團頭魴基因組微衛星特征及SSR位點開發

張 芹， 王延暉， 王冰柯， 屈長義

(河南省水產科學研究院，河南鄭州 450044)

團頭魴()隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鲌亞科(Culterinae)魴屬()，為中國特有的淡水經濟魚類。由于團頭魴具有養殖成本低、生長快、成活率高、易捕撈、肉質好等優點，早在20世紀60年代就作為優良的草食性魚類在全國推廣，成為池塘養殖的主要品種之一。微衛星標記(microsatellite)，又稱為短串聯重復序列(simple tandem repeats，STRs)或簡單重復序列(simple sequence repeats，SSRs)，是均勻分布于真核生物基因組中的簡單重復序列，由2～6個核苷酸的串聯重復片段構成。SSR分子標記具有重復性好、多態性高、對模板 DNA 要求低等優點，已廣泛應用于鯉魚、扇貝、中華鳑鲏等水生動物的種質資源鑒定及遺傳多樣性研究，是水生動物種質鑒定、親緣關系及種質分類等研究的理想標記。采用傳統方法開發SSR分子標記效率低且成本高，與轉錄組SSR相比，基因組SSR的多態性更高，且在基因組中分布廣泛，從而獲得更好的圖譜覆蓋率。利用高通量測序技術開發SSR分子標記能極大提高開發效率，并有效降低成本，已成功應用于多種水生動物的SSR分子標記開發。

該研究旨在利用生物信息學方法分析團頭魴基因組數據，發掘 SSR 位點，了解其特征及分布規律，包括基序結構和類型、比例、重復次數，并設計和合成 SSR 引物，驗證其多態性，為團頭魴種質資源的分子指紋圖譜構建、品種間遺傳多樣性分析及分子育種的推進奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年9月從河南省嵩縣陸渾水庫伊河魴魚種廠采集團頭魴伊河群體100尾，從湖北省鄂州國家級團頭魴原種場采集團頭魴華海1號群體100尾，所有個體測量體長、體質量，剪尾鰭用無水乙醇保存，并將樣品帶回河南省水產科學研究院實驗室進行后續試驗。

1.2 方法

1.2.1 團頭魴DNA的提取 采用磁珠法基因組DNA提取試劑盒(天根生化)提取團頭魴 DNA，經 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用超微量分光光度計(NanoDrop One spectroph otometer)檢測 DNA 濃度和純度，置于-20 ℃低溫保存。

1.2.2 SSR位點的查找和引物的設計 從NCBI中搜索團頭魴()，得到團頭魴基因組序列信息，將這段基因組序列下載下來后，使用MISA軟件進行SSR位點的搜索，搜索的標準：重復基元長度2～6 bp，二核苷酸重復基序的最小重復數為6；三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復基序的最小重復數均為5。2個SSR序列間隔最小值為100 bp。

將得到的SSR位點信息經Primer 5.0軟件設計引物，通過嚴格的篩選，得到9 000余條待選引物。引物篩選的標準：去除重復單元全部由G/C堿基構成的位點(高GC序列不利于批量擴增)；每一條參考序列上只選取1個位點；去除引物長度不是20的位點；選取目的產物在110～350 bp的引物；去掉重復單元重復次數5、6次及以下的位點；不同位點間如果有1條或2條引物序列完全相同的，只保留1個位點。

1.2.3 PCR擴增及SSR檢測 從9 000余條待選引物中隨機挑選288對SSR引物，其中，每對引物的正向引物(F引物)均加了通用M13接頭序列(TGTAAAACGACGGCCAGT)，另外合成加FAM熒光基團的M13熒光接頭引物。選擇8份團頭魴基因組DNA作為模板對引物進行篩選，選擇條帶清晰、多態性好的引物進行后續試驗。

采用兩步PCR法進行擴增。第一步PCR反應體系(10.0 μL)：2×PCR Master Mix 5.0 μL，基因組DNA 1.0 μL，接頭上游引物(10p)0.3 μL，下游引物(10p)0.3 μL，ddHO 3.4 μL。PCR擴增程序：95 ℃ 預變性3 min；95 ℃ 變性 30 s，62 ℃→52 ℃ touch down退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，共10個循環；95 ℃ 變性30 s，52 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸30 s，共25個循環；72 ℃ 終延伸 20 min。第二步PCR反應體系(10.0 μL)：2×PCR Master Mix 5.0 μL，第一步PCR產物 1.0 μL，熒光引物(10p)0.3 μL，下游引物(10p)0.3 μL，ddHO 3.4 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，共25個循環；72 ℃末端延伸 5 min。

1.2.4 熒光毛細管電泳檢測 PCR產物進行定量稀釋后，取1 μL PCR稀釋產物加9 μL甲酰胺(含1%內標)變性后上DNA測序儀ABI 3730xl進行毛細管熒光電泳檢測。

1.2.5 結果處理 將毛細管電泳檢測結果導入到Gene Marker分析軟件中，進行數據整理，每對引物導出PDF峰圖文件，結果匯總統計后進行分析。

2 結果與分析

2.1 團頭魴基因組中SSR位點數及分布頻率

將已獲得的團頭魴基因組數據進行 SSR位點分析，共檢測序列 18 243 條，其中含有 SSR位點的序列為 3 940 條，占總檢測序列條數的21.60%，檢測出 SSR位點共350 898 個，平均約3.1 kb 出現1個SSR位點。含有2 個及2 個以上SSR位點的序列有 2 450 條。其中，二核苷酸重復的位點236 613條，占總SSR位點的67.43%；三核苷酸重復的位點51 527條，占總SSR位點的14.68%；四核苷酸重復的位點52 042條，占總SSR位點的14.83%；五核苷酸重復的位點10 149條，占總SSR位點的2.89%；六核苷酸重復的位點567條，占總SSR位點的0.16%(圖1)。

團頭魴基因組中含有豐富的SSR 類型，搜索得到的350 898 個 SSR 位點中，共檢測出 1 106 種類型的核苷酸重復，不同核苷酸重復類型出現的比例相差較大，其中，二核苷酸重復類型最少，只有 12 種，占SSR位點重復類型的1.08%；三核苷酸重復類型 60 種，占SSR位點重復類型的5.42%；四核苷酸重復類型217種，占SSR位點重復類型的19.62%；五核苷酸的重復類型最多，達 556 種，占SSR位點重復類型的50.27%；六核苷酸重復類型 261 種，占SSR位點重復類型的23.60%。

此外，從SSR位點的平均分布距離來看，二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重復在團頭魴基因組中分布距離較小，分別為4.6、21.1、20.9 kb，而五核苷酸、六核苷酸重復位點的平均分布距離分別為107.1 kb和1.9 Mb。二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸類型重復位點的密度遠遠高于其他2 種類型重復位點的密度。

由圖2可知，團頭魴基因組SSR中，二核苷酸重復單元長度為12～144 bp，分布范圍主要集中在6～34次，占91%；三核苷酸重復單元長度為12～144 bp，主要集中在5～17次，占99%；四核苷酸重復單元長度在20～200 bp，分布范圍主要集中在 5～29次，占99%；五核苷酸重復單元長度為25～225 bp，主要集中分布在5～17次，占97%；六核苷酸重復單元長度30～162 bp，分布范圍主要集中在5～15次，占99%。團頭魴基因組中不同重復SSR類型中的重復長度不同，且長度的變異較大。每種重復SSR類型都隨著重復長度的遞增，微衛星豐度呈遞減趨勢，即SSR長度越長，微衛星出現頻率越低。

2.2 團頭魴基因組中SSR基序類型和頻率

從團頭魴基序類型分布看，由表1可知，350 898 個SSR位點中共有257種重復基序，二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復基序類型分別有4、10、32、95、116種。

表1 團頭魴基因組部分SSR基序類型的分布特征

二核苷酸重復基序類型有4種，即AC/GT、AG/CT、AT/AT和CG/CG，占總SSR位點類型的67.43%，其中，AT/AT所占比例最高，為29.46%，CG/CG所占比例最低，為0.12%；三核苷酸重復類型基序有10種，其中，AAT/ATT重復類型基序最多，為8.56%；四核苷酸重復類型基序有32種，其中，AGAT/ATCT所占比例最多(4.57%)；五核苷酸重復類型基序以AATAT/ATATT所占比例最多(0.97%)；六核苷酸重復類型以AACCCT/AGGGTT所占比例最高(0.06%)。

2.3 團頭魴基因組多態性SSR引物的篩選

以8份團頭魴DNA為材料，對設計合成的288對SSR熒光引物進行多態性篩選，有149對引物能夠穩定擴增出與預期產物一致的條帶，引物有效率為51.7%；93對引物表現出多態性。由表2可知，多態性引物占32.3%；其中，18對引物表現出高度多態性，等位基因數大于3，可以穩定擴增且沒有雜峰。由圖3可知其中1對引物HNF209在4份團頭魴材料中的毛細管電泳檢測結果。

表2 篩選的 18 對團頭魴基因組 SSR 位點引物信息

3 討論與結論

在團頭魴基因組序列共檢測出 SSR位點 350 898 個，平均約3.1 kb出現1個SSR位點，低于木荷、甘草等植物，高于卵形鯧鲹、翹嘴鱖等水生生物中SSR位點的出現頻率，說明團頭魴基因組 SSR 位點較為豐富。

在大多數物種基因組中，具有短核苷酸重復基元(單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸)的序列較長核苷酸重復基元(四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸)的序列更豐富。在團頭魴SSR序列中，隨著核苷酸重復基元的增加，其數量迅速減少，其中，二核苷酸重復的位點 236 613 條，占總SSR位點的67.43%，六核苷酸重復的位點占總SSR位點的0.16%。這個結果與卵形鯧鲹、胡子鲇和長體圓鲹等魚類的研究結果相似。

團頭魴基因組SSR各重復類別中，從SSR位點的平均分布距離來看，六核苷酸重復(1.9 Mb)>五核苷酸重復(107.1 kb)>三核苷酸重復(21.1 kb)>四核苷酸重復(20.9 kb)>二核苷酸重復(4.6 kb)。

Weber發現完美重復序列PIC值隨著重復次數的增加呈現增加的趨勢。該研究中，三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸重復型SSR位點的PIC值與SSR長度均呈正相關，與石榴中的結果一致，說明我們以后在選擇SSR標記時應相應選擇重復次數較多、序列較長的SSR位點，可能會獲得更高的多態性水平。

該研究首次利用生物信息學技術，對團頭魴基因組SSR序列進行搜索和分析，發掘了大量團頭魴 SSR 位點，統計分析團頭魴基因組SSR數量、長度、頻率和密度等生物信息學特征，豐富團頭魴分子標記類型，為團頭魴群體遺傳結構和遺傳多樣性分析提供數據基礎，有利于加快建立團頭魴種質資源評價與保護機制，也有利于進一步研究團頭魴種質資源多樣性和品種選育。

致謝：感謝華中農業大學王衛民教授在團頭魴樣品采集過程中給予的幫助。