頂空固相微萃取-氣質聯用法測定不同時期石虎果實中的揮發性成分

張譽湘，鄭雪源#，張睿胤，鄭亞杰,，陳淼芬，周昊倚，陸英，彭志雄，袁建華，文令，鐘曉紅*，唐其,*

（1.湖南農業大學園藝學院，湖南 長沙 410128；2.國家中藥材生產（湖南）技術中心，湖南 長沙 410128；3.廣西柳城鑫茂種養專業合作社，廣西 柳城 545201；4.長沙和茂農業開發有限公司，湖南 寧鄉 410609）

蕓香科植物石虎Evodia rutaecarpa（Juss） Benth var.officinalis（Dode） Huang的干燥近成熟果實是藥材吳茱萸（Euodiae Fructus）的3種來源之一。吳茱萸為中國大宗傳統常用中藥，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉之功效[1]。據報道[2]，各產地吳茱萸的采收時間各有不同。目前對吳茱萸揮發性成分的檢測主要通過水蒸氣蒸餾提取[3]，且對其本源揮發性成分的研究較少。本研究中，采集了6個時期（7 月中旬、7月下旬、8 月中旬、9 月上旬、9 月下旬、10 月中旬） 的石虎果實，采用頂空固相微萃取-氣質聯用技術（HS-SPME-GC-MS） 對不同時期石虎果實中的揮發性成分進行檢測與解析，分析其變化趨勢，旨在進一步了解和利用其揮發性成分，明確湖南石虎的最佳采收期。

1 材料與方法

1.1 材料

2018 年7 月 17 日、7 月 31 日、8 月14 日、9 月 1 日、9 月 29 日、10 月 24 日于湖南農業大學國家中藥材生產（湖南）技術中心試驗基地采集了扦插于同一母本的3 株石虎果實，經50 ℃干燥2 d，備用。

1.2 主要儀器與裝置

MODULYOD-230 冷凍干燥機，賽默飛世爾科技有限公司出品；GCMS-QP2010 型氣相色譜-質譜聯用儀（包括 GC/MS solution 色譜工作站和NIST.14、NIST.17 質譜數據庫），日本島津公司出品；固相微萃取裝置、固相微萃取進樣手柄、萃取纖維頭（85 μm PA），上海安譜實驗科技有限公司出產。

1.3 樣品預處理

將同一時期采集的樣品混合冷凍干燥至恒重，使用球磨儀打粉并過篩（孔徑25.4 mm）。取約 0.1 g樣品，放置在頂空樣品瓶中，備用。

1.4 萃取纖維針頭老化

設定氣化室溫度為240 ℃，將萃取纖維針頭插入氣相色譜儀的氣化室，老化40 min 后取出。

1.5 萃取與解吸附

固相微萃取裝置的溫度設為70 ℃，頂空瓶置于樣品槽內預熱 40 min 后，將萃取進樣手柄插入頂空樣品瓶中，萃取40 min。進樣口溫度設為 240 ℃，將萃取完成后的萃取進樣手柄插入氣相色譜儀進樣口中，解析 5 min。

1.6 GC-MS 條件

采用CD-WAX 色譜柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm），柱內溫度 60 ℃，進樣口溫度 240 ℃；進樣方式為無分流，載氣氣體流速 0.98 mL/min；離子源為EI 源，離子源溫度為 200 ℃，接口溫度為 220℃，電子能量為 70 eV，質荷比掃描范圍為 45～500 m/z。氣相色譜儀升溫條件：初始溫度為60 ℃，保持 2 min；以 3 ℃/min升至 100 ℃，保持5 min；再以 3 ℃/min升至 190 ℃，保持 5 min；最后以 10℃/ min 升至 220 ℃，保持 5 min。MS 采集時間為70 min。

1.7 揮發性成分的檢測與定性

利用 GC/MS solution 中的 NIST.14、NIST.17標準譜庫檢索色譜圖中可能存在的化合物，并結合文獻資料進行定性分析，推測化合物的結構。采用峰面積歸一化法計算各成分的相對含量。

1.8 數據分析與統計

采用 Microsoft Excel 2019 進行數據整理與統計；運用 Origin 2018 繪圖。

2 結果與分析

2.1 揮發性成分解析

石虎果實中的揮發性成分總離子流圖如圖 1所示。6 個時期的石虎果實中共鑒定出 72 種揮發性成分（表 1），其中，共有成分有 47 種。72 種成分中包含醇類（26.39%）、芳香烴類（1.39%）、烯烴類（29.17%）、酮類（11.11%）、吡唑類（1.39%）、醛類（4.17%）、酯類（12.50%）、醚類（11.11%）和酚類（2.77%）共9 種化合物，其中萜類化合物占比51.39%，包括單萜類化合物（36.11%）和倍半萜類化合物（15.28%）。6 個時期石虎果實的主要揮發性成分為順式-β-羅勒烯、β-月桂烯和β-水芹烯，平均含量占比均超過10%。

圖1 石虎果實揮發性成分總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components of the fruits of Evodia rutaecarpa

表1 不同時期石虎果實的揮發性成分Table 1 The volatile components of the fruits of Evodia rutaecarpa in different periods

表1(續)

2.2 萜類化合物的含量變化

6 個時期石虎果實中的關鍵揮發性成分的含量變化如圖 2、圖3 所示。從圖2 可知，72 種化合物中萜類化合物的含量占比均超過80%，可見萜類化合物是石虎果實中的主要揮發性成分。從圖3-a可以看出，單萜類化合物的占比在8 月中旬最高，6 個時期的含量差異不大。單萜類成分的主要化合物為順式-β-羅勒烯，β-月桂烯和β-水芹烯；β-月桂烯的含量變化最大，其含量變化達9.53%；順式-β-羅勒烯的含量在7 月最高，8 月中旬時含量占比減少，9 月上旬含量占比增大，而后2 個時期持續減少；這3 種化合物含量占比的總和在8 月中旬最高（55.9%）。從圖3-b 可以看出，倍半萜類化合物的含量占比在9 月上旬時最高。β-欖香烯、右旋大根香葉烯和α-瑟琳烯為主要的倍半萜類成分，β-欖香烯的含量占比在7 月中旬最高，右旋大根香葉烯和瑟琳烯在9 月上旬達到最高值。

圖2 不同時期石虎果實中萜類成分的含量Fig.2 Contents of terpenoids of the fruits of Evodia rutaecarpa in different periods

圖 3 不同時期石虎果實中關鍵揮發性成分的含量Fig.3 The key volatile components of the fruits of Evodia rutaecarpa in different periods

3 結論與討論

頂空固相微萃取-氣質聯用技術操作便捷、靈敏度高，大大縮短了試驗時長，且無需溶劑提取，能對樣品中本源揮發性成分進行分析。目前，應用HS-SPME-GC-MS 技術對石虎中揮發性成分的研究較少。本研究中，采用HS-SPME-GC-MS 技術測定了石虎果實中的揮發性成分，發現其中含有大量順式-β-羅勒烯、β-月桂烯、β-水芹烯，與LIU 等[3]的研究結果基本一致。但LIU 等[3]研究發現，8 月湖南石虎果實的揮發油中β-月桂烯的含量是順式-β-羅勒烯的2 倍，而本研究發現，8—10 月，順式-β-羅勒烯在石虎果實揮發性成分中的占比均較高，推測可能是由于水蒸氣蒸餾法和頂空固相微萃取法對揮發性成分的提取側重點不同所致。楊占南等[4]應用 HS-SPME-GC-MS 技術檢測疏毛吳茱萸中的揮發性成分，共鑒定出77 種化合物，其中主要為右旋大根香葉烯、順式-β-羅勒烯、β-欖香烯和石竹烯。本研究中，右旋大根香葉烯的平均含量占比只有3.62%，石竹烯含量不足1%，推測這種差別可能是由于品種和產地不同所致。

本研究中，石虎果實揮發性成分中含有大量單萜類化合物和倍半萜類化合物，其中，欖香烯可用于多種癌癥的治療[5]，月桂烯可用于腎臟炎癥的治療[6]，羅勒烯可開發成抗高溫試劑[7]，水芹烯可作為天然的殺蟲劑[8]，芳樟醇在食品、日化等領域常被用作天然的食品添加劑與賦香劑[9]，表明石虎果實具有較高的綜合利用價值。

吳茱萸的最佳采收期受品種和產地的影響[10]。本研究結果表明，石虎果實中的揮發性成分主要為順式-β-羅勒烯、β-月桂烯和β-水芹烯，這3 種化合物含量的占比總和在8 月中旬最高，可為湖南石虎最佳采收期的判斷提供參考。