51]。ESCs可調控增加成纖維細胞的Ⅰ型膠原蛋白生成，在皮膚保濕、維持真皮致密度、減少皺紋形成、減輕皮膚松弛下垂等方面發揮作用。該領域的進一步研究可能是現代皮膚病學和美容學的重大突破。

5 展 望

由于ESCs數量多、容易獲得且在表皮形成和分化中具有多能性，在組織修復策略的研究中顯示出良好的前景。目前ESCs在實驗和臨床應用方面還存在許多問題，如技術復雜、成本高，且多能性或胚胎干細胞產品的不規范使用已被證明會導致新生惡性腫瘤，鞘內注射聯合干細胞會導致膠質神經增生病變等，但在未來，對ESCs的生物學知識和應用技術的安全性可能會提高，使ESCs在創面愈合和組織再生方面的應用更加廣泛。