酸類香料在不同加香方式制備卷煙中的感官貢獻度研究

蔣薇，司曉喜，張鳳梅，劉志華，李明，唐石云，劉春波，朱瑞芝

1.云南中煙工業有限責任公司 技術中心/云南省煙草化學重點實驗室，云南 昆明 650231；2.紅塔煙草(集團)有限責任公司 玉溪卷煙廠，云南 玉溪 653100

0 引言

有機酸是一類重要的煙用香料，其作用主要體現在中和煙氣堿性成分，調節煙氣中質子化和游離態煙堿的比例，減輕煙氣刺激性，增加煙氣濃度，改善吸味，使煙氣口感醇和等方面[1-3]，有機酸種類和含量會直接影響卷煙的香氣和香味[4-5]。香氣和香味是人體的嗅感和味感通過接收外界刺激引起的感官體驗，目前主要通過香氣活性值(Odor Activity Value，OAV)和味覺活性值(Taste Activity Value，TAV)評價致香成分的感官貢獻度[6-9]，OAV/TAV是通過計算致香成分質量與其嗅覺/味覺閾值的比值得到。在OAV/TAV感官貢獻度評價方法基礎上，史清照等[10]將致香成分轉移率與嗅覺閾值的比值定義為香氣成分的加香貢獻度，其中轉移率代表致香成分被消費者感知到的量的大小，結合嗅覺閾值后可真實反映不同致香成分對卷煙煙氣的感官貢獻，然而該研究只考慮了致香成分對香氣的影響，并未考慮對香味的影響。

基于此，本研究擬在已有OAV、TAV和加香貢獻度評價致香成分感官貢獻度方法的基礎上，將致香成分的煙氣粒相轉移率與其嗅覺閾值/味覺閾值有效結合，定義其比值為嗅覺貢獻度和味覺貢獻度，考查在煙絲加香和爆珠加香兩種方式下，戊酸、辛酸、癸酸3種有機酸在不同圓周卷煙中的嗅覺貢獻度和味覺貢獻度，以期全面反映不同酸類香料的應用特點，為香料輔助篩選、卷煙加香方式優化，以及卷煙產品香料配方設計提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

主要材料：常規基準煙支、中支基準煙支、細支基準煙支(濾棒長度均為30 mm，煙支長度分別為84 mm，90 mm、97 mm，圓周分別為24 mm、20 mm、17 mm)；常規爆珠煙支、中支爆珠煙支、細支爆珠煙支(濾棒長度均為30 mm，煙支長度分別為84 mm，90 mm、97 mm，圓周分別為24 mm、20 mm、17 mm，爆珠粒徑分別為3.6 mm、3.0 mm、2.8 mm，距唇端距離均為15 mm)，爆珠中的酸類成分按廠家的生產實際使用比例進行添加，添加量以各種規格爆珠的經驗檢測值為準.所有煙支樣品(濾嘴通風率約為10%)均由云南中煙工業有限責任公司提供。

主要試劑：戊酸、辛酸、癸酸、反式-2-己烯酸，均為色譜純，德國Dr.Ehrenstorfer公司產；N,O-雙(三甲硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)，美國Sigma Aldrich 公司；二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、無水吡啶，均為色譜純，美國Merck公司產。

主要儀器：Agilent 7693A Autosampler、Agilent 5977B GC/MSD、Agilent8890 GC System，美國Agilent 公司產；KBF240恒溫恒濕箱，德國 BINDER 公司產；KQ-700超聲波清洗箱，昆山市超聲儀器有限公司產；BT 125 D電子天平(感量0.01 mg),德國賽多利斯科學儀器有限公司產；S0509/20744直線型吸煙機，美國斯茹林公司產；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海貝倫儀器設備有限公司產。

1.2 萃取溶劑優化與溶液配制

萃取溶劑優化：分別以二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺和無水吡啶為溶劑配制質量濃度為50 mg/L的戊酸、辛酸、癸酸混合標準溶液，分別準確移取500 μL上述3種混合標準溶液，加入20 μL BSTFA，密閉后于60 ℃水浴中反應60 min，進行GC-MS分析，以總峰面積和出峰個數比較溶劑的萃取效果，確定優選溶劑。

準確稱取50 mg反式-2-己烯酸置于50 mL容量瓶中，用優選溶劑溶解并定容，配制質量濃度為1000 mg/L的內標儲備液；用優選溶劑將內標儲備液稀釋為質量濃度為5 mg/L的內標工作溶液，即萃取溶液。

分別稱取酸類標準品各0.05 g置于不同的5 mL容量瓶中，用優選溶劑定容，配制成10 000 mg/L的標準單標儲備液；分別準確移取適量標準單標儲備液于50 mL容量瓶中，用優選溶劑定容，配制10 mg/L、200 mg/L的混標儲備溶液；分別準確移取適量200 mg/L混標儲備溶液和125 μL內標儲備液于25 mL容量瓶中配制5 mg/L、10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L的混標工作溶液，用優選溶劑定容；分別準確移取適量10 mg/L混標儲備溶液和125 μL內標儲備液于25 mL容量瓶中配制0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L、5.00 mg/L、10.00 mg/L、25.00 mg/L、50.00 mg/L的混標工作溶液，用優選溶劑定容；所有標準混合工作溶液即配即用。

1.3 樣品前處理

煙絲加香樣品制備：為防止煙絲加香成分揮發散失，將基準煙支樣品在(22±2)℃和相對濕度(60±2)%條件下平衡48 h，取出卷煙，常規煙、中支煙和細支煙按對應規格的添加量將爆珠油用微量注射器注入基準煙支煙絲中，注射完畢，迅速使用吸煙機在ISO 3308標準[11]條件下進行抽吸。

爆珠加香樣品制備：將卷煙樣品置于溫度(22±1)℃、相對濕度(60±2)%的恒溫恒濕箱中平衡48 h后進行抽吸，在抽吸之前激活爆珠。

爆珠樣品中的酸類成分提?。弘S機取1顆爆珠于頂空瓶中，用1 mL一次性注射器壓破爆珠，加入10 mL萃取溶液，使用注射器抽吸混勻后，超聲萃取30 min，萃取液過0.22 μm濾膜，待衍生化處理。

氣溶膠捕集：捕集5支卷煙煙氣至兩張劍橋濾片上，將劍橋濾片置于50 mL離心管中，加入15 mL萃取溶液，超聲萃取30 min，然后用0.22 μm的有機濾膜過濾，待衍生化處理。

1.4 衍生化處理及其條件優化

各類樣品衍生化前處理：準確移取500 μL樣品萃取液，加入適量BSTFA，密封處理后置于適宜溫度中反應60 min進行GC-MS分析。

衍生化溫度優化：準確移取500 μL的50 mg/L標準溶液置于進樣瓶中，加入20 μL BSTFA，分別在45 ℃、60 ℃、75 ℃、100 ℃和115 ℃溫度下進行衍生化處理后，進行GC-MS分析，以總峰面積和出峰個數比較溶劑的萃取效果，確定衍生化適宜溫度。

萃取液與衍生化試劑體積比例優化：以同一種卷煙煙絲為實驗對象，超聲萃取30 min后，取500 μL萃取液置于進樣瓶中，分別加入15 μL、20 μL、50 μL的衍生化試劑BSTFA，封口，適宜溫度水浴反應1 h，進行GC-MS分析，以總峰面積和出峰個數比較溶劑的萃取效果，確定萃取液與衍生化試劑適宜體積比。

1.5 GC-MS分析條件

GC分析條件：DB-5MS彈性石英毛細管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度280 ℃；載氣氦氣(≥99.999%)；恒流模式1 mL/min；進樣量1 μL；分流比5∶1。升溫程序為初始溫度50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min速率由50 ℃升至200 ℃，以20 ℃/min升至280 ℃，保持10 min。

MS分析條件：電離方式EI，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，電離能量70 eV，溶劑延遲3.5 min，掃描模式為全掃描和選擇離子模式(SIM)，全掃描質量掃描范圍30～500 amu，特征化合物的選擇離子參數見表1。

表1 特征化合物的選擇離子參數Table 1 Selective ion parameters of characteristic compounds

1.6 標準工作曲線的建立

標準系列工作溶液的GC-MS分析按照色譜條件進行，用內標法定量。根據酸類化學成分標樣的定量離子峰面積與內標峰面積的比值及標準工作溶液中目標物與內標物質量濃度的比值，使用Agilent MassHunter定量分析軟件處理實驗數據，并建立標準工作曲線。對每個物質的最低質量濃度標準溶液平行測定10次，計算測定值的標準偏差，以標準偏差的3倍作為方法檢出限，以標準偏差的10倍作為方法定量限；根據已知含量的樣品，分別按照低、中、高3個水平在劍橋濾片上加入標準溶液進行加標回收率的測定，每個水平平行測定5次，計算回收率及相對標準偏差(RSD)，以RSD結果評價方法重復性。

1.7 有機酸轉移行為評價方法

根據1.5中方法測試不同加香方式下3種有機酸向不同圓周卷煙樣品主流煙氣粒相物中的轉移量，按下式計算有機酸主流煙氣粒相轉移率T：

其中,M為加香樣品抽吸后粒相物中有機酸的含量/(μg·支-1)；M0為空白樣品抽吸后粒相物中有機酸的含量/(μg·支-1)；W為有機酸在卷煙中的添加量/(μg·支-1)。

本文實驗方法的萃取環境為酸性，文獻[12]中總煙堿的測定是通過加入氫氧化鈉調節pH值進行的，因此此處僅考慮煙氣中以有機酸形態存在的酸的轉移率，不考慮結合為煙堿鹽部分的酸的轉移。

1.8 有機酸嗅覺貢獻度和味覺貢獻度分析方法

3種有機酸的主流煙氣粒相轉移率主要以其含量為基礎反映香氣成分在卷煙加香中的利用率，并未綜合考慮其對感官效應的影響。與卷煙抽吸感受密切相關的是嗅覺和味覺，為了更加全面地表征不同香料在卷煙中的作用，筆者在主流煙氣粒相轉移率基礎上結合嗅覺閾值評價3種有機酸在不同加香方式下的嗅覺貢獻度。根據各酸類單體香料通過煙絲加香或爆珠加香后的主流煙氣粒相轉移率和嗅覺閾值[13]，計算該酸類香料的嗅覺貢獻度，計算公式如下：

味覺貢獻度是在主流煙氣粒相轉移率基礎上，結合味覺閾值提出的，可以更全面地反映香料引發的味覺感官效應。根據各酸類單體香料通過煙絲加香或爆珠加香后的主流煙氣粒相轉移率和味覺閾值[13]，計算該酸類香料的味覺貢獻度，計算公式如下：

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優化結果與分析

二氯甲烷、DMF和無水吡啶3種萃取溶劑優化結果如圖1所示。由圖1可知，對于辛酸和癸酸，二氯甲烷的萃取效果最好；對于戊酸，二氯甲烷萃取效果略低于無水吡啶。綜合考慮，選取二氯甲烷為萃取溶劑。

圖1 萃取溶劑優化結果Fig.1 Investigation results of extraction solvent

衍生化溫度的優化結果如圖2所示。由圖2可知，75 ℃時，戊酸和癸酸的出峰面積最大，但雜峰較多；60 ℃時，辛酸的出峰面積最大，戊酸和癸酸的出峰面積略低于75 ℃，但3種峰的峰形較好，雜峰干擾較少。因此選取60 ℃為衍生化溫度。

圖2 衍生化溫度優化結果Fig.2 Investigation results of derivatization temperature

萃取液與衍生化試劑體積比優化結果如圖3所示。由圖3可知，當萃取液與衍生化試劑的體積比為25∶1時，3種有機酸都能檢出，因此選取25∶1為萃取液與衍生化試劑體積比例。

圖3 萃取液與衍生化試劑體積比優化結果Fig.3 Investigation results of volume ratio of extraction solution to derivatization reagent

在優化的前處理條件下，選擇離子模式(SIM)下3種有機酸混合標準溶液的GC-MS譜圖如圖4所示，典型煙氣樣品的GC-MS譜圖如圖5所示。由圖4和圖5可知，該處理條件下，選取的特征離子選擇性好，抗干擾能力強，可實現3種有機酸的有效分離，適合復雜基質樣品的定性定量分析。3種有機酸的檢測方法評價結果如表2所示。由表2可知，3種有機酸相關系數R2均大于0.99，表明在其各自的線性范圍內線性關系良好，檢出限為0.018 2～0.032 3 mg/L，定量限為0.060 8～0.107 8 mg/L，重復性為0.87%～1.42%，回收率為80%～120%，在該優化條件下測定結果穩定可靠。

圖4 選擇離子模式(SIM)下3種有機酸混合標準溶液的GC-MS譜圖Fig.4 GC-MS chromatograms of three keyacids mixed standard solutions components under SIM mode

圖5 選擇離子模式(SIM)下典型煙氣樣品的GC-MS譜圖Fig.5 GC-MS chromatograms of typical cigarette smoke samples under SIM mode

表2 3種有機酸的檢測方法評價結果Table 2 Evaluation results of detection methods for three acids

2.2 有機酸在不同加香方式下的主流煙氣粒相轉移率

3種有機酸在不同加香方式下的主流煙氣粒相轉移率結果如圖6所示。由圖6并結合3種有機酸的物化參數(見表3)可得如下結果。1)爆珠加香方式下，隨著3種有機酸的相對分子質量減小，沸點降低，主流煙氣粒相轉移率升高；煙絲加香方式下，在細支煙中戊酸的主流煙氣粒相轉移率較高，其他規格卷煙中的戊酸、辛酸、癸酸的主流煙氣粒相轉移率皆隨相對分子質量增大、沸點升高而增高。2)對于揮發性有機酸(戊酸)，在3種圓周卷煙中爆珠加香的轉移率皆高于煙絲加香，兩種加香方式下主流煙氣粒相轉移率的大小順序均為細支煙>中支煙>常規煙；對于半揮發性有機酸(辛酸、癸酸)，在3種圓周卷煙中煙絲加香的轉移率皆高于爆珠加香，爆珠加香下兩種酸轉移率的大小順序是常規煙>中支煙>細支煙，煙絲加香下兩種酸主流煙氣粒相轉移率的大小順序是細支煙>中支煙>常規煙。根據上述結果可知，兩種加香方式下有機酸類香料的揮發性和卷煙煙支主流煙氣的流速都是影響主流煙氣粒相轉移率的重要因素。爆珠加香中，香料受熱溫度較低，沸點越低、相對分子質量越小的揮發性有機酸類香料,越有利于提高主流煙氣粒相轉移率；煙絲加香中，香料受熱溫度較高，沸點越高、相對分子質量越大的半揮發性有機酸類香料,越有利于提高主流煙氣粒相轉移率，這與蔡君蘭等[14]的研究結果一致。不同煙絲加香方式下，揮發性及半揮發性有機酸都是在細支煙中的主流煙氣粒相轉移率最高，可能是因為細支煙的圓周截面較小，抽吸時的煙氣流速較快，關鍵成分在濾嘴中駐留時間較短，濾嘴對其過濾效率較低[15-17]。爆珠加香方式下半揮發性有機酸的轉移率隨煙支圓周的增大而增大，這可能是因為隨著有機酸揮發性的降低，煙支流速成為影響主流煙氣粒相轉移率的關鍵因素。在常規煙支中，爆珠粒徑較大，捏破爆珠后濾棒中的空腔在3種規格的卷煙中也是最大的，主流煙氣在濾嘴中受到的阻力減小從而流速增快，煙氣溫度更高[18-19]，進而使轉移率增大。

圖6 3種有機酸在不同加香方式下的主流煙氣粒相轉移率Fig.6 Calculation results of transfer rate of three acids under different flavoring methods

2.3 3種有機酸在不同加香方式下的嗅覺貢獻度

3種有機酸在不同加香方式下的嗅覺貢獻度如圖7所示。由圖7可以看出：1)兩種加香方式下,3種有機酸類香料的嗅覺貢獻度排序嗅覺貢獻度高度一致；2)爆珠加香方式下，嗅覺貢獻度大小順序是辛酸>戊酸>癸酸，辛酸的轉移能力約為戊酸的0.2～0.6倍，但能帶來的嗅覺效果卻遠遠高于戊酸，其嗅覺貢獻度約為戊酸的13～42倍；3)煙絲加香方式下，嗅覺貢獻度大小順序是辛酸>戊酸>癸酸，辛酸的轉移能力約為戊酸的0.5～2倍，但其嗅覺貢獻度約為戊酸的32～115倍，帶來的嗅覺效果遠遠高于戊酸，此外辛酸的主流煙氣粒相轉移率與癸酸相近，但嗅香貢獻度卻存在200倍左右的差距。

圖7 3種有機酸在不同加香方式下的嗅覺貢獻度Fig.7 Calculation results of olfactory contribution of three acids under different flavoring methods

可見，兩種加香方式下，不同圓周的煙支中，辛酸的嗅覺貢獻度在3種有機酸中都是最佳的?！墩{香術》[20]中通過綜合分、香比強值、香品值和留香值評價香料的優劣，綜合分反映的是香料的香氣強度、留香效果和香氣品質的綜合評價值，分值越高，香料的綜合質量越好；香比強值反映的則是香料的香氣強度，強度越大，配方中需要使用的香料含量越少。從3種有機酸的感官信息(見表3)可以看出，辛酸和癸酸的綜合得分相同，但癸酸的香比強值較低，即癸酸需要較高的添加量和主流煙氣粒相轉移率才能達到與辛酸相同的加香效果。轉移行為研究中發現，爆珠加香時辛酸的主流煙氣粒相轉移率略高于癸酸，煙絲加香時辛酸的主流煙氣粒相轉移率略低于癸酸，但兩種加香方式下辛酸的嗅覺貢獻度都遠高于癸酸，可知辛酸在3種有機酸中的加香效果最佳，與文獻[20]中的評價結果一致。

表3 3種有機酸的物化參數及感官信息Table 3 Physicochemical parameters and sensory information of 3 acids

2.4 3種有機酸在不同加香方式下的味覺貢獻度

3種有機酸在不同加香方式下的味覺貢獻度如圖8所示。由圖8可以看出，爆珠加香方式下，主流煙氣粒相轉移率與味覺貢獻度排序相同，都是戊酸>辛酸>癸酸，戊酸的轉移能力約為辛酸的1.5～5倍、癸酸的4～20倍，但戊酸的味覺閾值較辛酸和癸酸小，綜合該因素計算后發現戊酸的味覺貢獻度為辛酸的300～960倍、癸酸的650～2800倍，感官效應增加明顯；煙絲加香方式下，主流煙氣粒相轉移率的排序是癸酸>辛酸>戊酸(除細支煙的戊酸較高外)，味覺貢獻度卻是戊酸>癸酸>辛酸，常規煙和中支煙中戊酸的主流煙氣粒相轉移率雖然最低，但卻能帶來較好的味覺效果。

圖8 3種有機酸在不同加香方式下的味覺貢獻度Fig.8 Calculation results of taste contribution of three acids under different flavoring methods

可見，不論何種加香方式、何種圓周的卷煙，戊酸的味覺貢獻都是相當明顯的，冒德壽等[21]通過味覺活力值分析鑒定出煙氣中的關鍵酸味物質為甲酸、乙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、乳酸和琥珀酸，冒德壽等[21]和本文中的研究結果都顯示,戊酸是煙氣酸味的主要來源。對比3種有機酸的嗅覺貢獻度與味覺貢獻度的比值發現，戊酸、辛酸和癸酸對煙氣的感官貢獻都主要以嗅覺效應為主，辛酸和癸酸的嗅覺效應尤為突出。范武等[22]對乙酸、丁酸、異戊酸和戊酸的嗅覺與味覺貢獻度進行比較發現，這些酸香成分的感官貢獻以嗅覺效應為主，這與本文中戊酸的主要感官效果一致。

3 結論

本文研究了在煙絲加香和爆珠加香兩種加香方式下，戊酸、辛酸、癸酸3種有機酸在不同圓周卷煙中的主流煙氣粒相轉移率，并結合嗅覺閾值、味覺閾值定義嗅覺貢獻度和味覺貢獻度,得到如下結論。1)在兩種不同加香方式和不同圓周的卷煙中，就主流煙氣粒相轉移率大小而言，揮發性有機酸(戊酸)更適合采用爆珠加香的添加方式，半揮發性有機酸(辛酸、癸酸)更適合采用煙絲加香的添加方式。2)在不同加香方式下，揮發性有機酸都是在細支煙的主流煙氣粒相轉移率最高，煙絲加香方式下半揮發性有機酸在細支煙的主流煙氣粒相轉移率最高，爆珠加香方式下半揮發性有機酸的主流煙氣粒相轉移率則隨煙支圓周的增大而增大。3)不同加香方式和不同圓周的卷煙中，辛酸的嗅覺貢獻度最佳，戊酸的味覺貢獻度最佳，3種有機酸的感官貢獻都是以嗅覺效應為主。本研究可為卷煙產品香料配方設計提供數據支撐。