AuNCs@BSA/抗生素的制備及性能研究

馬德彪，張小舟，韓常雨，劉洋，劉欣

AuNCs@BSA/抗生素的制備及性能研究

馬德彪，張小舟，韓常雨，劉洋，劉欣

（齊齊哈爾大學 材料科學與工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

研究制備了一種微波輔助制備牛血清白蛋白包封熒光金納米團簇(AuNCs@BSA)。通過熒光光譜，透射電子顯微鏡等對其最佳實驗條件進行了探究。分別改變其反應溫度及反應時間，測試其粒徑及熒光強度的變化，以此來探究出最佳反應條件。蛋白質可以作為保護劑用于金納米簇合成。這些生物大分子本身具有優良的生物相容性，與抗生素相結合，對部分抗生素具有藥效增強的作用，并且對AuNCs@BSA的熒光性能沒有大的影響，又提供了藥物熒光示蹤的可能。

AuNCs@BSA； 青霉素； 阿莫西林； 大腸桿菌； 金黃色葡萄球菌

金納米材料是最早出現的納米材料，具有制備方便、生物相容性好、易于進行表面修飾和性質穩定等優點，在生物醫學分析和成像中有廣泛應用。金納米簇(AuNCs)是近年來出現的一種新型發光材料，其性質類似于分子，生物相容性好且具有較強熒光，將具有廣闊的應用前景。熒光金納米團簇(AuNCs)由幾個到幾十個金原子組成。由于它們具有類似分子的特性，因此被認為是具有多種生物應用價值的材料[1]。金納米簇的合成主要有兩種策略：自下到上和自上到下。第一種自下到上的策略是把金離子還原成金原子再通過成核作用形成金納米簇，化學還原法、生物還原法、光致還原法、電化學還原法和光致還原法屬于這一類。另一種自上到下的策略是把較大的金納米粒子或金納米簇蝕刻以產生超小型的金納米簇，例如化學蝕刻法。這些合成方法中最常用的還是化學還原法、光致還原法和化學蝕刻法三種。除此以外，金屬納米簇的合成方法還有微波合成法、電致合成法、電化學法、微乳法、相轉移法和低溫氣相沉淀法等[2-5]。

2009年，Xie等首次展示了一種制備熒光牛血清白蛋白(BSA)保護AuNCs (BSA-AuNCs)的簡單方法[6-7]。這些AuNCs含有25個金原子，它們呈現出紅色發射。但它們需要較長的制備時間，且pH值為8.0。最近，又有一種通過蝕刻和鈍化合成烷硫醇保護的AuNCs@BSA的方法被開發出來。所使用的烷硫醇的性質以及金屬-硫醇相互作用是決定這些AuNCs@BSA結構和電子性質的關鍵因素，因為它們導致AuNCs@BSA中不同程度的熒光增強。上述方法可用于制備從藍色到紅外的離散高質量熒光發射的AuNCs@BSA，但AuNCs@BSA仍需要較長的蝕刻時間[8-10]。2017年首次報導出一種利用微波加熱技術開發了一種更高效的微波加熱系統AuNCs@BSA的制備方法。微波加熱不僅將反應時間從幾十小時減少到幾分鐘，而且還抑制了副反應，從而提高了特定合成方案的收率和重現性[11-14]。此外，由于小型AuNCs@BSA的合成對反應條件高度敏感，所以鎢輔助的方法可以對AuNCs@BSA的生長提供更大的控制，從而提高其光學性能。并且，用這種方法得到的AuNCs@BSA仍然呈現紅色發射。感染性疾病一直嚴重威脅著人類健康的，對細菌性傳染病的早期診斷來說，細菌病原體準確鑒別是關鍵，然而，傳統的檢測方法如細胞培養、生化檢測、免疫學檢測和遺傳學分析都是耗時耗力的，對于危重病人來說可能會錯過最佳治療機會。熒光金納米簇已經開始被應用于細菌感染診斷和生物成像。具有良好水溶性和高熒光量子產率的以甘露糖為保護劑的金納米簇可以被用于檢測大腸桿菌，其利用表面上的甘露糖殘基與大腸桿菌細胞上的甘露糖受體相互作用而結合在大腸桿菌細胞上。Chan和Chen報道了一種基于人血清白蛋白為保護劑的熒光金納米簇HSA- AuNCs的檢測細菌的方法，HSA-AuNCs可以特異性地與金黃色葡萄球菌結合[15]。

本研究探索了制備AuNCs@BSA最佳反應條件。結合AuNCs@BSA抑菌的特性，并與抗生素相結合，以此來測試是否可以提高部分抗生素藥效，有效地抑制病菌的生長，并且測試了AuNCs@BSA的熒光特性，結果表明在與抗生素結合后對其熒光性能沒有大的影響，又提供了藥物熒光示蹤的可能。

1 實驗部分

1.1 材料

四氯金酸（北京伊諾凱科技有限公司），牛血清白蛋白（北京伊諾凱科技有限公司），硫酸奎寧（北京伊諾凱科技有限公司）、核黃素-5?-磷酸鹽（寧波貝伽爾新材料有限公司）、氫氧化鈉（天津市科密歐化學試劑有限公司），去離子水。

1.2 AuNCs@BSA的制備

2.5 mL的50 mg·mL-1BSA溶液加入2.5 mL 10 mM的HAuCl4溶液，在室溫下攪拌。然后滴加0.25 mL 1.0 M NaOH溶液。溶液混合物在300 W下加熱至80 ℃ 4 min。自然冷卻至室溫，離心除去大顆粒，放入透析袋，每隔6 h換1次水，提純48 h后凍干，4 ℃保存。

1.3 大腸桿菌/金黃色葡萄球菌的制備

將大腸桿菌標準菌株接種于營養肉湯培養基，37 ℃、200 r·min-1培養 12 h。隨后10 000 g 離心5 min，棄去上清液，菌泥用PBS重懸并稀釋，得到適宜濃度的大腸桿菌菌液。將保護劑，加入大腸桿菌菌液后，將保護劑分裝至棕色西林瓶中。液體LB培養基，稱取10 g胰蛋白胨，5 g酵母粉，10 g氯化鈉，121℃，滅菌30 min。將大腸桿菌接種到冷卻后的LB后放置搖床中，37 ℃，220 r·min-1, 培養12 h。

將金黃色葡萄球菌接種到TSA+YE(0.6%酵母浸粉的胰蛋白胨大豆瓊脂)上，在37 ℃恒溫恒濕培養箱中培養24 h，用接種環挑取單菌落至TSB+ YE (0.6%酵母浸粉的胰蛋白胨大豆肉湯)中，在37 ℃，150 r·min-1條件下振蕩培養12 h至穩定前期，放置4 ℃冰箱中備用。

0.2 g的抗生素溶于5 mL去離子水，加入0.1 mL AuNCs@BSA, 混合完全后滴加到大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中，24 h后觀察結果。

2 結果與討論

2.1 不同比例下的AuNCs@BSA熒光對比圖

由表1可知，本研究設計了四種物料比，分別改變HAuCl4，BSA，NaOH的量，比例分別為1∶1∶0.25，1∶1∶0.5，2∶1∶0.25，1∶2∶0.25四種物料比。并直觀的在365 nm紫外燈下觀察熒光的強弱。

表1 制備AuNCs@BSA的原料配比

圖1 不同配比下AuNCs@BSA的高清圖及在紫外燈下的熒光對比圖

圖1可明顯看出，改變物料比，產物的顏色有明顯不同，在365 nm：紫外光下可明顯看出，深棕色的溶液熒光明顯。

圖2 AuNCs@BSA熒光光譜圖

圖2是使用熒光光譜儀測試的強度，分別將不同物料比的AuNCs@BSA取10 μL AuNCs@BSA溶于10 mL去離子水中，進行熒光測試，在375 nm激發下，在550～650紅外光區達到最高值，在物料比為1∶1∶0.25時，AuNCs@BSA熒光強度最強。

圖3 AuNCs@BSA與消炎藥結合原理圖

采取一種簡單的辦法，將AuNCs@BSA與消炎藥結合，充分混合后，滴到含有致病菌的培養基上，24 h后，觀察抑菌圈的大小，可以直觀地觀察到AuNCs@BSA是否對抗生素有無增強作用，本研究選用了兩種常見的致病菌，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌用來做對照試驗。

圖4（a）選用的菌種為大腸桿菌，由圖可明顯看出，AuNCs@BSA與青霉素結合雖并未增強對大腸桿菌的抑制作用，但是阿莫西林與AuNCs@BSA的結合對大腸桿菌的抑制作用有明顯增強。圖4（b）選用的菌種為金黃色葡萄球菌，由圖可明顯看出，AuNCs@BSA與兩種消炎藥的結合均大幅提高了對金黃色葡萄球菌的抑制作用。

圖4 AuNCs@BSA/青霉素和AuNCs@BSA/阿莫西林抑菌實驗效果圖

圖5 （a）AuNCs@BSA/青霉素結合后8 h內的熒光強度變化圖;（b）AuNCs@BSA/阿莫西林結合后8 h內的熒光強度變化圖

圖5為AuNCs@BSA/青霉素/阿莫西林結合后8 h內的熒光光譜圖，分別混合后，2 h，4 h，6 h，8 h測試其熒光強度，AuNCs與青霉素相結合后8 h內熒光強度沒有太大變化，可以依舊保持AuNCs@BSA的熒光特性，雖然在與阿莫西林的幾個小時后熒光強度發生了微量減弱，但是依舊保持著很高的熒光強度，所以為藥物示蹤提供了可能。

3 結 論

本研究探索了制備AuNCs@BSA最佳反應條件。并與抗生素相結合，以此來提高部分抗生素藥效，可以有效地抑制病菌的生長，發展快速簡便的方法，對解決基層臨床和野外等特殊場合的細菌問題有重要意義。選擇合適的指示物用于標記細菌細胞是大多數細菌檢測技術的基礎，很多具有鮮艷的顏色的染料和能發出特定熒光的熒光物質陸續被選作細菌細胞標記物。金納米材料具有廉價易制備易保存的優點，其中金納米粒子溶液具有鮮艷的顏色，金納米簇能在被激發后發出強烈的熒光，分別可以用于熒光標記。并且測試了AuNCs@BSA的熒光特性，結果表明在與抗生素結合后對其熒光性能沒有大的影響，又提供了藥物熒光示蹤的可能。

[1]CAO X L, LI H W, YUE Y, et al. pH-Induced conformational changes of BSA in fluorescent AuNCs@BSA and its effects on NCs emission[J]., 2013, 65:186-192.

[2]ZHANG H, HUANG X, LI L, et al. Photoreductive synthesis of water-soluble fluorescent metal nanoclusters[J].., 2012, 48 (4): 567-569.

[3]SANTIAGO GONZALEZ B, RODIGUEZ M J, BLANCO C, et al. One step synthesis of the smallest photoluminescent and paramagnetic PVP- protected gold atomic clusters[J].., 2010, 10 (10): 4217-21.

[4]WANG J L, ZHANG G, LI Q, et al. In vivo self-bio-imaging of tumors through in situ biosynthesized fluorescent gold nanoclusters[J].., 2013, 3.

[5]XIE J P, ZHENG Y G, YING J Y. Protein-directed synthesis of highly fluorescent gold nanoclusters[J].., 2009, 131 (3): 888-889.

[6]CAO X , LI H , LIAN L , et al. A dual-responsive fluorescence method for the detection of clenbuterol based on BSA-protected gold nanoclusters[J]., 2016, 871.

[7]ZHANG M , DANG Y Q , LIU T Y , et al. Pressure-Induced Fluorescence Enhancement of the BSA-Protected Gold Nanoclusters and the Corresponding Conformational Changes of Protein[J]., 2013, 117 (1): 639-647.

[8]DING C, XU Y, ZHAO Y, et al. Fabrication of BSA@AuNCs Based Nanostructures for Cell Fluoresce Imaging and Target Drug Delivery. 2017.

[9]ESCUDERO-FRANCOS M A, CEPAS V, P GONZáLEZ-MENéDEZ, et al. Cellular Uptake and Tissue Biodistribution of Functionalized Gold Nanoparticles and Nanoclusters[J]., 2017, 13 (2): 167-179.

[10]付嬈, 程欣. Ni2+離子修飾的金納米粒子對牛血紅蛋白的選擇性吸附[J]. 東北電力大學學報, 2016 (2): 57-60.

[11]WANG T, XIAO D. Rapid synthesis of fluorescent bovine serum albumin-gold nanoclusters complex for glutathione determination[J]., 2021, 188 (6).

[12]ZHANG Z, ZHU N, ZOU Y, et al. A novel, enzyme-linked immunosorbent assay based on the catalysis of AuNCs@BSA-induced signal amplification for the detection of dibutyl phthalate[J]., 2018, 179: 64.

[13]YANG Y, LIU T L, ZHANG Y Y, et al. Acute Toxicity of BSA-AuNCs after Single Intranasal Exposure in Mice[D]. Chinese Journal of Veterinary Medicine, 2018.

[14]YOO D, LEE D. Oligochitosan-stabilized photoluminescent gold nanoconstructs for optical bioimaging[J]., 2017, 21 (1): 20.

[15]尤其. 金納米簇/粒子的制備新方法及其在細菌檢測中的應用[D]. 東南大學, 2019.

Study on the Preparation and Properties of AuNCs@BSA/Antibiotics

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（College of Materials Science and Engineering, Qiqihar University, Qiqihar Heilongjiang 161006, China)

Bovine serum albumin encapsulated fluorescent gold nanoclusters (AuNCs@BSA) wwere prepared by microwave-assisted process. The optimum experimental conditions were investigated by fluorescence spectrum and transmission electron microscope. Through changing reaction temperature and reaction time,the changes of particle size and fluorescence intensity were tested to explore the best reaction conditions. Proteins can be used as protective agents for the synthesis of gold nanoclusters. These biomacromolecules themselves have excellent biocompatibility and can be combined with antibiotics to enhance the efficacy of some antibiotics, and have no significant impact on the fluorescence properties of AuNCs@BSA, and provide the possibility of drug fluorescence tracing.

AuNCs@BSA; Penicillin; Amoxicillin; Escherichia coli; Staphylococcus aureus

TQ050.4+1

A

1004-0935（2022）02-0190-04

2021-10-28

馬德彪（1997-），男，黑龍江省大慶市人，齊齊哈爾大學碩士研究生在讀，研究方向：熒光納米粒子的制備及性能研究。

張小舟（1974-），女，教授，研究方向：生物基聚碳酸酯及其復合材料的研究。