基于網絡藥理學探討冬蟲夏草預防慢性支氣管炎急性發作的可行性研究*

李鈺昕 張洪春 李 云 疏欣楊 △

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.中日友好醫院，北京 100029；3.國家呼吸醫學中心，北京 100029；4.中國醫學科學院呼吸病學研究院，北京 100029；5.國家呼吸疾病臨床醫學研究中心，北京 100029；6.世界衛生組織戒煙與呼吸疾病預防合作中心，北京 100029）

慢性支氣管炎急性加重（AECB）是急診或呼吸科臨床常見疾病?？股厥侵委烝ECB的常用選擇，但其無法改變AECB反復發作的特點，且常因AECB的反復發作引起抗生素耐藥的發生［1］。預防AECB的反復發作才能從根本上解決其對患者生命健康的威脅。AECB常由細菌或病毒感染誘發，多見于抵抗力下降的老年患者，因此免疫調節成為防治AECB的新方向［2］。冬蟲夏草是我國有兩千多年歷史的傳統補益藥，現代藥理學研究表明冬蟲夏草具有免疫調節、抗炎、抗氧化應激、抗癌等藥理作用［3］。冬蟲夏草作為具有調節免疫功效的藥食兩用中藥材，在防治AECB方面具有廣闊的前景，多項臨床研究已證實冬蟲夏草不僅可顯著改善患者的肺功能，還可以提高患者免疫力［4］，從而達到減少AECB的發生的目的。

網絡藥理學是基于系統生物學的理論，以中藥化學成分、作用靶點為信號節點，整合系統生物學、基因學、計算機分析科學等學科的理論，分析藥物活性成分與作用靶點之間的聯系，探討藥物治療疾病的信號通路，在整體角度上預測藥物與疾病之間的關聯性，可以針對疾病的靶點，有效提高藥物治療疾病的療效，減少毒副作用。本研究通過網絡藥理學探討冬蟲夏草預防AECB的可能性及相關分子機制，以期為AECB的免疫調節治療提供一定的理論依據，為后期的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 冬蟲夏草活性化合物和靶點的篩選 基于TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）及《中華人民共和國藥典》（2020版），篩選冬蟲夏草的化學成分及分子結構信息等。納入符合口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18［5］的標準化合物，篩選出候選活性化合物。通過Pub-Chem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得藥物活性化合物的標準結構，利用SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）預測活性成分靶點并納入Probability＞0.02［6］的靶點。將獲得的冬蟲夏草相關的活性化合物及靶點導入Cytoscape3.7.1繪制冬蟲夏草-化合物-靶點網絡圖。

1.2 預測目標靶點 利用GeneCards（https：//www.genecards.org/）數據庫檢索AECB疾病相關靶點，取冬蟲夏草活性化合物和AECB疾病集合的靶點交集作為目標靶點。

1.3 PPI蛋白互作網絡 基于STRING工具（https：//www.string-db.org/）構建PPI蛋白互作網絡，并通過Cytoscape3.7.1繪制PPI網絡圖。利用Cytoscape3.7.1插件CytoHubba篩選重點靶點，納入最大集團中心性法分析得到的前10個靶點。

1.4 GO和KEGG富集分析 將目標靶點列表導入DAVIDE 工 具（https：//david.ncifcrf.gov/），選 擇 GO 和KEGG分別進行通路和疾病的富集分析。結果用R軟件（version 3.6.2）繪制的氣泡圖展示。

2 結果

2.1 冬蟲夏草的活性成分 共篩選出冬蟲夏草的主要活性成分7個，主要可分為脂肪酸類［花生四烯酸（Arachidonic acid）、乙酸亞油脂酸（Linoleyl acetate）、棕櫚酸膽固醇酯（Linoleyl acetate）］，以及甾醇類化合物［β-谷甾醇（Beta-sitosterol）、麥維甾醇（Cerevisterol）、過氧麥角甾醇（Peroxyergosterol）、35，6-膽甾醇-3β-醇（CLR）］。通過SwissTargetPrediction工具預測冬蟲夏草活性成分的靶點234個，繪制冬蟲夏草-化合物-靶點網絡圖，見圖1。圖中圓圈節點代表化合物預測的靶點，長方形節點代表化合物，6邊形節點代表冬蟲夏草。甾醇類化合物中以麥維甾醇靶點最多，脂肪酸類化合物中以花生四烯酸靶點最多。

2.2 目標靶點 GeneCard數據庫收集AECB的相關靶點697個，將冬蟲夏草的234個靶點與之進行映射，得到共同靶點61個，這61個靶點即為冬蟲夏草防治AECB的目標靶點，目標靶點占冬蟲夏草靶點的26%，因而日常服用冬蟲夏草提高免疫力對預防AECB有一定意義。

2.3 PPI網絡構建 將61個目標靶點輸入STRING工具，構建目標靶點的蛋白質互作PPI網絡圖見圖2，共有61個節點，385條邊，節點越大，顏色越暖代表度值（Degree）越大。將PPI網絡導入Cytoscape3.7.1并用CytoHubba插件篩選重點靶點，節點越大代表度值越大，節點越紅代表最大集團中心性算法后的分值越高。重要的靶點有 TP53、TNF、MAPK1、EGFR、MAPK8、MAPK14、PTGS2、SRC、AR、NR3C1。見圖2。

2.4 GO和KEGG富集分析 GO富集分析結果顯示生物過程主要包括蛋白質改變、細胞周期調節、炎癥反應以及免疫調節，細胞成分主要涉及質膜和細胞表面，分子功能主要有激酶活性和蛋白質結合。KEGG富集分析顯示的條目包括免疫調節相關通路如NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、RIG-I樣受體信號通路、T細胞受體信號通路；感染相關通路如肺結核、百日咳、單純皰疹病毒感染、HTLV-I感染、志賀菌病、幽門螺桿菌感染、美國錐蟲病、弓形蟲病等病毒、細菌以及寄生蟲感染通路等；炎癥相關通路如TNF信號通路、EGFR信號通路、PI3K-Akt信號通路、NF-κB信號通路、p53信號通路、MAPK信號通路、ErbB信號通路、FcεRI信號通路、TRP通道的炎癥介質調節、花生四烯酸代謝通路；以及癌癥相關的通路如前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、癌癥蛋白多糖、小細胞肺癌、癌癥中樞碳代謝、癌癥microRNA、神經膠質瘤、細胞周期、Rap1信號通路等；富集分析的結果提示了冬蟲夏草可能通過影響免疫調節、抗感染、抗炎及抗癌等通路發揮防治AECB的作用。見圖3。

3 討 論

本研究基于網絡藥理學研究方法得到了冬蟲夏草防治AECB的目標靶點和信號通路，發現冬蟲夏草可以通過調節機體免疫和營造不利于病原微生物的生存環境發揮防治AECB的作用。AECB屬于中醫學“咳嗽”范疇，多由肺衛功能不足，六淫外邪侵襲肺系，肺失宣降所致。因此補肺益氣固衛、止咳化痰平喘是預防AECB反復發作的根本手段。冬蟲夏草是傳統補益藥，具有“百藥之王”的稱號，用于久咳虛喘，勞嗽咯血，通過補肺腎、益精氣增加人體的御邪能力，化痰平喘改善氣道緩解，從而發揮防治AECB的作用。

現代醫學認為免疫力低下、病原微生物感染及氣道炎癥環境在AECB的發病中起著重要作用。麥維甾醇可以通過對MAPK/NF-κB/AP-1和Nrf2/HO-1炎癥信號通路的抑制緩解氣管慢性炎癥環境［7］?；ㄉ南┧釀t可通過對促炎因子和抑炎因子的調節、對包膜病毒的滅活、對細菌結構及活動的破壞，發揮免疫調節和抗感染的作用［8］。重要靶點 PTGS2、MAPK、NR3C1、TP53、TNF、EGFR、SRC均與免疫調節、感染調控及炎癥反應密切相關。其中PTGS2與慢性炎癥的形成關系密切［9］；MAPK家族參與感染［10］、炎癥［11］、免疫［12］的調節；NR3C1參與糖皮質激素對氣道上皮炎癥的調節［13］；TP53的突變會削弱機體的免疫功能［14］；TNF可觸發多條炎癥途徑；EGFR是細菌［15］、病毒［16］等微生物感染誘導的炎癥和相關致癌作用的潛在治療靶點；SRC在巨噬細胞介導的先天免疫中發揮多重作用［17］。

呼吸道感染是AECB最常見的病因，而感染常發生于免疫力低下時。既往研究表明冬蟲夏草可以通過對NOD樣受體、RIG-I樣受體、Toll樣受體和T細胞信號通路的調節，發揮抗感染和提高免疫力的作用［18-22］，與本研究富集結果相符。病原微生物感染導致的氣道炎癥反應是AECB發病的關鍵，既往研究表明冬蟲夏草及其活性成分可以通過對NF-κB、MAPK、TNF［23］、EGFR［24］、PI3K-Akt［25］等信號通路的調控，抑制炎癥反應和氧化應激［14，26］，減少嗜酸性粒細胞和中性粒細胞的浸潤，減輕氣道壁厚度，抑制氣道重塑［27］，與本研究富集結果相符。此外，本研究亦發現冬蟲夏草防治AECB的信號通路中有多條癌癥途徑參與其中，這可能是由于癌癥和感染激活生物合成途徑的相似性導致的。起源于20世紀的病毒致癌說就曾提出病毒致癌的證據，臨床中包括肺癌在內的多種癌癥亦與感染有關［28-29］，病原體感染人體后的代謝變化與腫瘤相似，故可以推測用冬蟲夏草可以通過調節人體代謝環境，營造不利于病原微生物的生存環境［6］。

本研究利用網絡藥理學從整體上分析了冬蟲夏草預防AECB的作用機制，結果表明冬蟲夏草預防AECB是通過多成分、多靶點、多通路的協同來發揮其治療作用的。其發生作用的機制與免疫調節、抗感染和抗炎調節有關。預測的潛在活性成分、靶點、生物功能及通路與文獻報道基本相一致，因此說明本研究的預測具有一定的可靠性，能為挖掘中藥潛在價值提供可靠依據，為進一步深入研究冬蟲夏草防治AECB提供新的思路與理論參考。