薊馬取食誘導對紫花苜蓿次生代謝物含量及防御酶活性的影響

吳芳，師尚禮，康文娟，陳曉梅，阿蕓，張輝輝，李自立

（甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

隨著我國從“糧-經”種植結構到“糧-經-飼”種植結構的轉變，草產業呈現出強勁的發展勢頭，被稱為“牧草之王”的紫花苜蓿（Medicago sativa）種植面積也逐年增加。甘肅省作為紫花苜蓿生產的第一大省，紫花苜蓿種植面積占全國的1/3，尤其在金昌、張掖和酒泉等河西地區形成了苜蓿主產區［1］。然而，薊馬類害蟲是紫花苜蓿主產區最常見的害蟲之一［2-4］。調查發現為害紫花苜蓿的薊馬種類分別有牛角花齒薊馬（Odontothrips loti）、苜蓿薊馬（O.phateratus）、普通薊馬（Thrips vulgatissiums）、花薊馬（Frankliniella intonsa）、煙薊馬（T.tabaci）等，其中牛角花齒薊馬為優勢種［5-8］。薊馬通過銼吸式口器主要將苜蓿的心葉、嫩葉等幼嫩組織的表皮挫破，引起葉片畸形、褪色，嚴重時卷曲發白，導致草產量損失、營養價值降低。此外，因薊馬個體微小、隱蔽性強、繁殖速度快、易產生抗藥性，單一的殺蟲劑難以取得理想的防治效果［9］。因此，選育抗薊馬苜蓿品種是防治該蟲的重要策略和有效方法，而探索和挖掘紫花苜蓿自身形成的抗薊馬生理機制是抗蟲育種的基礎。

植物受到害蟲為害后，其植株體內防御途徑中的信號分子會誘導產生其下游化學防御物質，防御酶和某些次生代謝物會在極短的時間內迅速合成并大量積累，從而激活誘導型防御機制，增強自身抗性［10-12］。植物體內的黃酮、單寧和木質素等次生代謝產物能阻礙害蟲取食，影響害蟲生長、發育和繁殖，其含量與植物抗蟲性密切相關［13-14］。王小珊［15］研究表明不同蟲口壓力牛角花齒薊馬為害后，抗薊馬苜蓿無性系R-1和感薊馬苜蓿無性系I-1葉片中的總酚、黃酮、縮合單寧和木質素含量均高于對照。駱桂芬等［16］和蔣桂華等［17］研究指出植物受到蟲害或病害侵染時，可以誘導木質素含量升高。孫興華等［18］研究表明黃瓜（Cucumis sativus）受南美斑潛蠅（Liriomyza huidobrensis）為害后，其葉片的黃酮和單寧含量隨著為害程度增強而顯著增加。吳巖等［19］研究發現木瓜秀粉蚧（Paracoccus marginatus）為害木薯（Manihot esculenta）前后，抗蟲木薯品種的單寧含量均顯著高于感蟲木薯品種。以往的研究證實過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）是植物次生代謝過程中的關鍵酶，它們在植物抵抗害蟲方面起著重要的保護作用［20-21］?？芙瓭龋?2］研究指出薊馬為害后，抗、感薊馬苜蓿無性系R-I和I-1的POD、PAL和PPO活性升高可能是一種誘導抗性的表現。蘆屹等［23］研究指出棉蚜（Aphis gossypii）取食脅迫后，抗蚜棉花品種的POD、PAL和PPO活性顯著高于感蚜棉花品種。武德功等［24］研究指出隨著玉米蚜（Rhopalosiphum maidis）密度的增加，玉米（Zea mays）抗蚜品種的PAL和PPO活性呈上升趨勢。然而，薊馬取食誘導對不同抗薊馬紫花苜蓿品種次生代謝物質含量與防御酶活性的影響很少報道。

因此，本研究以3種不同抗薊馬紫花苜蓿品種為材料，研究不同薊馬頭數為害對紫花苜蓿苗期的次生代謝物質（黃酮、單寧、木質素）含量和防御酶（POD、PAL、PPO）活性的影響，以期闡明薊馬為害紫花苜蓿的誘導型防御的生理機制，為篩選紫花苜蓿關鍵抗蟲次生代謝物提供理論基礎，為薊馬綜合防治提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試蟲源：甘肅農業大學校內牧草實訓基地田間自然發生的薊馬成蟲（牛角花齒薊馬為優勢種）。

供試紫花苜蓿品種分別為抗薊馬紫花苜蓿品種甘農9號（M.sativacv.Gannong No.9）［25］、感薊馬紫花苜蓿品種甘農3號（M.sativacv.Gannong No.3）［4］和高感薊馬紫花苜蓿品種WL363HQ（M.sativacv.WL363HQ）［26］。甘農9號和甘農3號種子由甘肅農業大學草業生態系統教育部重點實驗室提供，WL363HQ由北京正道種子公司提供。

1.2 試驗設計

1.2.1紫花苜蓿幼苗生長試驗2020年6月至8月在甘肅農業大學牧草實訓基地8 m×6 m×2 m的網室中進行。將營養土∶草炭土∶蛭石按比例2∶1∶1混合均勻，稱取750 g裝入花盆（高度為18 cm，直徑為12 cm）中，將花盆的2/3埋入土中，置于田間環境條件下發芽和生長。將0.1% HgCl2消毒后的飽滿、大小均勻的種子，播種于花盆中，出苗后每盆保留生長一致的5株幼苗。根據需要每隔2～3 d澆水1次，隔7 d澆灌100 mL/盆 Hoagland營養液，保證幼苗正常生長。為了排除薊馬及其他害蟲，將紫花苜蓿幼苗保護在覆蓋有60目防蟲網的網室中。紫花苜蓿生長45 d后，開始接入薊馬成蟲進行試驗。

1.2.2試驗設計試驗采用隨機區組試驗設計，每個處理中3個品種隨機擺放，每個品種4盆，相鄰處理間的間距為50 cm，重復3次。紫花苜蓿每個枝條分別接種4頭、5頭、6頭薊馬成蟲，每個處理單獨用60目防蟲網罩住以防薊馬逃逸，對照組不接蟲（CK），也罩上防蟲網。由于薊馬體長1.5 mm或更小，接蟲時盡量避免對薊馬的傷害。薊馬為害5 d后隨機收集紫花苜蓿植株的葉片，迅速置于液氮中冷凍20 min，然后保存于超低溫-80 ℃冰箱中，每個處理重復3次，用于測定次生代謝物含量、防御酶活性等。

1.3 測定指標

次生代謝物含量測定：黃酮含量采用亞硝酸鈉—硝酸鋁比色法測定［27］；單寧和木質素含量采用蘇州格銳思試劑盒測定。

防御酶活性測定：過氧化物酶活性參照鄒琦［28］的方法，采用愈創木酚法測定；苯丙氨酸解氨酶參照參考劉佳［29］方法測定；多酚氧化酶采用蘇州格銳思試劑盒測定。

1.4 數據分析

利用Excel 2016整理數據并作圖，采用SPSS 20.0軟件對數據進行單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 薊馬取食誘導對不同抗薊馬性紫花苜蓿品種次生代謝物的影響

隨著薊馬頭數的增加，甘農9號的黃酮含量呈上升趨勢，而甘農3號和WL363HQ的黃酮含量呈先增后減的變化趨勢（圖1）。薊馬取食誘導顯著增加了供試紫花苜蓿品種的黃酮含量（P＜0.05），甘農9號的黃酮含量較CK分別提高了1.03%，2.86%，6.89%；甘農3號的黃酮含量較CK分別提高了4.16%，6.47%，5.71%；WL363HQ的黃酮含量較CK分別增加了3.09%，5.15%，4.17%。在6頭/枝條處理下甘農9號的黃酮含量顯著高于甘農3號和WL363HQ（P＜0.05），增幅分別為1.79%，2.13%。在4、5頭/枝條處理下，供試紫化苜蓿品種的黃酮含量差異不顯著。

圖1 薊馬取食誘導后紫花苜蓿品種的黃酮含量Fig.1 The flavonoids contents of alfalfa cultivars after infecting by thrips

薊馬取食誘導顯著增加了供試苜蓿品種的單寧含量（P＜0.05）（圖2）。與CK相比，4頭/枝條處理下甘農9號、甘農3號和WL363HQ的單寧含量增幅分別為74.18%，28.22%，35.18%，表明薊馬取食脅迫后甘農9號的單寧含量變化較甘農3號和WL363HQ敏感。甘農9號的單寧含量在5頭/枝條處理下達最高（2.23 mg/g），較CK顯著提高了83.75%；而甘農3號和WL363HQ的單寧含量均在4頭/枝條處理下增至最高。相同薊馬頭數取食誘導處理下甘農9號的單寧含量均顯著高于甘農3號和WL363HQ（P＜0.05），較甘農3號提高了31.28%，53.49%，47.70%；較WL363HQ增加了34.06%，71.52%，58.60%。

圖2 薊馬取食誘導后紫花苜蓿品種的單寧含量Fig.2 The tannin contents of alfalfa cultivars after infecting by thrips

薊馬取食誘導后供試苜蓿品種的木質素含量變化與單寧相似，均呈先增后減的變化趨勢，且顯著高于CK（P＜0.05）（圖3）。與CK相比，甘農9號的木質素含量顯著增加了16.14%，21.72%，18.16%；甘農3號的木質素含量顯著提高了18.01%，15.90%，11.94%；WL363HQ的木質素含量增幅分別為16.45%，19.83%，15.82%（P＜0.05）。5、6頭/枝條處理下，甘農9號的木質素含量顯著高于甘農3號和WL363HQ（P＜0.05），較甘農3號和WL363HQ分別增加了5.60%，3.50%；6.13%，3.96%，但甘農3號和WL363HQ的木質素含量未達顯著差異。

圖3 薊馬取食誘導后紫花苜蓿品種的木質素含量Fig.3 The lignin contents of alfalfa cultivars after infecting by thrips

2.2 薊馬取食誘導對不同抗薊馬苜蓿品種防御酶活性的影響

甘農9號、甘農3號和WL363HQ的POD活性隨著薊馬頭數的增加呈上升趨勢，且顯著高于CK（P＜0.05）（圖4）。與CK相比，薊馬取食誘導后甘農9號的POD活性增幅分別為3.44%，14.42%，28.76%；甘農3號的POD活性增幅分別為10.91%，15.09%，26.32%；WL363HQ的POD活性增幅分別為12.24%，13.99%，26.74%（P＜0.05）。相同薊馬頭數處理下供試苜蓿品種的POD活性存在顯著差異（P＜0.05）。WL363HQ的POD活性在4頭/枝條處理下較甘農9號和甘農3號分別顯著提高7.47%，3.44%；而5和6頭/枝條處理下甘農9號的POD活性較甘農3號和WL363HQ分別顯著增加2.60%，1.36%；5.19%，2.58%（P＜0.05）。

圖4 薊馬取食誘導后紫花苜蓿品種的POD活性Fig.4 POD activities of alfalfa cultivars after infecting by thrips

隨著薊馬頭數的增加，甘農9號的PAL活性呈持續上升趨勢，甘農3號和WL363HQ的PAL活性呈先升后降的變化趨勢（圖5）。與CK相比，薊馬取食誘導顯著提高了供試苜蓿品種的PAL活性（P＜0.05），甘農9號PAL活性的增幅分別為16.40%，22.12%，26.37%；甘農3號PAL活性的增幅分別為8.99%，31.60%，25.88%；WL363HQ的PAL活性增幅分別為6.98%，14.94%，10.77%。4、5和6頭/枝條處理下甘農9號的PAL活性均顯著高于甘農3號和WL363HQ（P＜0.05），較 甘 農3號 分 別 提 高 了16.35%，1.09%，9.36%；較WL363HQ分別增加了6.04%，3.54%，11.18%（P＜0.05）。

圖5 薊馬取食誘導后紫花苜蓿品種的PAL活性Fig.5 PAL activities of alfalfa cultivars after infecting by thrips

供試苜蓿品種的PPO活性隨薊馬頭數的增加均呈下降趨勢，且顯著低于CK（P＜0.05）（圖6）。與CK相比，甘農9號的PPO活性分別顯著降低了13.59%，22.63%，25.66%；甘農3號的PPO活性分別顯著減少了12.63%，23.43%，24.58%；WL363HQ的PPO活性分別顯著下降了12.04%，16.87%，41.25%（P＜0.05）。4、5頭/枝條處理下WL363HQ的PPO活性較甘農9號分別顯著增加了3.18%，8.91%，較甘農3號分別顯著提高了5.49%，13.76%（P＜0.05）；而6頭/枝條處理下甘農9號的PPO活性較甘農3號和WL363HQ分別顯著提高了1.89%，24.84%（P＜0.05）。

圖6 薊馬取食誘導后紫花苜蓿品種的PPO活性Fig.6 PPO activities of alfalfa cultivars after infecting by thrips

3 討論

昆蟲取食誘導是植物防御系統啟動的重要誘因。昆蟲口腔分泌物中的誘導子使植物對危害信號進行識別，進而啟動防御系統產生誘導抗性，如通過 POD 、PAL、PPO及 LOX等多種防御酶的催化，誘導植物體內酚類、生物堿、萜類等多種有毒次生代謝物質的積累，從而直接或間接提高抗蟲能力［30-32］。酚類物質是高等植物中普遍存在的次生代謝產物，其中黃酮是一類對昆蟲有毒的酚類物質，可以影響昆蟲的取食，延緩昆蟲的生長發育，嚴重時導致昆蟲中毒甚至死亡［33］。張華峰［34］研究表明隨著松墨天牛（Monochamus alternatus）為害程度的加劇，馬尾松（Pinus massoniana）針葉的黃酮含量呈先上升后下降的變化特點。馬榮金等［35］研究指出不同抗性黃瓜（Cucumis sativus）材料被蚜蟲侵染后，黃酮含量呈先增后減的變化趨勢。本研究發現抗薊馬苜蓿品種甘農9號的黃酮含量呈上升趨勢且顯著高于CK，而感薊馬苜蓿品種甘農3號和高感薊馬苜蓿品種WL363HQ的黃酮含量呈先升后降趨勢，說明甘農9號合成的黃酮較甘農3號和WL363HQ多，從而對薊馬的取食產生不利影響，抵御了薊馬為害，因此甘農9號表現出良好的抗性。

單寧被認為是一類有效的防御化合物，它主要干擾昆蟲的腸道消化、抑制多種消化酶的活性，破壞昆蟲的正常代謝，從而影響昆蟲對食物的利用［36-37］。賈彥霞等［38］研究指出5個辣椒品種葉片的單寧含量隨西花薊馬（F.occidentalis）取食誘導表現為先升后降的變化特點，抗性品種74-82和嬌龍的單寧含量顯著高于其他品種。本研究結果表明，薊馬取食誘導顯著提高了供試苜蓿品種的單寧含量，這與賈彥霞等［38］的研究結果一致，即抗薊馬品種甘農9號的單寧含量顯著高于甘農3號和WL363HQ。王小珊等［39］研究表明牛角花齒薊馬（O.loti）為害后，抗薊馬苜蓿R-1和感薊馬苜蓿I-1葉片的木質素含量均升高，且R-1的木質素含量增加率均高于I-1。蔡沖等［40］研究指出煙粉虱（Bemisia tabaci）脅迫9 h后番茄抗蟲品種（Hongshengnv，HSN）的葉片木質素含量顯著高于感蟲品種（Huangshengguo，HSG）。在本研究中，薊馬取食誘導后，供試苜蓿品種的木質素含量顯著增加，表明受害葉片細胞壁木質化增加、機械組織增強。當每枝條超過4頭薊馬時甘農9號的木質素含量顯著高于甘農3號和WL363HQ，這與王小珊等［39］和蔡沖等［40］的研究結果一致。本研究說明薊馬取食誘導可誘導苜蓿葉片中黃酮、單寧和木質素含量增加，該結果為進一步揭示寄主植物苜蓿與薊馬之間的防御機制提供了基礎。

過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）是植物在生物脅迫和非生物脅迫的防御酶，POD參與木質素的合成，PAL參與黃酮、單寧和木質素等的合成和積累，PPO可促進多酚的合成［41-43］。He等［44］研究發現在接種蚜蟲的早期，菊花（Dendranthema morifolium）3個品種通過提高PAL和PPO活性來對蚜害做出快速響應。沈登榮等［45］研究表明端大薊馬（Megalurothrips distalis）取食脅迫顯著提 高 了 菜 豆（Phaseolus vulgaris）、豇 豆（Vigna unguiculata）和蠶豆（Vicia faba）的POD活性。本研究發現薊馬取食誘導后不同抗薊馬苜蓿品種的POD和PAL活性顯著上升，而PPO活性顯著下降。此外，當薊馬頭數超過4頭/枝條時，抗薊馬苜蓿品種甘農9號的POD和PAL活性顯著高于感薊馬苜蓿品種甘農3號和高感薊馬苜蓿品種WL363HQ，說明隨著薊馬為害程度的加劇，POD和PAL活性增強可誘導木質素、黃酮的大量合成，有助于提高甘農9號的抗性。然而，植物誘導型防御是一個復雜的過程，從植物誘導防御的整體性和系統性方面考慮，薊馬對誘導次生代謝物質的代謝通路有待于進一步研究。

4 結論

隨薊馬頭數的增加，甘農9號的黃酮含量、POD和PAL活性呈持續增加趨勢，單寧和木質素含量呈先升后減的趨勢，PPO活性呈下降趨勢；而甘農3號和WL363HQ的POD和PAL活性呈上升趨勢，黃酮、單寧和木質素含量均呈先增后減的變化特點，PPO活性不斷下降。此外，5和6頭/枝條處理下甘農9號的單寧、木質素含量和POD、PAL活性均顯著高于甘農3號和WL363HQ，因而甘農9號表現出較強的抗性。