基于液—固交替培養的水曲柳快速微繁系統研究

齊鳳慧 王雯萱 劉 林 湯明碩 宋飛翔 詹亞光*

（1. 東北林業大學東北鹽堿地植被恢復與重建教育部重點實驗室，哈爾濱 150040；2. 東北林業大學生命科學學院，哈爾濱 150040）

水曲柳（Rupr.）為木犀科（Oleaceae）白蠟樹屬（）高大落葉喬木，為我國東北珍貴的“三大硬闊”之一。在造林方面可與多種針葉闊葉樹形成針闊混交林，利于提高森林生態系統穩定性，有利于恢復森林植被多樣性。水曲柳具有材質堅硬，紋理通直，花紋美觀的特點，因其生產出的木材具有優美的質感而備受推崇，常被用于家具制造和作為特殊的建筑材料。傳統的水曲柳繁殖是以種子繁殖為主，但其種子屬于深休眠類型，休眠期高達218 d，生產周期長，給育苗生產帶來了一定的困難。水曲柳的嫁接和扦插等繁殖技術受到穗條數量少、位置效應、采枝母樹的年齡效應的影響，限制了規?；瘧?。水曲柳的組織培養報道大多集中在胚的離體培養及體胚的誘導，而體胚誘導易發生畸形胚且成苗率較低。雖然近些年來對水曲柳組培微繁的研究有一些報道，但是這些研究結果還遠遠不能應用于規?；a，而且水曲柳在繼代培養中往往都會出現頂芽休眠、葉片脫落、莖部出現白粉狀，基部形成大片愈傷等老化現象，這也是目前利用組織培養規?；敝乘缒狙芯康钠款i。

本研究針對水曲柳組培苗老化現象，通過對誘導條件、培養條件、萌發芽離體繁殖等因素的分析，探索一種快速打破水曲柳組培苗芽休眠并成功離體繁殖的方法，解決水曲柳組培苗易老化、易進入休眠狀態的問題，為水曲柳種苗的快速繁殖提供可持續的循環培養技術。

1 材料與方法

1.1 水曲柳組培苗腋芽的萌發

將莖部木質化、頂芽休眠、葉片老化的水曲柳組培苗，切去根部，去除枯葉，接入添加0.4、0.6、0.8 mg·LTDZ 的WPM 固體培養基中，其中添加蔗糖30 g·L，瓊脂5.6 g·L。在光照和黑暗兩種條件下誘導腋芽萌發，溫度25 ℃，光照強度為1 000～2 000 lx，光照時長為16 h。

1.2 懸浮培養對腋芽萌發的影響

選擇1.1 中篩選出的適合腋芽萌發的TDZ 濃度，以WPM 為基礎培養基，蔗糖30 g·L，不含瓊脂的液體培養基，分裝在100 mL 三角瓶中，每瓶裝入50 mL，接入水曲柳組培苗，黑暗條件下，搖床轉速為60 r·min，溫度25 ℃。

1.3 不同激素組合對萌發芽離體再生的影響

將萌發出的腋芽切下后放入含有TDZ，GA，6-BA，NAA，2ip 不同組合的WPM 液體培養基中進行伸長培養，60 r·min振蕩培養，蔗糖濃度為30 g·L。

1.4 不同培養方式對萌發芽再生的影響

選擇1.3 中腋芽伸長成活率較高的激素組合，以WPM 為基礎培養基，添加蔗糖30 g·L，瓊脂5.6 g·L，將萌發出的腋芽切下后，接入該固體培養基中進行伸長培養，分別于6、12、18 d 記錄芽的平均高度、伸長量以及增殖率。

1.5 水曲柳腋芽萌發的生物反應器擴大培養

挑選生長健壯的水曲柳組培苗接種在3 L 氣動式球形生物反應器中，利用空氣泵通氣，溫度25 ℃，黑暗條件下進行休眠芽萌發的擴大培養，探索腋芽萌發培養基及培養方式是否適合擴大培養，以及該技術的可重復性。

1.6 水曲柳再生苗的移栽

移栽基質選擇草炭土和蛭石3∶1比例混合，分裝在小袋中，用含有3 mg·LIBA 和4 g·L生根粉溶液進行浸泡，使基質完全濕潤，將生根的組培苗洗去培養基后栽種到上述處理好的基質中，用拉口袋封住，密封培養20 d。打開密封袋，培養至50 d，統計移栽成活率。

1.7 數據分析

數據統計分析使用SPSS 17.0軟件。

2 結果與分析

2.1 不同濃度TDZ對水曲柳腋芽萌發的影響

在不添加TDZ 的培養基中水曲柳腋芽不萌發，在不同濃度的TDZ 培養基中水曲柳腋芽萌發情況有較大差異（見表1）。分別在培養7 和24 d時統計了腋芽的萌發情況，腋芽的萌發率隨著TDZ 濃度的增加而增加，隨著培養時間的延長而增加。WY2 培養基中腋芽萌發率從38.68%增至48.11%；WY3 培養基中腋芽萌發率從45.83%增至53.13%。觀察腋芽的生長形態發現，同一棵苗上的腋芽先從靠近培養基的腋芽開始萌發，依次往上直至頂芽萌發（見圖1：a～c）。觀察不同濃度TDZ 培養基中萌發芽生長狀態，WY1 培養基中腋芽萌發后長勢比較瘦弱（見圖1a），WY2 培養基中萌發芽長勢比較健壯飽滿，且能伸長，數量較多（見圖1b），WY3 培養基中形成的新芽較短，易脆，不易伸長（見圖1c）。方差分析結果顯示，=364.361，=3，<0.01，說明不同濃度TDZ 下水曲柳休眠芽萌發率差異顯著。多重比較顯示添加TDZ 與CK 之間差異顯著，WY1 與WY2 和WY3 之間差異顯著，WY2與WY3之間差異不顯著。

表1 不同濃度的TDZ對水曲柳休眠芽萌發的影響Table 1 Effects of different concentrations of TDZ on the germination of dormant buds of F.mandshurica

圖1 水曲柳組織培養苗腋芽萌發Fig.1 Axillary bud germination of tissue culture seedlings of F.mandshurica

2.2 不同光照條件對水曲柳腋芽萌發的影響

在光照和黑暗兩種條件下培養24 d，觀察統計結果顯示：在兩種條件下腋芽萌發率都隨著TDZ 濃度的升高而增加（見表2）。對兩種培養條件下萌發的芽數進行方差分析，結果顯示=0.561，=1，=0.454>0.05，說明光照和黑暗培養條件下水曲柳休眠芽的萌發數量差異不顯著。從芽生長的形態上觀察發現，在光照條件下，苗的根部會長出大量的愈傷組織，而且萌發的芽長勢上瘦小易脆，芽切下后培養，在基部也會長出大量的愈傷組織，大多數的芽只有葉片長大，而沒有明顯莖的伸長（見圖1：d～f），而黑暗條件下，苗上長的愈傷組織較少，芽切下后培養，在基部愈傷組織長的相對較少，芽均有明顯莖的伸長，而且會在新形成的莖上再形成新芽（見圖1：g～h），當TDZ濃度為0.6 mg·L時，芽萌發長度能達到0.67 cm（見圖1h）。因此，按照新芽平均長度和生長形態對比發現，黑暗條件更適合水曲柳腋芽的萌發且有助于后續離體伸長培養。

表2 不同光照條件對休眠芽萌發的影響Table 2 Effects of different light conditions on germination of dormant buds

2.3 懸浮培養對水曲柳腋芽萌發的影響

根據固體培養基中腋芽萌發和生長情況，我們選擇TDZ 濃度為0.6 mg·L的液體培養基，黑暗條件下對水曲柳組培苗進行懸浮培養。培養7 d觀察發現液體培養基中腋芽100%萌發（見表3，見圖2a），繼續培養到24 d，比較固體和液體兩種培養方式對腋芽萌發的差異，液體培養中腋芽萌發率是固體培養的2.10 倍，液體培養中芽的平均長度為0.87 cm（見圖2b），是固體培養基中的1.30倍。對固體、液體不同培養方式中腋芽萌發的數量進行方差分析結果顯示：=63.138，=1，<0.001，說明不同培養方式下水曲柳腋芽萌發數量差異顯著。因此，液體懸浮培養更適合水曲柳腋芽的萌發。

圖2 腋芽在液體懸浮培養中的萌發Fig.2 Germination of axillary buds in liquid suspension culture

表3 不同培養方法對水曲柳芽的影響Table 3 Effects of different culture methods on the buds of F.mandshurica

2.4 不同激素組合對萌發芽離體再生的影響

將萌發的芽切下，接種在不同激素組合的液體培養基中進行伸長培養。培養20 d 統計結果顯示（見表4），Z4培養基（含1.0 mg·L2ip）芽的伸長量最大為0.79 cm；其次為Z1培養基（含0.05 mg·LTDZ+0.6 mg·LBA），芽的伸長量為0.72 cm；Z2培養基（含0.05 mg·LTDZ+1.0 mg·LGA+0.6 mg·LBA）中芽的伸長量為0.61 cm；Z3培養基（0.6 mg·LTDZ+1.0 mg·LBA）中芽的伸長量為0.11 cm；Z5培養基中（含0.6 mg·LTDZ＋1.0 mg·LNAA）出現負伸長的現象，可能是由于死亡數量過多造成的。除了Z1 培養基，其它培養基中芽均有死亡現象，死亡率為10%～60%。對不同激素組合中芽的活性進行方差分析，結果顯示=11.623，=4，=0.02<0.05，說明含有不同激素的液體培養基對水曲柳嫩芽的成活影響差異顯著。

表4 不同激素組合下不定芽的伸長和增殖Table 4 Elongation and proliferation of adventitious buds in different hormone combinations

2.5 水曲柳腋芽萌發后離體伸長培養

將萌發后的腋芽切下后轉接入Z1 固體培養基中（含0.05 mg·LTDZ+0.6 mg·LBA），隨著培養時間的延長，芽也逐漸增高（見表5），培養18 d時苗平均高度為2.64 cm，同時也有分化出新的不定芽，增殖率為44.74%。觀察苗的生長形態，此時萌發的芽長成組培苗，有獨立的主干，葉片展開，綠色，生長健壯（見圖3）。由此可見，Z1 固體培養基比液體培養基更有利于嫩芽的伸長培養，同時兼有增殖效果。

圖3 萌發后腋芽離體伸長培養a增殖苗；b單苗；c苗高Fig.3 In vitro elongation culture of axillary buds after germinationa.Has proliferated seedlings；b.Single seedlings；c.Measures seedling height

表5 水曲柳腋芽萌發后離體伸長培養Table 5 In vitro elongation culture of F. mandshurica buds after germination

2.6 水曲柳腋芽萌發及離體伸長培養技術確立

為了驗證上述繁殖技術的可重復性，將26 棵水曲柳組培苗接種到液體培養基中懸浮培養15 d后，將萌發的腋芽切下轉入Z1 固體培養基伸長培養20 d，最終獲得105 棵水曲柳組培苗，增殖系數達到4.04。隨機選擇59 棵組培苗接種至3L 生物反應器中培養15 d，腋芽全部萌發（見圖4：a～b），共181 個新芽，將芽切下接種到Z1 固體培養基伸長培養20 d，獲得水曲柳組培苗（見圖4c），增殖系數為3.67。這一結果說明液體+固體兩種培養方式交替使用，可以打破水曲柳腋芽休眠，并在短時間內使休眠芽萌發、再生成新苗。

圖4 液—固交替培養狀態a～b.液體培養萌發的芽；c.萌發的芽在固體培養中伸長Fig.4 Liquid-solid alternate culture statea-b.The sprouting bud in liquid culture；c.The germinated buds are elongated in solid culture

2.7 水曲柳組培苗的移栽

將生根的組培苗（見圖5a）洗掉培養基后移栽到基質中，用塑料袋密封20 d 左右（見圖5b），打開，半開半閉狀態培養1 個月后移栽成活（見圖5c），成活率達90%。

圖5 水曲柳組培苗移栽a.生根苗；b.套袋密封培養；c.成活的苗Fig.5 Tissue culture seedlings of F.mandshurica were transplanteda.Rooting seedlings；b.Bagged and sealed culture；c.Surviving seedlings

3 討論

目前，利用液體—固體交替培養打破水曲柳腋芽休眠問題，并在短時間內獲得水曲柳組培苗的方法鮮見報道。在植物發育中細胞分裂素的作用之一就是芽的激活，隨著研究的不斷深入，許多信號元件被認為是芽生長所必需的，在豌豆（）、擬南芥（）、矮牽?；ǎǎ┲幸呀洷蛔C實。細胞分裂素可以促進豌豆brc1 突變體的芽激活。植物生長素從腋芽向莖的轉運過程可能是對蘋果（）的腋芽萌發起著至關重要的作用。抑制CK的合成和信號傳導并不會抑制蔗糖促進當代月季（）花腋芽的生長。細胞分裂素可能通過調節生長素轉運或局部上調腋芽生長素生物合成來激活芽生長。然而，關于激素如何調節水曲柳芽生長的分子機制還鮮見報道。

TDZ 具有生長素和細胞分裂素的作用，可以誘導多種形態的發生，低濃度誘導腋芽增殖，高濃度誘導不定芽發育。本研究中利用單一的TDZ（0.4～0.8 mg·L）誘導腋芽萌發，隨TDZ 濃度增加腋芽萌發率也增加，液體懸浮培養可使腋芽萌發率達100%。在蘋果中直接將細胞分裂素用于腋芽處可以激活腋芽的萌發。這也說明，在液體懸浮培養時，腋芽能夠直接接觸培養基，激素可以直接作用于腋芽而促使其萌發。而在固體培養時，植物激素是通過莖部運輸到腋芽處。在這個過程中可能會有其它因素導致了同樣的培養基中腋芽分化率出現明顯的差異。研究表明，生長素運輸在控制芽的活性方面起中心作用，芽的生長與從芽中輸出生長素有密切的相關性。如果腋芽的活性需要植物生長素持續支持，那么試管培養可以間接解釋生長素在主莖中的運動對腋芽活性的抑制。主莖中的生長素會降低莖的吸收強度，從而降低芽與主莖之間的生長素基本水平。如果這個水平太低，觸發正反饋信號調節，然后腋芽將保持休眠。

本研究中TDZ 只能使腋芽萌發，卻不適用于繼續伸長培養，因此，在腋芽離體伸長培養時，需要降低TDZ 濃度（0.6 mg·L降為0.05 mg·L），增加BA 濃度（0 增加到0.6 mg·L）。有研究表明，不定芽在高濃度BA 的培養基中長時間生長，會使植物中水分含量過高，從而影響植物的生長和再生，而降低BA 濃度（4.44～1.11μmol·L），不定芽明顯伸長。也有植物在伸長時需要增加BA 濃度，（6.7～13.3 μmol·L）萌發的芽才能伸長。在用葉片誘導的不定芽再生培養中，也是提高BA濃度（13.3μmol·L）后不定芽的伸長效果較好。

4 結論

我們開發了一種液體—固體交替培養水曲柳組培苗的技術，可以短時間內使休眠芽萌發，再離體伸長培養獲得健壯的組培苗。該技術將為水曲柳種質資源保存、大量繁殖及規?；a等應用提供技術支持，尤其為進一步研究水曲柳側枝分枝的調控機理奠定基礎。