基于線粒體pcox1分析蛇蛔蟲種系發育關系*

李文超 龔騰芳 李 芬 劉 偉

(湖南農業大學動物醫學院，長沙 410128)

蛇蛔蟲是蛇常見的一種寄生線蟲，主要寄生在蛇的腸道和胃，引起慢性消耗性疾病(周成艷等，2019)。蛇蛔蟲在世界范圍內普遍存在，對蛇的危害較大，能夠引起蛇的免疫力下降、食欲不振，消瘦(王挺等，2013；張韜等，2015)，寄生在消化道會引起嚴重的機械性損傷(黃瀟航等，2020)，多量寄生時甚至會引起蛇的死亡(黃瀟航等，2021)。近些年，由于蛇類藥用價值極大，市場需求量增大，蛇蛔蟲逐漸引起人們的注意。因此正確鑒定蛇蛔蟲不僅具有重要的學術價值，對蛇蛔蟲的防控也具有重要意義。

據現有資料報道，可感染蛇的蛔科線蟲分為4個屬(多宮屬Polydelphis、羽蛔屬Orneoascaris、六宮屬Hexametra、蛇蛔屬Ophidascaris)，其中以蛇蛔屬的絲狀蛇蛔線蟲Ophidascarisfilaria最為普遍(周成艷等，2019)。目前對于蛇蛔蟲的鑒定主要依賴于地理分布和交合刺與輸精管的長度比較，然而，這種長度在一些物種還沒有報道，例如莫雷利亞蛇蛔線蟲、無尖蛇蛔線蟲和絲狀蛇蛔線蟲(Zhaoetal.，2021)。線粒體DNA具有特殊的雙鏈結構、遺傳穩定性高、母系遺傳等優勢，在研究物種的遺傳結構和系統發育關系適用于分子標記(郝桂英等，2017；龔騰芳等，2021)。據文獻報道利用cox1基因進行進化分析，認為蛇蛔蟲與盲囊屬蛔蟲Contracaecum的親緣關系較近(吳有陵等，2014)；基于cox1構建的系統發育樹發現蛇蛔蟲與禽蛔蟲Ascaridiagalli聚在一起(陳文承等，2011)；選用核糖體基因ITS及5.8 S基因進行序列分析得到蛇蛔蟲與人蛔蟲相似度較高(鄭姣妹等，2012)，與人蛔蟲處于同一進化樹分支。蛇蛔蟲種類繁多，但目前國內外關于蛇蛔蟲的分子生物學分類鑒定的研究甚少，蛇蛔蟲目前還缺乏系統性的研究。

本研究對采自湖南省3個地區的11 株蛇蛔蟲分離株pcox1基因進行PCR擴增和序列分析，對分離株的種類進行鑒定。同時基于pcox1基因，構建蛇蛔蟲與其他蛔蟲的種系發育關系，從而明確蛇蛔蟲線粒體cox1基因是否成為理想的種間遺傳標記，為今后蛇蛔蟲的分子遺傳和種群遺傳結構研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲體樣本

本次研究所獲得的蛔蟲樣品來自3個地區的烏梢蛇的肝臟部位(長沙1條、常德1條、衡陽1條)，共獲得湖南長沙4條蛔蟲分離株(CS1-4)、常德4條蛔蟲分離株(CD5-8)、衡陽3條蛔蟲分離株(HY9-11)。

1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶及相關試劑購自寶生物工程(大連)有限公司，蛋白酶 K購自Merck公司，DNA提取試劑盒等耗材購自Promega公司。

1.3 基因組DNA提取

用超純水反復沖洗蟲體4～5次，將每條蟲體單獨放于無菌1.5 mL Eppendorf管中，用無菌的眼科剪將蟲體組織剪碎，加入200 μL的GT buffer充分研磨，再加入20 μL蛋白酶K混勻，放于56 ℃的水浴箱中消化4 h(每30 min混勻1次)。消化完成的蟲體懸液使用組織DNA試劑盒提取總基因組DNA。

1.4 PCR擴增

按照文獻(Gasseretal.,1998) 方法合成1對引物，即JB3:5′-T T T T T T G G G C A T C C T G A G G T T T A T-3′，JB4.5:5′-T A A A G A A G A A C A T A A T G A A A A T G-3′。引物由北京擎科生物有限公司合成。PCR擴增體系為25 μL，Premix TaqTM 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL、上下游引物(100 pmol/μL)各0.5 μL、模版DNA 1 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性、55 ℃退火、72 ℃延伸均為30 s，共循環38次;最后72 ℃延伸5 min。

1.5 pcox1基因測序及分析

PCR陽性產物由北京擎科有限公司雙向測序。用DNAMAN 7.0對獲得的pcox1序列進行對比、剔除和對齊，并與GenBank收錄的其他蛇蛔屬線蟲cox1基因進行對比。用 DNAStar 軟件中的MegAlign程序進行基因同源性分析；利用DnaSP 5.0軟件計算單倍型數、核苷酸多樣性、單倍型多樣性和平均核苷酸差異；以雞蛔蟲Ascaridiagalli(KT613902)為外群，選用Kimura-2-parameter模型，用Mega 7.0 程序中的鄰接法(Neighbor-joining method,NJ)繪制種系發育樹，自舉檢驗1 000次。

2 結果

2.1 剖檢結果

將3條死亡烏梢蛇進行解剖，結果顯示：心臟、左右雙肺、胃腸、腎臟等處均無明顯病變，肝臟表面有異常凸起，大小不一，囊膜灰白色(圖1-A)，打開每個凸起里面都有一條長條狀線蟲(圖1-B、C)。完整蟲體長度為4～6 cm。將蟲體進行鏡檢，雌蟲：尾端呈現鈍圓椎形(圖2)，頭端細長(圖3)，陰門位于蟲體中央偏后(圖2)。此次實驗未收集到雄蟲。

圖1 蛇肝臟臨床解剖圖Fig.1 Clinical anatomy of snake liverA．肝臟表面4個未破損包囊；B.打開的包囊；C.肝臟表面蛔蟲A.Four undamaged cysts on the liver surface；B.Open cysts;C.Liver surface roundworm

圖2 雌蟲尾端形態特征Fig.2 Morphological characteristics of female caudal end

圖3 雌蟲前端形態特征Fig.3 Morphological characteristics of female front end

2.2 PCR擴增分析結果

11株蛇蛔蟲分離株擴增的片段大小均為400 bp左右，未見特異性條帶，空白對照為陰性(圖4)。

圖4 蛇蛔蟲線粒體pcox1擴增產物的凝膠電泳圖Fig.4 Analysis of PCR products of mt DNA pcox1 of Ophidascaris sp.isolates by agerose gel electrophoresisM:DL2000 DNA 標志物;N:陰性對照;1-11:CS1-4、CD5-8、HY9-11M:DL2000 DNA marker;N:Negative control;1-11:PCR products from CS1-4,CD5-8,HY9-11,respectively

2.3 pcox1基因的多樣性

經過對比校正后，11條蛇蛔蟲分離株擴增出長度為398 bp的pcox1序列，A+T堿基含量為64.00%～64.30%，C+G堿基含量為35.70%～36.00%。測序獲得的11條序列已經上傳至GenBank數據庫，登錄號為MZ960363～MZ960373。11株蛇蛔蟲pcox1基因堿基序列相似度很高，為97.30%～100.00%，堿基變異率為0.00%～2.70%，主要為堿基轉換或顛換，未發現堿基的缺失或插入(圖5)。本研究所獲pcox1基因與GenBank收錄的絲狀蛇蛔線蟲相似度很高，為97.00%～99.30%，與異尖科(Anisakidae)其他線蟲對應的pcox1基因序列同源性為77.60%～87.50%。利用DnaSP 5.0軟件對11株蛇蛔蟲pcox1基因進行單倍型分析，共檢測到9種單倍型，堿基序列總單倍多樣性和核苷酸多樣性分別為0.924 ± 0.003和0.008 ± 0.009，平均核苷酸差異為3.255，多態性位點10個。

2.4 種系發育分析

基于pcox1基因構建系統發育樹，結果見圖6。湖南省3個地區11株蛇蛔蟲與GenBank收錄的中國絲狀蛇蛔線蟲分離株和Ophidascarissp.聚類形成一分支，且3個地區的蛇蛔蟲分離株隨機分布；絲狀蛇蛔線蟲與盲囊屬蛔蟲親緣性最近，與其他異尖科線蟲所屬的分支相隔較遠，可與其他異尖科線蟲相鑒別。

3 討論

蛇蛔蟲是對蛇類危害嚴重的寄生蟲之一，感染蛇后可引起嚴重的臨床癥狀，甚至死亡(Zhouetal.，2021)。當感染期蛔蟲卵被宿主吞入，會在小腸內孵化成幼蟲。幼蟲通過分泌透明質酸酶和蛋白酶，侵入到宿主的小腸粘膜和粘膜下層，鉆入腸壁小靜脈或淋巴管，經靜脈進入肝臟。所以此次實驗在肝臟表面發現的蛔蟲，可能系蛔蟲幼蟲移行。蛇蛔蟲的有效鑒定是對蛇蛔蟲病進行預防的前提，但傳統的形態學難以對形態相似的蟲株進行準確的鑒定。隨著分子生物學的飛速發展，采用 PCR方法對寄生蟲線粒體基因進行擴增和分析，為寄生蟲分類與鑒定提供了有力的工具(王旭等，2020)。

大量研究表明，cox1可作為線蟲遺傳分子標記(郝桂英等，2017；程文杰等，2020;王旭等，2020)。本文通過對湖南省部分地區(長沙、常德和衡陽)蛇蛔蟲線粒體pcox1基因序列分析蛇蛔蟲遺傳進化情況，結果發現，擴增得到的11株蛇蛔蟲pcox1基因序列大小為398 bp，基因種內遺傳變異率97.30%～100.00%，其種內遺傳變異為0.00%～2.70%。本研究獲得蛇蛔蟲pcox1序列與GenBank收錄的絲狀蛇蛔線蟲同源性為97.00%～99.30%，與其他異尖科線蟲差異較大。結果表明本實驗11株湖南蛇蛔蟲分離株樣品均為絲狀蛇蛔線蟲，且絲狀蛇蛔線蟲pcox1基因序列種內差異較小，種間差異大。衡量一個種群線粒體遺傳變異的兩個重要指標為單倍型多樣性和核苷酸多樣性。單倍型多樣性可以隨著一個堿基改變在短時間內快速上升，但核酸多樣性影響卻很小，因此核苷酸多樣性更適用于衡量物種的遺傳多樣性(郝桂英等，2015)。對于大多數生物來說，核苷酸多樣性大于0.001可認為有較大變異。本研究中，11株絲狀蛇蛔線蟲分離株pcox1基因序列單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.924 ± 0.003和0.008 ± 0.009，結果表明絲狀蛇蛔線蟲pcox1基因遺傳變異程度低。

基于11條絲狀蛇蛔線蟲pcox1基因序列構建的種系發育樹顯示，所有的湖南分離株與GenBank收錄的絲狀蛇蛔線蟲聚合為同一分支，不同地區源(長沙、常德、衡陽)分離株樣品在分支上為隨機分布，暗示湖南絲狀蛇蛔線蟲的進化速率不受地區差異的影響。絲狀蛇蛔線蟲分支與其他異尖科蛔蟲分支相隔較遠，可以得到很好的鑒定。絲狀蛇蛔線蟲所處分支與盲囊屬蛔蟲的親緣關系最近，這與吳有陵等(2014)結果相同。陳文承等(2011)通過pcox1基因序列認為蛇蛔蟲與雞蛔蟲親緣關系較近，鄭嬌妹等(2012)分析得到蛇蛔蟲與人蛔蟲相似度較高，本研究結果顯示絲狀蛇蛔線蟲分支與人蛔蟲、雞蛔蟲分支相隔較遠，揭示本研究分離株與其他兩人分離的蛔蟲樣品互為不同物種，同時表明湖南地區蛇蛔蟲病感染復雜多樣和種類鑒定空白，準確的鑒定對蛇蛔蟲的防治具有重要的意義。

綜上所述，本研究利用線粒體pcox1基因對湖南3個地區蛇蛔蟲分離株進行種群鑒定和遺傳結構研究。結果表明11株蛇蛔蟲樣品均為絲狀蛇蛔線蟲，基于pcox1基因分析揭示絲狀蛇蛔線蟲種內相對保守，種間差異較大，能夠作為絲狀蛇蛔線蟲的遺傳分子標記。本研究為蛇蛔蟲的分類鑒定以及流行病學調查和種群遺傳結構奠定了基礎。