線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ的結構與裝配路徑

葉飛宇， 魏亞康， 王桂鳳

(河南農業大學農學院，省部共建小麥玉米作物學國家重點實驗室， 鄭州 450046)

線粒體是廣泛存在于大多數真核細胞的半自主性細胞器，它通過氧化磷酸化合成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)，從而維持生物體的正常生命活動，因此被稱為“細胞動力工廠”。1905年，Merechowsky[1]最先提出線粒體“內共生起源”假說；1967年，Sagan[2]推測線粒體是內共生好氧菌產生，而葉綠體則是內共生藍綠藻(現在稱為藍細菌)獲得。目前，系統物種替換和多方法相互驗證表明，線粒體起源于包含多種海洋細菌和內共生菌的Alpha變形菌的Ⅱb分支[3]。線粒體功能喪失會導致多種新陳代謝異常疾病，例如雷氏病 (Leigh’s disease)、阿爾茲海默癥和癌癥等[4]。相較于人類，線粒體在植物生長發育過程中具有重要的作用，例如線粒體缺失會影響信號傳遞和種子敗育等[5]。

線粒體結構形態多樣，一般呈球形、桿狀或者絲狀結構(見Fig.1A，1B)[6]。它由雙層膜包被，從外到內依次為：外膜(outer membrane)、膜間隙(intermembrane space)、內膜(inter membrane)和基質(matrix)(見Fig.1C)。線粒體外膜是包圍在其外部的一層單位膜，成分與細胞膜類似，結構平整、光滑且具有通透性；而內膜則是向內褶疊形成嵴(cristae)，其通透性很低，許多物質不能自由通過而是需要借助特殊的轉運系統[7]。

Fig.1 Morphology and structure of mitochondria (A) Three different types of mitochondria in adult mouse cardiac tissues: Subsarcolemmal (SM), intermyofibrillar (IM) and perinuclear (PN), accompanied with myofibrils (m) and nucleus (n). Adapted from reference[6]. (B) Mitochondria of the developing maize endosperm cell. White arrow represents the mitochondrion. (C) A schematic diagram of mitochondrion. It comprises of the outer membrane (OM), intermembrane space (IMS), inter membrane (IM), cristae and matrix

細胞能量分子ATP主要通過在線粒體內膜進行的氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)反應產生。而OXPHOS由細胞核和線粒體基因組共同編碼的5個蛋白質復合物組成，它們在內膜建立并利用質子梯度；通過電子傳遞鏈(electron transport chain, ETC)將電子從還原型輔酶Ⅰ——煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)轉移至O2分子，最終生成H2O和ATP(見Fig.2)[8]。細胞生命活動所需的絕大部分能量都由線粒體電子傳遞鏈供給，而該系統從細菌到高等真核生物高度保守[5, 8]。這5種復合物在線粒體電子傳遞鏈中扮演著重要的角色，是氧化磷酸化必不可少的部分。任何一個復合物功能受損都會對電子傳遞鏈造成影響，從而導致細胞不能正常生長，產生不可逆的后果[4, 5]。此外，線粒體是生物合成的中心，參與核苷酸、脂肪酸、膽固醇、氨基酸、葡萄糖和亞鐵血紅素的合成[9]。

Fig.2 Schematic diagram of the mitochondrial OXPHOS system The mitochondrial OXPHOS system is located into the inner membrane (IM) connected by the intermembrane space (IMS) and matrix. It includes the proton-pumping enzymes ComplexⅠ (NADH-ubiquinone oxidoreductase), complexⅢ (cytochrome bc1) and Complex Ⅳ (cytochrome c oxidase), which generate a proton gradient (ΔΨ) that thereby drives F1FO-ATP synthase (Complex Ⅴ) to generate ATP. ComplexⅠ is the main entry point for electrons from NADH, whereas Complex Ⅱ is an additional entry point for electrons from the conversion from succinate to fumarate. The generated electrons are firstly used to reduce ubiquinone (Q) to ubiquinol (QH2). QH2 is subsequently used by complex Ⅲ to reduce cytochrome c, and Complex Ⅳ uses cytochrome c to reduce molecular oxygen. The dashed square in ComplexⅠ represents the CA domain specific to plants. Revised from references[5, 8]

1 線粒體復合物Ⅰ的結構

線粒體復合物Ⅰ(NADH-泛醌氧化還原酶)是氧化磷酸化系統(OXPHOS)的第1個也是最大最復雜的復合物，是驅動產生質子梯度并合成ATP所必需的組分[10]。除以單體形式發揮功能外，線粒體復合物Ⅰ還可以與復合物Ⅲ和復合物Ⅳ形成超級復合體，也稱為呼吸小體(respirasomes)[5, 11]。這些超級復合物的組成和豐度在不同的物種中差異較大，它們的生物學功能目前仍不清楚。作為超復合物的組成單元，線粒體復合物Ⅰ可以使用溫和去污劑解離卻不影響其催化活性[12]。

1.1 總體結構

冷凍電鏡(cryo-electron microscopy, cryo-EM)分析表明，細菌和真核生物的呼吸鏈復合物Ⅰ均呈現“L”型結構，由伸入基質的親水性臂和嵌入內膜的疏水性臂組成[8, 10, 13, 14]。細菌的復合物Ⅰ最簡單，由14個嚴格保守的核心亞基(core subunit)平均分配組成親水的外周結構域和疏水的膜結構域(見Table 1)。而人類的線粒體復合物Ⅰ由45個亞基組成，除上述14個核心亞基外，還有31個線粒體特異的額外亞基(supernumerary subunit)[15]。與此類似，植物線粒體復合物Ⅰ含有至少45個亞基，還包括植物特有的γ-碳酸酐酶(γ-carbonic anhydrase, γCA)[16, 17]。

Table 1 The core subunits of ComplexⅠ from bacterial, yeast, animals and plants

親水性外周臂由催化活性迥異的頂端NADH氧化脫氫酶模塊(N-module)和基部親水-疏水連接模塊(Q-module)組成，負責將電子分別輸入鐵硫簇(Fe-S cluster)和傳導至泛醌結合位點。與外周臂的氧化還原功能相耦合，疏水性膜臂(質子轉移模塊，P-module)通過構象變化將質子從線粒體基質矢量轉移到內膜[8]。質子運輸產生的能量梯度最終被復合物Ⅴ(F1FO-ATP合酶)利用生成ATP。因此，復合物Ⅰ的2個組成臂在功能和進化上相對獨立：外周臂催化氧化還原反應，而膜臂催化質子運輸。

1.2 親水性外周臂

嗜熱菌的頂端N-module含有3個核心亞基(Nqo1-3)，人類對應的3個成員泛醌氧化還原酶Fe-S蛋白1(NADH-ubiquinone oxidoreductase Fe-S protein 1, NDUFS1)、泛醌氧化還原酶黃素蛋白1(NADH-ubiquinone oxidoreductase flavoprotein 1, NDUFV1)和NDUFV2，以及植物的泛醌氧化還原酶Fe-S蛋白1(NADH-ubiquinone oxidoreductase Fe-S protein 1, NDUS1)、泛醌氧化還原酶黃素蛋白1(NADH-ubiquinone oxidoreductase flavoprotein 1, NDUV1)和NDUV2(見Table 1)。輔助因子黃素單核苷酸(flavin mononucleotide, FMN)在Nqo1的作用下進入呼吸鏈，并作為NADH氧化反應后的電子受體。而Q-module包含4個核心亞基[嗜熱菌Nqo4-6和9，人類NDUFS2、NDUFS3、NDUFS7和NDUFS8，以及植物NADH脫氫酶7(NADH dehydrogenase 7，NAD7m)、NAD9m、NDUS7和NDUS8]和鐵硫簇輔助因子。與動物不同，NDUFS2和NDUFS3對應的植物亞基NAD7m和NAD9m由線粒體基因組編碼。絕大部分鐵硫簇在Nqo3指導下形成氧化還原鏈，從而連接FMN至與膜臂結合處的泛醌結合位點。Nqo6和Nqo4協同進一步將電子轉移給泛醌。從進化上，親水外周臂的氧化還原活性來源于鎳鐵氫化酶([NiFe] hydrogenases)，并產生N-module和Q-module[8]。

1.3 疏水性膜臂

依據泛醌結合位點的位置，P-module進一步分為近端(PP)和遠端(PD)結構域。嗜熱菌的PP和PD結構域分別由5個(Nqo7、Nqo8、Nqo10、Nqo11和 Nqo14)和2個(Nqo12和Nqo13)組成。相對應地，人類PP和PD成分分別是NADH脫氫酶1(NADH dehydrogenase 1, ND1)-3m、NADH脫氫酶4大亞基(NADH dehydrogenase 4 large subunit, ND4Lm)、ND6m和ND4m、ND5m；植物則為NAD1-3m、NAD4Lm、NAD6m和NAD4m、NAD5m(見Table 1)。而動物和植物的上述7個亞基均由線粒體基因組編碼。Nqo12～14均與細菌鈉離子/質子逆向轉運蛋白(Multiple resistance and pH-related antiporter, Mrp)反向轉運復合物亞基MrpA和MrpD同源[8]，均含有14個保守的跨膜螺旋(transmembrane helices, TMHs)，其中10個高度保守的核心TMH沿膜臂對稱分布。這些螺旋能夠增加蛋白質的可塑性和電荷，從而有利于呼吸鏈中電子的運輸。Nqo8是P-module中最保守也是復合物Ⅰ中最獨特的亞基，位于外周臂和膜臂連接處結合泛醌。因此，Nqo8在電子傳遞鏈耦合機制中發揮重要作用。

1.4 植物特有的CA結構域

區別于動物，植物的PP結構域附著了一個朝向基質的球狀結構。它由3個與原核生物γ-碳酸酐酶(γ-carbonic anhydrase, CA)同源的蛋白質異源聚合組成，稱為CA結構域；它緊密結合在PP結構域中NAD2m/NU2M的表面[16, 17]。目前，植物復合物Ⅰ的CA結構域的生理功能仍不清楚，可能參與CO2從線粒體到葉綠體的轉移和再固定[19]。

2 線粒體復合物Ⅰ的裝配

2.1 動物線粒體復合物I的裝配

作為呼吸鏈中最大的成員，復合物Ⅰ由多個亞基和裝配因子組成的中間產物(intermediates)有序組裝而成(見Fig.3A)。近年來，利用復合物蛋白質組分析技術(complexome profiling)成功解析了動物復合物Ⅰ的完整裝配路徑[11]。此外，除組成亞基外，目前已鑒定出至少20個裝配因子參與復合物Ⅰ的生物合成。

Fig.3 The assembly pathway of mitochondrial ComplexⅠ (A) The assembly pathway of human mitochondrial ComplexⅠ. (B) The assembly pathway of Arabidopsis mitochondrial ComplexⅠ. The assembling modules are listed in the middle panel, as N, Q, ND1, ND2, ND4, ND5 and the plant-specific CA domain. Proteins marked in red indicate the characterized assembly factors. ？represents the currently unknown assembly factors. The diagram is summarized according to the references [11, 20]

2.1.1 ND2模塊 人類細胞通過氯霉素處理能夠誘導線粒體從頭(denovo)再生[21]。在早期，先形成包含核心亞基ND2的293 kD中間產物；其中還包括額外亞基NDUFC1、NDUFC2、線粒體復合物Ⅰ裝配因子(mitochondrial complex I intermediate assembly, MCIA)復合物[22]及細胞色素C氧化酶裝配因子1同源物(cytochrome C oxidase assembly factor 1 homolog, COA1)。除參與裝配外，COA1還負責新生(nascent)ND2的翻譯[23]。隨后，裝配因子跨膜蛋白126B (transmembrane protein 126B，TMEM126B)和TMEM186招募ND3形成一個357 kD的復合物。晶體結構表明，ND3、ND4L和ND6形成兩層直的螺旋穿過疏水膜臂[24]。與COA1類似，TMEM186則負責新生ND3的翻譯[23]。這些亞基也進入上述復合物形成PP-b中間產物[11]。

2.1.2 Q模塊 在線粒體重建早期，核心亞基NDUFS2、NDUFS3和額外亞基NDUFA5先形成約89 kD的復合物。在泛醌氧化還原酶復合物裝配因子3(NADH:ubiquinone oxidoreductase complex assembly factor 3, NDUFAF3)和NDUFAF4的作用下，NDUFS7和NDUFS8隨后加入、并形成穩定的170 kD的完整Q模塊[11]。而NDUFAF3、NDUFAF4和NDUFS3三者可以彼此相互作用，并進一步與NDUFS2互相作用[25]。相較于其他亞基，敲除NDUFA5能夠極大減少所有成員的豐度[26]，表明NDUFA5在Q模塊的形成和穩定中發揮重要作用。此外，裝配因子NDUFAF5通過對第73位精氨酸殘基(Arg-73)的羥基化和甲基化修飾從而穩定NDUFS7[27]；而NDUFAF7則介導NDUFS2第85位精氨酸殘基(Arg-85)的二甲基化修飾，從而招募NDUFS7進行裝配[28]。

2.1.3 ND1模塊 在裝配因子線粒體內膜結構域蛋白1的轉位酶(translocase of inner mitochondrial membrane domain-containing protein 1, TIMMDC1)的作用下，核心亞基ND1與Q模塊先形成273 kD的復合物；進一步招募額外亞基NDUFA3、NDUFA8和NDUFA13，形成約283 kD的中間產物，稱為Q/PP-a[11]。有趣的是，細胞敲除實驗發現，TIMMDC1與ND1模塊而非Q模塊的成員緊密相關[26]。而在復合物Ⅰ和中間產物并存的穩態下，TIMMDC1則存在于2個分子量為400 kD和440 kD的穩定復合物中，并且敲除TIMMDC1能徹底破壞ND1模塊而部分減少ND2模塊豐度[29]。因此，TIMMDC1在ND1模塊形成過程中發揮關鍵作用。此外，ND1模塊與ND2模塊組裝形成Q/PP復合物。

2.1.4 ND4模塊 在重建早期，額外亞基NDUFB5、NDUFB6、NDUFB10和NDUFB11先形成67 kD的中間產物；在裝配因子TMEM70、FAD依賴性氧化還原酶結構域(FAD-dependent oxidoreductase domain containing 1, FOXRED1)和ATP5SL的作用下，核心亞基ND4和額外亞基NDUFB1加入形成230 kD的復合物，稱為PD-a[11]。免疫共沉淀分析發現，FOXRED1能夠與ND1模塊的NDUFB10、NDUFS5、NDUFA10和NDUFA8以及Q模塊的NDUFS3和NDUFA5形成復合物[30]。TMEM70能夠與NDUFS5和Toll途徑進化保守信號介導因子(evolutionarily conserved signalling intermediate in toll-signalling, ECSIT)互相作用[31]；其功能喪失會過度積累中間產物Q/PP-a和Q/PP[32]。這表明,TMEM70通過裝配或穩定PD-a中間產物，從而參與P模塊的裝配。而敲除裝配因子ATP5SL則造成復合物Ⅰ缺陷，以及N模塊和PD復合物亞基急劇減少[26]。此外，ND4模塊能夠與ND2模塊組裝形成PP-b/PD-a復合物。

2.1.5 ND5模塊 在PD-a中間物生成的同時，核心亞基ND5和額外亞基NDUFAB1、NDUFB7、NDUFB3、NDUFB8、NDUFB9及NDUFB2組成約300 kD的中間產物，稱為PD-b[11]。然而，這些亞基的總分子量約為154 kD，僅是上述復合物分子量的一半。因此，推測PD-b復合物會形成二聚體，從而為繼續裝配ND4/PD-a模塊提供支架(scaffold)。而ND5亞基N-端的150個氨基酸能夠形成螺旋結構，從而將其錨定于PP模塊[24]。值得注意的是，ND5和ND4高度同源，但是ND4的N-端缺失上述螺旋結構。當然，這個300 kD復合物中也可能還包含多個裝配因子。但是，目前尚未鑒定到任何參與PD-b模塊裝配的因子。

2.1.6 N模塊 在重建早期，核心亞基NDUFV1和NDUFV2形成72 kD的復合物，而核心亞基NDUFS1和額外亞基NDUFA2則形成88 kD的復合物。隨后，這2個復合物結合形成160 kD的中間產物，稱為N模塊[11]。敲除NDUFA2會造成N模塊缺失和復合物Ⅰ活性喪失[26]。而額外亞基NDUFV3、NDUFS4、NDUFS6、NDUFA6、NDUFA7和NDUFA12則在N模塊與Q/P復合物裝配過程中進入復合物Ⅰ。目前，這些亞基以及N模塊如何招募進入的機制仍不清楚。有研究認為，Q/P復合物可能作為支架從而招募N模塊[33]。與嗜熱菌不同，真核生物的NDUFA12(B17.2)通過復制產生NDUFAF2(B17.2 L)[34]。而NDUFAF2作為裝配因子存在于N與Q/P裝配的中間產物，但不存在于完整的復合物Ⅰ[35]。在NDUFA12缺失的細胞中，NDUFS4會急劇增加、且NDUFAF2可以替代它整合入復合物Ⅰ全酶[26, 36]。然而，NDUFS4缺失會造成NDUFA12的完全缺失，而NDUFAF2卻顯著增加[36]。因此，NDUFAF2可能在穩定830 kD復合物Ⅰ裝配中間產物(缺失NDUFA12/B17.2和NDUFS4)中發揮重要作用。

2.2 植物線粒體復合物I的裝配

與大多數已知的真核生物類似，植物復合物Ⅰ也是線粒體呼吸鏈中最大的組分，但對其分子機制和裝配路徑的解析卻相對滯后[5, 8, 37]。利用復合物分離結合質譜分析技術已初步揭示了植物復合物I的裝配路徑[20, 38, 39]。最近，冷凍電鏡cryo-EM分析進一步驗證并豐富了植物復合物I的結構和裝配路徑[16, 17]。

2.2.1 N模塊 核心亞基NDUV1和NDUV2在未知裝配因子作用下形成120 kD的復合物，然后核心亞基NDUS1和額外亞基NDUA2加入并形成170 kD的N模塊，同時釋放裝配因子[20]。與動物不同，NDUS4、NDUS6和NDUA12則加入形成350 kD 的N模塊與Q模塊組裝的親水性外周臂。植物中也含有裝配因子NDUFAF2的直系同源基因(ortholog)(見Table 2)，但是其主要以單體形式存在[20]。因此，aNDUFAF2是否參與植物N模塊的組裝以及其分子功能仍需進一步研究。

2.2.2 Q模塊 與動物類似，植物核心亞基NAD7m/NDUFS2、NAD9m/NDUFS3和額外亞基NDUA5先組裝形成約80 kD的中間產物。植物中,這2個核心亞基仍然由線粒體基因組編碼。這表明,線粒體與其寄主共同進化，且在不同的譜系中獨立進化。核心亞基NDUS7能夠與NAD7m緊密互相作用[40]，進一步裝配形成120 kD的中間產物。然而，另1個核心亞基NDUS8如何招募并裝配形成Q模塊仍不清楚。最終，Q模塊與N模塊結合形成350 kD的親水性外周臂。此外，植物中,裝配因子NDUFAF3和NDUFAF4的直系同源基因在Q模塊中的作用，以及核心亞基NAD7m的翻譯后修飾尚待解析。

2.2.3 PP模塊 與動物不同，植物特有的γ-碳酸酐酶(γCA)能夠形成1個85 kD的中間產物。擬南芥基因組中含有5個成員：3個CAs(CA1、CA2和CA3)和2個CAL(CA1L和CA2L)。蛋白質互相作用和遺傳及結構分析表明，它們會形成1個由任意1個CAL和2個CAs組成的異源三聚體[16, 17, 19, 41]。隨后，核心亞基NAD2m和額外亞基NDUC2、P2和20.9 kD組裝形成200 kD的復合物。進一步，在植物特異的裝配因子GLDH的作用下[42]，核心亞基NAD3m、NAD4Lm和NAD6m進入形成400 kD的中間產物。最后，核心亞基NAD1m和額外亞基NDUA3、NDUA13結合形成450 kD的PP模塊。PP模塊接著與350 kD的N/Q裝配產物結合，最終形成約800 kD的亞復合物Ⅰ。

奇怪的是，動物中參與PP模塊形成的裝配因子在植物中幾乎完全丟失，僅有NDUFAF1在所有真核生物中保留[20]。因此，植物是否進化出新的PP模塊裝配的路徑，是否有新的裝配因子以及NDUFAF1直系同源蛋白質在植物中的作用都是很有趣的生物學問題。

2.2.4 PD模塊 PD模塊由于鑒定出的裝配亞基豐度過低，其形成路徑可能不精確[20]。而冷凍電鏡cryo-EM分析也很難獲得包含PD模塊的植物線粒體復合物Ⅰ全酶的晶體[16]。推測PD模塊的裝配可能通過兩步完成。首先,核心亞基NAD4m、NAD5m和額外亞基NDUB2、NDUB3、NDUB4、NDUB10、NDUB11、NDU10、P1形成約270 kD的中間產物；然后,該中間產物二聚化形成400 kD穩定的復合物。這與人類PD-b的二聚化相類似[11]，但是其真實的裝配路徑仍需進一步研究。最后，PD模塊與亞復合物Ⅰ組裝形成完整的線粒體復合物Ⅰ。

2.3 動植物線粒體復合物I裝配的差異

綜上所述，動物和植物線粒體復合物Ⅰ的裝配都采用模塊化、逐步組裝的路徑。盡管它們絕大部分模塊組成相同，但是也存在一些分化[11, 20]。首先，植物的N模塊和Q模塊組裝成完整的親水性外周臂后再與PP模塊結合；而動物的則是親水性外周臂的Q模塊先與PP模塊結合，組裝的最后階段結合N模塊。其次，動物會形成穩定的Q/P中間產物，而植物未組裝的親水性外周臂亞基可能是由于降解導致不穩定[43]。這表明，植物中缺乏穩定尚未與N模塊組裝的Q模塊的保護機制。這種差異可能是由植物NDUS6與動物NDUFS6相比，缺失N端結構造成的。而動物NDUFS6的N端能夠結合NDUFA12，并與Q模塊的亞基NDUFA9互相作用，從而介導N模塊與Q/P中間產物裝配[11]。此外，裝配因子NDUFAF2與NDUFA12高度同源，可以競爭性結合NDUFS6[44]。而植物中，NDUS6喪失了與NDUA12的結合能力，所以可能不依賴于NDUFAF2與NDUFA12進行組裝。

CA異源三聚體位于膜臂朝向線粒體基質側，是植物復合物Ⅰ區別于其他物種的最獨特標志[45]。CA結構域與膜臂的結合位置與動物NDUFA10在復合物Ⅰ全酶的空間位置相同[17]。CA是一類鋅酶，催化CO2水化的可逆反應，參與體內碳固定和pH調節[46]。與古細菌祖先基因單體相比，CA在植物復合物Ⅰ是異源三聚體[47]。結構分析表明，三聚體中含有1個CAL和2個CAs(其中一個是CA1，另一個是CA1或CA2)。它們通過N-端和C-端延伸結構域彼此相連，與植物特異的P2蛋白互相作用從而錨定至膜臂，并通過NAD6m的C-端與CA結合增強穩定性[17]。CAL比CA缺少了2個保守的組氨酸殘基活性位點，導致其鋅酶活性減弱。因此，植物復合物Ⅰ中，CA結構域是否具有催化活性，或者與藍藻CcmM類似參與HCO3-的固定運輸[48]，仍需進一步驗證。而CA敲除導致擬南芥種子滯育，但是活性位點突變的CA仍然能夠回復突變表型。這表明，CA酶活性與種子發育無關[19]。最近發現，藍藻光合作用復合物Ⅰ中也存在CA結構域，它能夠與質子泵亞基耦合[49]。因此，CA結構域在植物線粒體復合物Ⅰ中也可能發揮質子泵的功能。

此外，植物和酵母保守的PD模塊亞基NDU10/NUUM與動物的NDUFC1未見顯著同源性。結構分析表明，哺乳動物NDUFC1位于疏水性膜臂NDUFC2的邊緣[15]，而解脂耶氏酵母在相應的位置不存在亞基[24]。意外的是，綠豆中含有NDUFC1的同源蛋白且位于PP模塊[16]。同樣，動物的NDUFB1與植物和酵母的20.9 kD/NUXM也無同源性，且前者位于PD模塊，而后者位于PP模塊；并且20.9 kD的亞基是植物新進化獲得的[50]。植物特異的單次跨膜P2亞基能夠結合20.9 kD亞基，并與NAD2m和NDUC2共同形成脂質填充型腔(lipid-filled cavity)，可能用于裝載CA模塊[15]。此外，其他植物特異的亞基，例如P1、P3、P4、TIM22-1、TIM22-2和TIM22-4等，如何參與線粒體復合物Ⅰ的裝配仍待解析?？傊?，線粒體與其寄主協同進化，從而獲得或丟失亞基和裝配因子。

3 線粒體復合物Ⅰ的裝配因子

線粒體復合物Ⅰ的生物合成依賴于多個生物學過程，包括蛋白質輸入機制、膜插入酶(insertases)、分子伴侶和輔助因子結合蛋白質。特別是亞基組裝過程中需要許多精細且特異的蛋白質，稱為裝配因子。這些對線粒體行使功能至關重要，任何基因功能削弱都可能致死。目前，動物中已經發現至少20個復合物Ⅰ裝配因子，而植物中只發現4個(見Table 2)。

Table 2 Putative assembly factors in animals and plants

3.1 動物線粒體復合物I裝配因子

3.1.1 親水性外周臂 除上述已闡述功能的NDUFAF2、NDUFAF5 和NDUFAF7外，另有一些裝配因子(NUBPL、NDUFAF3和NDUFAF4)參與親水性外周臂的組裝。

與解脂耶氏酵母相同，人類的核苷酸結合蛋白(nucleotide binding protein-like, NUBPL)通過CXXC基序與鐵硫簇結合，敲除其導致N模塊亞基的急劇減少及450 kD膜臂復合物的積累[51, 52]；并且NUBPL突變直接造成復合物Ⅰ相關的線粒體疾病[53]。因此，NUBPL很可能在N模塊結合Q/P中間產物中發揮功能。

NDUFAF3和NDUFAF4任何一個突變都會造成復合物Ⅰ缺陷而引起的腦肌病、心肌病和新生兒線粒體疾病[25, 54]。其中，人肌肉細胞NDUFAF4突變導致線粒體復合物Ⅰ減少70%，卻積累2個可能是裝配停滯的中間產物。而NDUFAF3突變也會導致復合物Ⅰ受損、核心亞基NDUFS2或ND1組裝的中間產物缺失。因此，NDUFAF3在復合物Ⅰ裝配早期發揮作用，并且與NDUFAF4協同將早期裝配中間產物錨定于線粒體內膜。

3.1.2 MCⅠA復合物和PP結構域 線粒體復合物Ⅰ裝配因子復合物(mitochondrial ComplexⅠ intermediate assembly complex, MCIA complex)由7個核心因子組成，包括NDUFAF1、ECSIT、脂?；o酶A脫氫酶9(acyl-CoA dehydrogenase 9, ACAD9)、TMEM126B、TMEM186、COA1以及TIMMDC1。這些裝配因子之間相互依賴、相互作用，協同介導線粒體復合物Ⅰ膜臂PP結構域的組裝。研究發現，NDUFAF1和ECSIT先與內膜上的TMEM126B結合，隨后再與二聚化的ACAD9結合，最后與TIMMDC1結合形成一個完整的復合物，從而起始PP以及與Q的組裝。在人類中，MCIA復合物參與線粒體復合物Ⅰ從早期至后期(200～700 kD)的裝配進程[22]，任何一個裝配因子的突變都可能會導致疾病產生。

NDUFAF1 最先，真菌紅色面包霉(Neurosporacrassa)中鑒定到1個復合物Ⅰ裝配中間產物相關30 kD蛋白質(ComplexⅠ intermediate associated protein of 30 kD, CIA30)；CIA30是膜臂合成的必需因子，其突變會導致裝配停滯產物的積累[55]。人類的直系同源蛋白NDUFAF1也參與復合物Ⅰ的生物合成。利用溫和去垢劑十二烷基-β-D-麥芽糖苷(N-Dodecyl-β-D-maltoside, DDM)處理線粒體，NDUFAF1出現在約600 kD和700 kD的中間產物[56]。而毛地黃皂苷(digitonin)處理發現，NDUFAF1存在于460 kD和830 kD的裝配復合物內，其突變造成ND2和460 kD中間產物的缺失[57]。這表明,NDUFAF1在裝配和穩定460 kD復合物中發揮重要作用。同時，NDUFAF1是造成人類線粒體疾病的關鍵致病基因位點之一；其突變導致線粒體復合物Ⅰ裝配受阻，并異常累積NADH及線粒體活性氧(mitochondrial reactive oxygen species, mROS)誘發細胞凋亡[56-59]。

ECSIT在先天免疫系統Toll和IL-1途徑中，ECSIT作為銜接蛋白質連接TRAF6和MEKK-1激活NF-κB[60]。小鼠中，ECSIT敲除導致胚胎在發育早期死亡[61]。后續研究發現，ECSIT定位于線粒體，且與裝配因子NDUFAF1和核心亞基NDUFS3互相作用，形成500～850 kD的復合物；抑制ECSIT急劇削弱復合物Ⅰ裝配、破壞其功能[26, 29, 62]。在巨噬細胞中，敲除ECSIT造成生物能量代謝轉變、復合物Ⅰ缺失，并誘發線粒體降解和mROS積累；ECSIT通過與線粒體質控系統成員互相作用調控線粒體自噬[63]。最近研究發現，ECSIT通過調控神經元的mROS和線粒體自噬抑制阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease)[64]。

ACAD9 根據序列的保守性，脂酰輔酶A脫氫酶9(acyl-CoA dehydrogenase 9, ACAD9)可能參與線粒體β-氧化路徑。ACAD9在心血管、骨骼肌、大腦、腎和肝中表達豐度較高[65]；體外生化分析發現，ACAD9特異性催化長鏈不飽和脂肪酸，參與維持膜的完整性和結構[66]。人類ACAD9缺陷會引發小腦中風、肝功能失活、低血糖、心肌病和慢性神經功能障礙，而且ACAD9與傳統的長鏈脂酰輔酶A脫氫酶生理功能不同、不能相互替代[67]。ACAD9定位于線粒體內膜上、與NDUFAF1和ECSIT互相作用，敲除ACAD9會導致NDUFAF1和ECSIT水平下降，從而影響線粒體復合物Ⅰ的組裝[68]。ACAD9是一個FAD結合蛋白質，而補充核黃素可以顯著減輕ACAD9缺陷患者的癥狀[69]。有趣的是，ACAD9具有催化長鏈不飽和脂肪酸的活性，但是該酶活性是否與復合物Ⅰ的功能相關仍存在較大爭議[70, 71]。

TMEM126B線粒體跨膜蛋白TMEM126B與裝配因子NDUFAF1、ECSIT和ACAD9共遷移，形成復合物Ⅰ裝配所需的MCIA復合物[22]。在哺乳動物基因組中，TMEM126B與另一線粒體內膜蛋白質TMEM126A相鄰，可能是由基因復制產生[72]。而TMEM126B僅存在于哺乳動物中，是新進化的復合物Ⅰ裝配因子[73]。TMEM126B功能削弱會導致成熟復合物Ⅰ和氧消耗量減少[22, 74]。與其他MCIA成員缺陷相比，TMEM126B突變患者表現出較輕的癥狀，包括運動不耐受、肌肉無力和肌病[74]。此外，TMEM126B能夠與其他裝配因子共同與復合物Ⅰ的其他亞基ND1、ND2和Q模塊互相作用[75]。

TMEM186 線粒體復合物蛋白組表明，TMEM186能夠與MCIA復合物共遷移[11]。NDUFAF1免疫沉淀和質譜聯用發現，TMEM186與所有已知MCIA復合物成員共富集[29]。TMEM186插入線粒體內膜，其N-端和C-端伸入基質。敲除TMEM186會適當降低復合物Ⅰ及其超級復合物的豐度和活性、而其他復合物幾乎不受影響；同時，NDUFAF1、ECSIT和ACAD9仍然定位于內膜[29]。因此，TMEM186與MCIA復合物的膜定位無關。TMEM186富集于約450 kD復合物，其中富含MCIA裝配因子。盡管如此，TMEM186并非復合物Ⅰ組裝的必需因子[29]。

COA1/MITRAC15 線粒體細胞色素c氧化酶翻譯調控裝配中間因子15(mitochondrial translation regulation assembly intermediate of cytochrome c oxidase 15, MITRAC15)是酵母COA1的直系同源蛋白質，其參與線粒體復合物Ⅳ的裝配[76, 77]。然而，除了復合物Ⅳ的亞基外，COA1還能與線粒體復合物Ⅰ亞基NDUFB8免疫共富集，并且抑制其表達能夠特異性降低這兩個復合物的功能[11, 77]。因此，COA1可能在復合物Ⅰ和Ⅳ的裝配中發揮雙重功能。最近研究發現，COA1與TMEM186共富集，敲除COA1導致復合物Ⅰ豐度降低50%、但不影響復合物Ⅳ及其他復合物[29]。COA1還能夠與NDUFAF1、ECSIT和ACAD9共富集，能夠整合并穩定450 kD含有MCIA的中間產物以及ND2模塊[29]。

TIMMDC1 氨基酸同位素標記結合質譜實驗發現，TIMMDC1(C3ORF1)和TMEM126B共存于復合物Ⅰ裝配中間產物[74]。TIMMDC1和額外亞基NDUFA11同源，屬于Tim17-23家族，可能參與復合物Ⅰ嵌入內膜[31]。在復合物Ⅰ早期組裝階段，TIMMDC1能夠與許多ND1和Q模塊的亞基互相作用[11]。細胞系敲除相關性分析表明，TIMMDC1與ND1模塊亞基NDUFA3、NDUFA8和NDUFA13高度相關而非Q模塊[26]。TIMMDC1與MCIA復合物緊密相關，并參與ND2模塊的裝配[31]。與已知MCIA復合物成員不同，TIMMDC1功能失活不會影響任何其他成員的豐度[29]。因此，TIMMDC1參與ND1模塊的生物合成，而MCIA復合物參與ND2模塊的裝配。

3.1.3 PD結構域 與PP結構域相比，目前已鑒定負責PD結構域裝配的因子仍十分有限，僅包括FOXRED1、ATP5SL和DMAC1。

與假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)DauA同源，FOXRED1屬于依賴于FAD的氧化還原酶，廣泛存在于古細菌、細菌和真核生物中[78]。FOXRED1突變會導致人類復合物Ⅰ缺陷的線粒體疾病，它與ND1、ND2和ND4模塊的亞基互相作用[30, 53]。小鼠敲除FOXRED1也同樣造成復合物Ⅰ缺陷的癥狀，可以作為研究雷氏病(Leigh’s disease)的動物模型[79]。

敲除ATP5SL或DMAC1特異性造成復合物Ⅰ缺陷和其亞基豐度急劇減少[26]。免疫沉淀和質譜聯用發現，ATP5SL和DMAC1分別與ND4和ND5模塊的亞基互相作用。線粒體復合物蛋白組表明，它們與ND4模塊的亞基組成特異230 kD中間產物[11]。盡管已有證據表明，ATP5SL和DMAC1參與PD結構域的組裝，但是它們分別還是協同負責ND4和ND5模塊的裝配仍不清楚。

3.2 植物線粒體復合物I裝配因子

相較于動物，同源基因鑒定發現，植物中含有保守的N和Q模塊的裝配因子，而負責P模塊裝配的因子幾乎全部丟失(見Table 2)。目前，植物中已鑒定復合物Ⅰ裝配因子僅有4個。

3.2.1 GLDH 植物中，L-半乳糖酸-1,4-內酯脫氫酶(L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase，GLDH)是催化抗壞血酸生物合成的最后一步。GLDH定位于線粒體內膜，能夠通過電子傳遞鏈將電子轉移給細胞色素c[80]。GLDH在線粒體中參與形成3個具有酶活性、分子量分別為420 kD、470 kD和850 kD的復合物[81]。其中，850 kD的復合物是含有親水性外周臂的裝配較完整的復合物Ⅰ；而470 kD的復合物是復合物Ⅰ的疏水性膜臂。GLDH敲除導致復合物Ⅰ缺失、200 kD中間產物的積累而400 kD和450 kD的復合物丟失，表明GLDH負責復合物Ⅰ膜臂的裝配[42]。此外，GLDH與B14.5b和15 kD亞基互相作用，阻止植物特有的P1進入PP，GLDH解離后其再與PD組裝[17]。

3.2.2 鐵硫蛋白INDH 植物NADH脫氫酶所需的鐵硫蛋白(iron-sulfur protein required for NADH dehydrogenase, INDH)與解脂耶氏酵母IND1以及人類NUBPL直系同源，是進化上高度保守的鐵硫蛋白[82]。INDH功能喪失導致復合物Ⅰ缺失及650 kD復合物的積累。indh突變體孢子體缺陷會影響雌雄配子體發生，突變體種子可以在蔗糖培養基中萌發但生長遲緩。INDH缺失會造成線粒體翻譯效率急劇下降，特別是線粒體編碼的核心亞基NAD6m和NAD7m。因此，與酵母和人類相比，植物INDH可能具有參與線粒體復合物Ⅰ裝配和線粒體翻譯調控的雙重功能。

3.2.3 復合物Ⅰ裝配因子1(CIAF1) 擬南芥復合物Ⅰ裝配因子CIAF1屬于線粒體亮氨酸-酪氨酸-精氨酸(a Leu, Tyr, and Arg motif, LYR)結構域蛋白質，該家族廣泛分布于酵母、動物和植物[83]。其中，擬南芥LYR成員B14和B22以及酵母和人類的LYRM4/ISD11是復合物Ⅰ的額外亞基，參與鐵硫簇的生物合成[20, 84]。CIAF1功能喪失導致復合物Ⅰ和超級復合物Ⅰ+Ⅲ缺乏、復合物Ⅰ裝配停滯在650 kD和800 kD的中間產物。此外，CIAF1特異與23 kD基質蛋白質蘇氨酸-酪氨酸-賴氨酸-酪氨酸1(a Thr, Tyr, Lys, and Tyr motif, TYKY1)互作參與親水性外周臂的裝配。

3.2.4 衣藻NDUFAF3 在衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)光合作用系統Ⅱ效率降低的突變體pgrl1背景下，通過插入突變篩選獲得了3個線粒體復合物Ⅰ受損的突變體[85]。其中，突變體M2是由于人類線粒體復合物Ⅰ裝配因子NDUFAF3的直系同源蛋白質cNDUFAF3功能失活導致。與人類類似，衣藻cNDUFAF3影響Q模塊而非N模塊亞基的豐度。

3.3 線粒體復合物I裝配路徑的進化

盡管目前已鑒定功能的植物線粒體復合物Ⅰ裝配因子仍較少，但是通過與動物直系同源基因分析獲得了多個潛在的保守裝配因子(見Table 2)。然而，這些因子幾乎都是參與親水外周臂N和Q模塊而非疏水膜臂的裝配。除廣泛保守來源于最后真核生物共同祖先(last eukaryotic common ancestor，LECA)的NDUFAF1外，其他參與膜臂PP模塊裝配的因子都僅存在于蜷絲生物(Filozoa)或者后生動物亞界(Metazoa)[73]。表明這些裝配因子在進化上有更新的起源，出現在植物界(viridiplantae)分支之后。然而，有些復合物Ⅰ亞基僅出現在植物、真菌和變形蟲中，但在動物中缺失[50]，它們可能是祖先亞基。以PP模塊為例，植物裝配中間產物包含多個祖先亞基，而后生動物中含有多個新起源的成員，表明植物PP模塊的裝配可能通過原始祖先路徑完成。相比之下，在進化過程中，后生動物丟失了祖先亞基，從而需要新的裝配因子參與組裝PP模塊。

綜合上述復合物Ⅰ亞基的生化與遺傳功能、系統進化分支信息，植物可能沿用了古老祖先的裝配路徑，而動物則通過獲得新的亞基或者裝配因子進化出新的裝配路徑[11, 20]。親水外周臂的亞基和所需的裝配因子在真核生物中絕大部分保守。在真核生物繁衍輻散之后，哺乳動物親水外周臂僅增加了額外亞基NDUFV3[86, 87]。而親水外周臂相關的裝配因子都來源于真核生物輻散之前(見Table 2)[73]。然而，疏水膜臂在進化中存在諸多變化。例如，后生動物中新獲得了額外亞基NDUFB1、NDUFC1、NDUFA10和NDUFB6，同時丟失了CA、20.9 kD/NUXM和NDU10/NUUM亞基，從而其裝配機制也發生了全新變化。與此類似，植物線粒體復合物Ⅲ的組裝也采用了祖先的裝配路徑，而動物則進化出了新的裝配機制[88, 89]。這表明，動物在進化過程中可能面臨更多新的環境選擇壓力，從而直接或間接加速了其與線粒體的共進化，而植物線粒體則更多保留了原始祖先的特征。

4 問題與展望

真核生物線粒體起源于超過18億年前的一次內共生事件產生的LECA，并且隨著寄主細胞共進化，從而產生形態結構與生物合成的多樣性。近年來，隨著生化與蛋白質組和結構生物學等先進分析手段的應用，已極大地拓展并加深了對線粒體結構和功能的認識。但是，目前線粒體進化和復合物裝配路徑的諸多方面仍不清楚，亟待解決。

復合物Ⅰ是線粒體OXPHOS反應產能的第1個、也最大和最復雜的催化酶功能單位。盡管在一些單細胞真核生物進化中伴隨著復合物Ⅰ的丟失[90]，但是多細胞真核生物復合物Ⅰ的功能削弱將會造成供能不足、生長發育嚴重受阻。然而，寄生雙子葉植物歐洲槲寄生(Viscumalbum)可以在缺失復合物Ⅰ的條件下正常生長，可能是通過呼吸鏈重新組裝的補償效應實現的[91-93]。因此，線粒體復合物Ⅰ進化研究的關鍵問題是：在復合物Ⅰ丟失的多細胞真核生物中，除交替氧化酶途徑和呼吸鏈重排外，是否存在其他新的能量補償途徑，缺失復合物Ⅰ的呼吸鏈是否具有非傳統產能以外的代謝功能；在呼吸鏈正常的真核生物中，是否存在這些重排超級復合物，以及它們與含有復合物Ⅰ的超級復合物之間的關系，在復合物Ⅰ受損時它們是否具有補償效應。其次，與動物相比，植物線粒體復合物Ⅰ晶體結構的完整性和分辨率仍需進一步提高，并且植物復合物Ⅰ相關超級復合物的晶體結構解析，將為植物線粒體復合物Ⅰ的功能研究提供重要分子基礎。其次，植物復合物Ⅰ的裝配路徑及相應的裝配因子仍知之甚少，以及其裝配路徑是否與動物保守、裝配因子的生物學功能及其進化是后續研究的重點。最后，線粒體復合物Ⅰ的亞基由核與線粒體共同編碼，組裝過程中的協同調控所需的順行與逆行信號感知與傳導也是重要的研究內容。這些問題的解決，都將為未來如何改造和利用線粒體呼吸鏈分子機器，并高效生物產能提供理論依據。