miR-195-5p通過靶向ROCK1抑制腎癌細胞遷移、侵襲和上皮-間質轉化

陳少軍，錢蘇波，曹奇峰，邵 寧，虞永江，顧正勤，沈海波

(上海交通大學醫學院附屬新華醫院泌尿外科，上海 200092)

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是起源于腎實質小管上皮細胞的惡性腫瘤，簡稱腎癌，是成人最常見的腎臟惡性腫瘤，約占所有腎臟腫瘤的90%[1]。由于缺乏早期的臨床表現和診斷標志物，超過50%的腎癌患者為偶然發現，并且約20%～30%的患者在首次診斷為腎癌時已經伴隨遠處轉移[2]。最新的統計數據表明未發生轉移的腎癌患者5年生存率超過70%，而發生轉移的腎癌患者5年生存率不足12%[3]。因此，進一步研究腎癌發生及轉移的分子機制，尋找腎癌相關的腫瘤標志物，有助于提高腎癌的早期診斷及改善腎癌患者的預后。

微小RNAs (miRNAs)是一類內源性非編碼小分子RNA，主要通過結合其下游靶基因mRNA的3’UTR(3’ untranslated regions)引起的mRNA降解或抑制蛋白質翻譯過程，從而影響靶基因的表達水平[4]。大量的研究結果表明，miR-195-5p作為抑癌基因在多種癌癥中低表達并可影響腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等生物學行為，如前列腺癌、胰腺癌和宮頸癌等[5-7]。然而，miR-195-5p在腎癌發生發展中的作用研究尚少。我們在前期的研究中發現miR-195-5p在腎癌組織和細胞中均表現出明顯的低表達，過表達miR-195-5p可抑制腎癌細胞的增殖、促進凋亡[8]。本研究旨在進一步探討miR-195-5p對腎癌細胞遷移、侵襲及上皮-間質轉化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)的影響及機制，從而進一步闡明其在腎癌發生發展中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑腎癌細胞株786-O購自中國科學院上海生命研究院細胞中心。RPMI-1640培養基、胎牛血清(FBS)及青霉素鏈霉素雙抗(100×)購自Gibco公司，EDTA-0.25%胰酶購自Amersco公司，RNA提取試劑Trizol和細胞轉染試劑Lipofectamine 2000購自invitrogen 公司；cDNA逆轉錄試劑盒購自北京康為世紀公司，熒光定量RT-PCR檢測試劑盒購自TaKaRa公司，Matrigel基質膠和Transwell小室購自美國BD公司；miR-195-5p mimics、miR-195-5p inhibitors、ROCK1 si-RNA及其空白對照(miR-NC，inhibitor-NC，siNC)購自廣州市銳博生物科技有限公司。ROCK1及β-actin的一抗購自Abcam公司，E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的一抗購自Cell Signaling Technology公司，Western blot二抗購自Abcam公司。

1.2 細胞培養與轉染人腎癌細胞株786-O利用RPMI-1640培養基培養。培養基含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、50 U/mL的青霉素和50 μg/mL的鏈霉素。培養箱條件為37 ℃、5%的CO2和95%的濕度。細胞轉染時，取對數期生長的細胞，將miR-195-5p mimics、miR-NC、miR-195-5p inhi-bitors、inhibitor-NC、ROCK1 si-RNA或siNC利用Lipofectamine 2000按照說明書的方法進行轉染。在轉染后48 h，收集細胞檢測相關RNA或蛋白的表達水平及進行細胞功能實驗。

1.3 實時熒光定量PCR在細胞轉染48 h后，收集細胞，利用Trizol法提取細胞的總RNA，按照cDNA逆轉錄試劑盒的說明書將RNA逆轉錄為cDNA。按照熒光定量RT-PCR試劑盒的說明書配置PCR反應體系，在ABI熒光定量PCR儀上進行反應40個循環，利用2-ΔΔCt的方法計算miR-195-5p的相對表達量。U6作為miR-195-5p的內參對照。miR-195-5p正向引物序列為5′-GGGGTAGCAGCACAGAAAT-3′，反向引物序列為5′-TCCAGTGCGTGTCGTGGA-3′；U6的正向引物序列為5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGCAGC-3′，反向引物序列為5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；該實驗獨立重復3次。

1.4 細胞劃痕實驗取對數期生長且狀態良好的各組細胞，將細胞以大約20%的濃度接種于6孔板中，置于培養箱中進行培養。待細胞濃度長至70%～80%時，用200 μL的移液器槍頭在6孔板的底面劃出均勻的線條，加入PBS漂洗3次，去除脫落細胞。每孔加入無血清培養基2 mL，在倒置顯微鏡下拍照，記錄0 h的劃痕寬度。置于培養箱中培養24 h后，取出6孔板，在倒置顯微鏡下拍照并測量劃痕寬度，從而檢測細胞的遷移能力。每組實驗重復3次，劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕跨度×100%。

1.5 Transwell小室實驗取對數期生長且狀態良好的各組細胞，去除培養基、消化、離心、加入無血清培養基重懸制備單細胞懸液并計數。在Transwell小室的上室內加入含1.0×105個細胞的無血清培養基單細胞懸液200 μL，在下室內加入600 μL含10%胎牛血清的完全培養基，置于37 ℃的培養箱中培養24 h。培養結束后取出Transwell小室，用PBS清洗3次，4%的多聚甲醛室溫下固定30 min。用棉簽將上室內未穿透的細胞輕輕擦去，再用1%的結晶紫染色10 min，PBS清洗3次。將Transwell小室于倒置顯微鏡下隨機選擇三個視野觀察并計數細胞，進行統計。每組實驗重復3次。

1.6 雙熒光素酶報告基因檢測通過TargetScan生物信息學分析網站預測得知ROCK1為miR-195-5p的靶基因，我們利用雙熒光素酶報告基因檢測的方法進行了驗證。根據miR-195-5p與基因相互作用的序列，設計野生型3′UTR及無法與miR-195-5p結合的突變型3′UTR，并構建熒光素酶報告質粒pmirGLO-ROCK1-Wt 3’UTR (Wt 3′UTR)和pmirGLO-ROCK1-Mut 3′UTR(Mut 3′UTR)。將miR-195-5p mimics或miR-195-5p NC與ROCK1的Wt 3′UTR或Mut 3′UTR質粒共轉染至786-O細胞中，轉染48 h后利用雙熒光素酶檢測系統檢測細胞中的熒光素酶活性，相對熒光值=螢火蟲熒光素酶的熒光值/海腎熒光素酶的熒光值。

1.7 免疫印跡試驗(Western blot)取轉染48 h且生長狀態良好的細胞，用冷PBS清洗后提取細胞蛋白，100 ℃煮樣后上樣于SDS-PAGE膠中進行電泳分離。電泳完成后，將蛋白轉至NC膜、5%的脫脂牛奶室溫下封閉1 h。PBS-T將膜清洗3次后，按照說明書的濃度加入一抗溶液在4 ℃避光條件下孵育過夜。次日，用PBS-T洗膜后加入二抗溶液于4 ℃孵育1 h。二抗孵育完成后，用PBS-T洗膜3遍，于Oddesey掃膜儀上進行掃膜。每組實驗重復3次。

2 結 果

2.1 miR-195-5p對腎癌細胞遷移、侵襲及EMT的影響在前期研究中，我們發現miR-195-5p在腎癌組織和細胞中低表達，提示其在腎癌中可能是一個抑癌基因[8]。為了研究miR-195-5p對腎癌細胞遷移、侵襲等生物學行為的影響，我們將miR-195-5p mimics轉入腎癌細胞786-O過表達miR-195-5p，并在轉染48 h后利用qRT-PCR進行了驗證(圖1A)。其次，分別通過細胞劃痕實驗、Transwell小室實驗及Western blot檢測了過表達miR-195-5p的786-O細胞遷移、侵襲能力及EMT相關蛋白的表達水平。實驗結果表明過表達miR-195-5p后腎癌細胞的遷移及侵襲能力均明顯降低(圖1B、C)，EMT相關的蛋白E-cadherin表達增高而N-cadherin和Vimentin表達降低(圖1D)。該研究結果提示miR-195-5p可抑制腎癌細胞的遷移、侵襲及EMT。

A:轉染miR-195-5p mimics(miR-195)后miR-195-5p的表達水平；B：786-O細胞的遷移圖(×10)及其柱狀圖；C：786-O細胞侵襲的結晶紫染色圖(×20)及其柱狀圖；D：EMT(上皮-間質轉化)相關蛋白的表達量的免疫印跡圖；*P<0.05。

2.2 ROCK1是miR-195-5p的靶基因為了研究miR-195-5p影響腎癌細胞遷移、侵襲及EMT的相關機制，我們通過生物信息學網站Targetscan預測得知ROCK1是miR-195-5p的一個靶基因，其結合序列如下(圖2A)。有文獻報道ROCK1在腎癌中高表達并且作為促癌基因影響腎癌細胞的生物學行為[9-10]。另外，我們進行了雙熒光素酶報告實驗進行驗證，發現miR-195-5p mimics可明顯降低ROCK1-Wt 3’UTR的熒光素酶活性、而不能降低ROCK1-Mut 3’UTR的熒光素酶活性(圖2B)。并且，我們還檢測了腎癌細胞中過表達miR-195-5p對ROCK1的影響。結果表明過表達miR-195-5p可使ROCK1的表達水平明顯降低(圖2C)。該研究結果提示ROCK1為miR-195-5p的靶基因。

2.3 轉染miR-195-5p inhibitors及si-ROCK1的效果檢測為了進一步驗證miR-195-5p對腎癌細胞遷移、侵襲和EMT的影響及機制，我們轉染了miR-195-5p inhibitors抑制腎癌細胞中miR-195-5p的表達，并利用qRT-PCR進行了驗證(圖3A)。另外，在抑制miR-195-5p表達的腎癌細胞中，我們利用si-RNA干擾了ROCK1的表達，并通過Western blot進行了驗證(圖3B)。

2.4 抑制miR-195-5p的表達和干擾ROCK1的表達對腎癌細胞遷移、侵襲及EMT的影響分別檢測了抑制miR-195-5p的表達和抑制miR-195-5p的表達后干擾ROCK1的表達，腎癌細胞的遷移、侵襲能力及EMT相關蛋白表達量的變化情況。實驗結果表明抑制miR-195-5p可促進腎癌細胞的遷移、侵襲及EMT，而干擾ROCK1后可部分抵消miR-195-5p抑制對腎癌細胞遷移、侵襲及EMT的影響(圖4)。該結果提示miR-195-5p可能通過靶向ROCK1抑制腎癌細胞的遷移、侵襲及上皮-間質轉化。

A：生物信息學網站Targetscan預測；B：雙熒光素酶報告試驗；C：免疫印跡試驗。

A：轉染miR-195-5p inhibitors后miR-195-5p的表達量(*P<0.05)；B：轉染si-ROCK1后腎癌細胞ROCK1的表達量。

A:腎癌細胞的遷移圖(×10)及其柱狀圖；B:腎癌細胞侵襲的結晶紫染色圖(×20)及其柱狀圖；C:EMT相關蛋白表達量的免疫印跡圖；*P<0.05。

3 討 論

近年來，越來越多的研究表明microRNAs在腫瘤發生發展的過程中發揮了重要的作用，如影響細胞增殖、凋亡、周期轉化、遷移、上皮間質轉化及免疫應答等過程[11]。在腎癌中，同樣有大量的microRNA被證實存在異常表達并作為癌基因或抑癌基因影響腎癌的發生和進展，從而有可能成為腎癌的診斷標志物或治療靶點[12]。miR-195被證實在多種癌癥中低表達，并可通過調控其下游的靶基因影響癌細胞的生物學行為。如LUO等[13]報道miR-195可通過靶向周期蛋白依賴激酶8(cyclin dependent kinase 8，CDK8)抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲等。LIU等[7]研究結果提示miR-195可通過靶向Yes相關蛋白1(Yes-associated protein1，YAP1)抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移、侵襲及上皮間質轉化。另外，還有研究表明miR-195可通過調控叉頭框蛋白K1(Forkhead box K1，FOXK1)抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲等[14]。然而，miR-195在腎癌中的表達及功能目前研究尚少。

我們在前期研究中發現miR-195-5p在腎癌中低表達并且可影響腎癌細胞的增殖和凋亡等。這些研究結果表明miR-195-5p可能作為抑癌基因參與了腎癌的發生發展等過程。在本研究中，我們進一步探討了miR-195-5p對腎癌細胞遷移、侵襲和上皮-間質轉化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)等的影響。為了過表達或抑制腎癌細胞中miR-195-5p的表達水平，我們向腎癌細胞中轉染了miR-195-5p mimics或inhibitors。實驗結果表明，過表達miR-195-5p可抑制腎癌細胞的遷移、侵襲和EMT；而抑制miR-195-5p可促進腎癌細胞的遷移、侵襲和EMT等。接著，通過生物信息學分析發現ROCK1是miR-195-5p的一個靶基因。因此，我們進一步研究了miR-195-5p影響腎癌細胞遷移、侵襲和上皮-間質轉化的機制。

ROCK1作為癌基因在多種癌癥中高表達，主要通過調控細胞遷移、侵襲及血管生成等過程促進腫瘤轉移，如黑色素瘤[15]、膠質瘤[16]和非小細胞肺癌[17]等。有研究表明miR-195可通過靶向ROCK1調控喉癌細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學行為[18]。然而miR-195-5p能否通過靶向ROCK1調控腎癌細胞的生物學行為尚鮮見研究。我們通過Targetscan等生物信息學分析得知ROCK1是miR-195-5p的靶基因，并通過雙熒光素酶報告實驗證實miR-195-5p可與ROCK1的3’UTR結合。Western blot實驗結果也表明miR-195-5p可抑制ROCK1在腎癌細胞中的表達。另外，我們在抑制腎癌細胞miR-195-5p的表達后利用siRNA干擾ROCK1的表達并檢測了腎癌細胞的遷移、侵襲和EMT。研究結果表明干擾ROCK1的表達可部分抵消抑制miR-195-5p對腎癌細胞遷移、侵襲和EMT的影響。這些研究結果表明miR-195-5p可通過靶向ROCK1抑制腎癌細胞的遷移、侵襲和上皮-間質轉化。

綜上所述，本研究結果表明miR-195-5p在腎癌的發生發展中是一個抑癌基因，可通過靶向ROCK1抑制腎癌細胞的遷移、侵襲和上皮-間質轉化等生物學行為。該研究結果提示miR-195-5p可能成為腎癌的分子標志物，為腎癌患者的早期診斷和治療提供新的可能。