金柚幼果黃酮對AAPH誘導紅細胞氧化損傷的保護作用

納雨農 ，陳乃驛 ，張渙悠 ，王琴 ，2，3，肖更生 ，3，劉袆帆 ，2，3*

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510550）（2.仲愷廣梅研究院，廣東 梅州 514799）（3.廣東省嶺南特色食品科學與技術重點實驗室，廣東 廣州 510550）

柚子是我國廣泛種植的水果品種之一，廣東特色品種金柚已成為國家優勢特色產業[1]。未成熟的柚子在生長期自然脫落以及果農進行疏花疏果產生的落果稱為金柚幼果[2]。金柚幼果的研究主要包括膳食纖維、多糖、柚皮苷、活性肽等，本課題組在前期研究中提取了金柚幼果的膳食纖維[2]和多糖[3]，其中總膳食纖維含量為75.63%，在四氧嘧啶誘導小鼠高血糖模型中有效降低小鼠血糖水平，通過調節腸道菌群豐度緩解糖尿病癥狀；發現金柚幼果多糖表面為光滑的多孔網狀結構，借由小鼠RAW264.7巨噬細胞模型驗證多糖的免疫活性。另外，采用響應面法優化后柚皮苷得率為3.8%，發現柚皮苷提取物能有效保護紅細胞免受AAPH自由基的攻擊，顯著降低紅細胞溶血率[4]。除了柚皮和幼果，該課題組還通過共發酵體系提高了柚子核活性肽的含量，在抑菌測試中共孵育柚核多肽，對大腸桿菌的最小抑菌濃度為12.50 μg/mL，其抑菌機理與細菌細胞膜形成孔洞有關[5]。金柚幼果中果瓤占比43%～48%，而柚子果實中黃酮主要存在于果瓤中且在未成熟期累積，故幼果中黃酮含量較高[6-8]。在前期的研究中，羅潔瑩等[6]使用微波超聲輔助法提取并經過相應面優化，總黃酮的提取率達68.57%。經AB-8大孔樹脂純化后，金柚幼果黃酮類化合物（CF）能顯著抑制AAPH誘導紅細胞溶血，并呈現明顯的劑量依賴性[9]。

AAPH氧化誘導劑常用于紅細胞氧化溶血模型中，在水溶液中經熱分解會形成相對穩定的過氧自由基，并且會引發自由基鏈式反應，產生更多種類的自由基[10，11]。以抗氧化活性為跟蹤指標，構建紅細胞氧化模型，測定過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脫氫酶（LDH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的酶活性以及丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）的含量，描述模型中酶促抗氧化通路以及非酶促抗氧化通路的變化情況，以此判斷物質抗氧化活性[10]。張艷梅等[12]建立 H2O2紅細胞溶血模型并發現沙蔥總黃酮濃度在30～520 μg/mL時均能夠抑制H2O2氧化損傷引起的紅細胞溶血，降低紅細胞中MDA含量，提高紅細胞中GSH-Px、SOD、CAT活性，且呈劑量效應性關系。蘇健裕等[13]發現楊梅酮處理會導致 ROS和 MDA含量的降低以及 SOD和GSH-Px的酶活性的增加，且具有一定的劑量依賴性。說明楊梅酮對紅細胞的保護主要是通過增強 SOD和GSH-Px酶活性來清除過多ROS。在前期的研究中，發現CF能直接清除自由基，控制自由基引起的氧化損傷，使酶促抗氧化與非酶促抗氧化保持平衡，從而抑制AAPH引起的紅細胞溶血[9]。

本研究通過制備液相色譜儀進一步純化CF得到含量最高的組分 PF，并使用高效液相色譜-電噴霧質譜（HPLC-ESI-MS/MS）聯用技術[14-16]鑒定PF的化學成分；構建紅細胞抗氧化模型評價體系，探討 PF的抗氧化活性及其機理，本研究為金柚幼果黃酮開發利用提供數據支持；為柚子副產物綜合利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金柚幼果采自廣東省梅州市五華縣金柚種植園。分析純級無水乙醇購自天津市大茂化學試劑廠；甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純，購買于美國天地公司；2，2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH）購自上海瑞永生物科技有限公司；PBS磷酸緩沖液（pH=7.2）購自北京雷根生物技術有限公司；6% O型紅細胞，抗氧化指標檢測試劑盒（LDH、MDA、SOD、GSH-Px、CAT、GSH）均購買于南京建成生物工程研究所。

1.2 設備

XO-SM 超聲波-微波協同反應系統，南京西安歐儀器制造有限公司；PHS-25數顯pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；FA1204B分析天平，上海精科天美科學儀器有限公司；SC-3610低速離心機，安徽中佳科學儀器有限公司；Waters I class液相色譜串聯Q-Tof質譜，美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 金柚幼果黃酮的分離與純化

金柚幼果切碎后，在-40 ℃真空冷凍干燥后磨碎成粉并經過60目篩網，得到的金柚粉避光存放于干燥器中。根據王琴[6]的方法提取金柚幼果粗黃酮：使用60%乙醇作為溶劑進行超聲-微波協同提取，提取過程中溫度控制在60±2 ℃以內，提取完成后以4000 r/min進行離心，時間為10 min，得上清液。將黃酮水提上清液緩慢加入AB-8大孔樹脂柱，避光吸附4 h，洗脫水溶性雜質后用40%乙醇水溶液進行洗脫并收集后，真空濃縮，冷凍干燥得粗黃酮CF。

1.3.2 制備型高效液相色譜制備分離黃酮類化合物PF

將CF充分溶解后上樣于制備液相色譜柱，制備色譜柱為美國沃特斯 Symmetry Prep C18柱（300 mm×7.8 mm，10 μm）；流動相為0.1%甲酸水-乙腈，線性梯度洗脫程序如表1所示；流速為1.0 mL/min。流動相在使用前需經0.45 μm微孔濾膜抽濾，超聲脫氣；進樣量為400 μL；柱溫為30 ℃；檢測波長為280 nm。收集峰面積最大的組分，真空濃縮冷凍干燥后得金柚幼果黃酮（PF）。

表1 制備液相梯度洗脫程序Table 1 Preparation of liquid phase gradient eluting procedure

1.3.3 ESI-LC-MS/MS分析

液相色譜條件如下Waters Cortecs C18色譜柱（2.1 mm ×50 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）梯度洗脫程序如表2所示；流速為 0.3 mL/min，進樣量20 μL；柱溫40 ℃。

表2 ESl-LC-MS/MS液相梯度洗脫程序Table 2 Gradient eluting procedure of ESI-LC-MS/MS

質譜條件如下，離子方式：EIS+；毛細管電壓：2.98 kV；錐孔電壓：25 V；離子源溫度：100 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；質量范圍：50～1200m/z；分析儀真空度：3.25e-7 mBar；錐孔氣體流量：49 L/h；脫溶劑氣體流量：790 L/h。

1.3.4 PF對紅細胞氧化損傷的保護作用

1.3.4.1 紅細胞氧化損傷模型的建立

參考劉袆帆等[17]的方法，使用PBS溶解PF后分別配成濃度為600、700、800、900、1000 μg/mL的待測液。紅細胞懸液在4 ℃下以3000 r/min離心5 min去除上清液，再加入適量PBS溶液后離心，此步驟重復三次后將紅細胞配成體積比為 6%的紅細胞懸液。取0.2 mL紅細胞懸液并加入200 μL待測液，AAPH組加入等體積 AAPH溶液，空白對照組加入等體積PBS溶液，與紅細胞充分混勻，37 ℃下避光緩和震蕩孵育30 min后，加入AAPH溶液，混勻，相同條件下孵育2.5 h后測定實驗結果。實驗設計三次平行取平均。

1.3.4.2 紅細胞溶血率的計算

將孵育結束后的反應液在 4 ℃條件下以 3000 r/min離心10 min，上清液使用酶標儀測定540 nm處吸光值A。取相同濃度的紅細胞懸液加入等體積的水進行裂解，同樣在540 nm處測得吸光值B。

1.3.4.3 紅細胞氧化損傷實驗

將孵育結束后的紅細胞用PBS洗滌2～3次，加入4倍體積超純水裂解細胞，冰浴后于4 ℃、3000 r/min離心5 min，上清液保存于-40 ℃冰箱備用。采用未稀釋的裂解液按照試劑盒的操作方法測定 GSH-Px和LDH，測定GSH-Px和LDH的酶活。GSH的含量測定時，用超純水將裂解液稀釋5倍，具體操作按照試劑盒的指示進行。將裂解液稀釋20倍后，按照試劑盒的方法測定MDA的含量。將裂解液稀釋80倍，按照試劑盒表明的方法測定 SOD的酶活。以上所有實驗重復3次。

1.4 數據處理

使用SPSS 25.0對實驗數據進行單因素方差分析，結果表示為平均值±標準差（mean±SD），以Duncan多邊檢驗對實驗均值進行差異顯著分析（p＜0.05）。用Origin 2018對分析數據作圖。

2 結果與討論

表3 PF化學成分鑒定表Table 3 Table of chemical constituents from young fruit extract of golden pomelo

2.1 金柚幼果黃酮PF的制備及化合物種類分析

如圖所示，經梯度洗脫后的CF共有6個明顯的尖峰。其中，19.852～20.942 min的峰面積為27532.896，標記為峰A。收集峰A，凍干后得到PF。

PF經LC-MS分析后發現共有33種物質，含量最高為12-甲基十四酸甲酯，經鑒定比對，PF中含有8種有機酸、3種有機酸酯、7種生物堿以及2種黃酮類物質。詳細結果如表2所示。物質相對含量如圖2a所示，PF中有機酸及有機酸酯相對含量最高；黃酮類化合物占PF物質含量的28.19%，兩種黃酮類化合物分別為四羥基查爾酮及美鼠李苷，相對含量分別為15.57%、12.62%。

四羥基查爾酮是PF中含量最高的黃酮類化合物，其相對含量為15.57%。如圖3a所示，其化合物分子結構獨特，含有多個反應中心，可以與多種受體結合，從而表現出廣泛的生物活性，可以作為有機合成及藥物合成中間體[28]，天然產物提取的查爾酮類化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗炎等作用[19，29]。Zhong等[30]使用四羥基查爾酮作為中間體合成出的查爾酮類抗白癜風藥物表現出較高的黑素生成能力、抗氧化活性及較低的毒性。美鼠李苷是一種黃酮甙類化合物，具有一定的抗氧化活性[20，31]。黃酮甙類物質具有良好的DDPH自由基清除能力，且能夠抑制α-糖苷酶的活性影響糖代謝，從而對糖尿病小鼠血糖指標有改善作用[32-34]。

2-O-咖啡?；芄帐且环N多酚類物質，最初發現于杜鵑花科熊果屬小灌木植物中[35]，其 DPPH自由基清除率效果略差于Vc[21]。熊果苷能治療由紫外線誘導的各種皮膚色素作用，控制羥基自由基的產生熊果苷是酪氨酸酶抑制劑。它阻斷多巴及多巴醌的合成，從而抑制黑素的生成[36]，在護膚用品和發用制品方面有廣泛的用途[37]。水蘇堿和甜菜堿為生物堿，具有抗菌消炎的作用[38-40]。水蘇堿是益母草抗栓、抗凝、降脂的主要有效成分[25]，已有相關報道表明其對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的保護作用[41，42]，對CCl4所致小鼠肝損傷的保護作用[43，44]。水蘇堿主要通過抑制炎癥因子的表達和氧化應激以及調節MMPs/TIMPs系統來抵抗肝纖維化。水蘇堿有望成為治療肝纖維化的候選藥物[45]。甜菜堿可以保護細胞在高滲透條件下免受損傷。甜菜堿并不能直接清除AAPH自由基，卻可以使機體抗氧化酶活力恢復至正常水平，從而提高植物在逆境中的抵抗能力[11]。Zhang等[24]的研究發現甜菜堿能通過蛋氨酸-同型半胱氨酸循環提高腺苷甲硫氨酸和蛋氨酸的水平，提高系統清除活性氧簇的能力。PF具有多種活性物質，故推測其具有較好的抗氧化活性，為下一步PF的紅細胞抗氧化模型評價奠定基礎。

2.2 PF的紅細胞抗氧化模型評價

通過PF對AAPH誘導紅細胞溶血模型的保護作用研究發現，不同濃度PF下對AAPH誘導的紅細胞溶血保護效果表現出劑量反應，如圖4所示。在相同的孵育條件下，陰性組添加PBS而不經AAPH處理，自然產生的溶血率為20.83%，而AAPH組的溶血率為52.79%，顯著高于經PF處理后的實驗組（p＜0.01）。當PF的含量為1000 μg/mL時，溶血率為31.63%與900 μg/mL的實驗組無顯著差異。在陳華敏等[46]的研究中，使用AB-8大孔樹脂純化高粱糠多酚提取物并得到五種類型酚，其中游離酚、束縛型酚和可溶性酯型酚濃度達到 200 μg/mL時，紅細胞溶血率已降至10%與空白組無顯著性差異而可溶性苷型酚的溶血率仍為28.84%，其中可溶性苷型酚和束縛型苷型酚的抗溶血活性相對較弱，黃酮與苷酚結構相似，酯型酚類化合物抗溶血活性更高。

2.2.1 PF對非酶促抗氧化體系的影響

在紅細胞氧化溶血模型中，自由基攻擊細胞會造成脂質過氧化反應的產生，丙二醛（MDA）則是脂質過氧化反應中的副產物之一，MDA的含量被用作脅迫反應過程的生物標志[10，47，48]。各組 MDA 的含量如圖5所示：AAPH組MDA含量顯著高于陰性組，在經過1000 μg/mL的PF處理后，MDA的含量為27.39 nmol/mg與陰性組25.01 nmol/mg無顯著差異且在不同濃度實驗組之間表現出劑量反應。

乳酸脫氫酶（LDH）參與丙酮酸的代謝，該酶的酶活性與細胞內釋放到細胞外的量有關進而可用于表示細胞的受損程度。如圖6所示，LDH的酶活隨PF的濃度升高而降低，AAPH組LDH酶活為470.85 U/L，明顯高于實驗組。當PF濃度為1000 μg/mL時的LDH的酶活為314.85 U/L，顯著高于濃度為600 μg/mL的實驗組，而與AAPH組有顯著差異，當PF濃度為1000 μg/mL時，LDH的釋放量顯著高于陰性組。

GSH廣泛存在于細胞中，既能維持正常的免疫系統功能，同時參與非酶促抗氧化體系，可以在GSH-Px的催化下與GSSG相互轉化從而應對氧化應激[10，49]。GSH的含量水平可以表征自由基對細胞氧化脅迫反應的程度。圖7可知，AAPH組GSH含量為258.40 μmol/L，顯著低于經過 PF處理的實驗組，且實驗組在不同濃度下存在一定的劑量反應，其中 PF含量大于900 μg/mL時，可以較好維持細胞內GSH含量。

PF濃度為1000 μg/mL可以阻止細胞膜脂質的過氧化反應，緩解非酶促抗氧化體系的氧化應激；在AAPH誘發的氧化應激下，細胞膜的完整性隨著 PF濃度的變化受到不同程度的保護，PF濃度為 1000 μg/mL細胞膜仍受到損傷，但其保護作用表現出與AAPH對照組顯著的差異，同時GSH的含量隨PF濃度上升而提高，說明 PF具有一定的清除自由基的作用。MDA的含量下降，LDH的釋放降低，說明細胞膜完整性上升，PF對細胞膜具有保護作用，在王榮等[50]設計的AAPH誘導紅細胞溶血模型中，亞麻木酚素表現出相似的作用機理，在林戀竹等人[51]的研究中，在250、625、1250 μg/mL三個濃度下處理的紅細胞溶血率、SOD酶活、MDA含量并未表現出明顯劑量反應，與多酚黃酮的作用機理不同。

2.2.2 PF對酶促與抗氧化體系的影響

在紅細胞清除自由基的過程中，SOD是最先發揮作用的抗氧化酶之一，SOD能催化超氧陰離子發生歧化反應，生成毒性相對較低H2O2，再經過GSH-Px酶和CAT酶的催化后分解[10，11，49]。由圖8可知，經PF處理后的實驗組 SOD酶活均與陰性組無顯著差異，酶活均小于 241.04 U/L；AAPH組中 SOD酶活為1146.21 U/L，差異明顯（p＜0.01），無劑量反應，說明在AAPH誘導紅細胞氧化系統中，經PF處理的實驗組紅細胞的自由基平衡不通過酶促抗氧化體系完成。

AAPH自由基誘導劑在水溶液中經熱分解會形成相對穩定的過氧自由基，并且會引發自由基鏈式反應，H2O2也是其中的子產物之一[11]。由圖9可知經AAPH處理的實驗組 CAT酶活顯著高于陰性組 CAT酶活（16.99 U/L），而低于AAPH組CAT酶活（198.55 U/L），說明AAPH誘導紅細胞氧化的模型中參與過氧化氫分解而導致活性上升。CAT酶活性的測試與SOD酶活實驗組相似，并未表現出劑量反應。

由圖10可知，在AAPH的刺激下，紅細胞內的GSH-Px活性被激發，AAPH組的酶活顯著高于實驗組以及陰性組，當PF濃度為1000 μg/mL時，GSH-Px酶活顯著低于其余實驗組且高于未經AAPH處理的陰性組。GSH-Px參與紅細胞內的酶促抗氧化體系[52]，同時參與催化GSH與GSSG的相互轉化。結合SOD酶活和 CAT酶活的結果，酶促抗氧化體系并不是此模型中應對氧化應激的主要通路，所以主要是 GSH與GSSG的相互轉化使得GSH-Px的需求量增加。

綜上所述，經PF處理的實驗組在AAPH誘導紅細胞氧化模型中可以起到抑制紅細胞溶血的作用。1000 μg/mL時MDA含量為27.39 nmol/mL與陰性組25.01 nmol/mL無明顯差異，LDH酶活為314.75 U/L高于陰性組144.96 U/L，說明在模型中，細胞膜受到影響，PF可以起到保護細胞膜的作用。SOD酶活在不同濃度PF處理后未產生劑量反應，說明細胞超氧陰離子并非經SOD分解。細胞內H2O2含量增加導致CAT酶活增加；GSH含量降低而導致GSH-Px酶活增加，說明細胞內自由基主要經過非酶促抗氧化體系清除。

綜合上述指標，紅細胞溶血率降低，完整性得到保護。其內在原因是PF緩解了AAPH誘導的氧化應激，GSH含量高于AAPH組，SOD酶活性與對照組無明顯差異說明 PF能直接清除自由基，并以此緩解自由基引起的氧化損傷。PF中美鼠李苷和2-O-咖啡?；芄諡榭寡趸钚晕镔|，具有清除自由基的能力，在AAPH誘導紅細胞氧化溶血的模型中，推測可以緩解 GSH為主的非酶促抗氧化體系氧化應激，減少氧化應激自由基的產生。水蘇堿與甜菜堿兩種生物堿在PF中的含量較低，推測在模型中起到提升酶促體系中GSH-Px酶活的作用，從而緩解氧化應激。

3 結論

本研究以金柚幼果為對象，采用制備液相收集黃酮類物質PF，并使用ESI-LC-MS在PF中鑒定多種活性物質。通過構建AAPH誘導紅細胞氧化溶血模型，研究了實驗組不同濃度PF處理后溶血抑制率的變化，測定了細胞內抗氧化體系中的關鍵指標，從而推斷PF的抗氧化作用機理。PF具有一定的自由基清除能力，可以緩解AAPH誘導的紅細胞氧化應激，且主要通過非酶促抗氧化體系清除自由基。黃酮提取物中具有抗氧化活性的主要成分為美鼠李苷和 2-O-咖啡?；芄?。該研究為金柚幼果中抗氧化性物質綜合利用提供新思路，為天然產物開發與應用提供理論依據。