犬脂肪干細胞分離、純化的研究進展

包喜軍 郭小望 李 剛 秦海斌 強京寧 賀星亮

脂肪干細胞(Adipose-derived stem cells, ADSCs)是存在于脂肪組織中的、具有多向分化潛能的間充質干細胞，由Zuk等在2001年從吸脂術抽出的脂肪中首次發現。脂肪干細胞具有來源豐富、取材方便、容易獲取、易于培養和免疫排斥低等優點，且具有分化為脂肪細胞、肌肉細胞、成骨細胞、神經細胞、心肌細胞和胰島細胞等多種細胞的潛能。因此，脂肪干細胞已成為近年來醫學領域乃至整個生命科學領域的研究熱點。

目前，關于人、鼠脂肪干細胞的研究報道較多，而對犬脂肪干細胞的研究相對較少。犬作為常見的伴侶動物和重要的實驗動物，開展犬脂肪干細胞的研究必將對于犬病臨床診療和人類疾病的動物試驗研究產生重要的影響。

一、脂肪組織的獲取

（一）取材部位

脂肪組織在全身的分布廣泛，但在采集脂肪組織進行脂肪干細胞的研究時，采集部位主要集中于腹部和腹股溝的皮下，也有研究者在臂部、臀部、乳房、內臟和大網膜等部位采集脂肪。在脂肪干細胞的產量方面：Schipper等認為人前臂脂肪組織中的干細胞含量最多；Faustini和Jurgens等則認為腹部脂肪干細胞產量高于其他部位；Fraser等認為側腹的脂肪干細胞產量高于腹部；Iyyanki和Oedayrajsingh-Varma等認為腹部、臀部、乳房、側腹和腋窩的脂肪干細胞產量無顯著差異。在脂肪干細胞的增殖能力方面：多項研究表明皮下脂肪來源的脂肪干細胞增殖能力強，也有研究顯示腹部皮下脂肪和其他部位脂肪的增殖能力無顯著差異。

（二）取材方法

脂肪組織的獲取方法有真空抽脂術、常規手術和微創手術等。吸脂術損傷較小，是目前獲取脂肪的主要方法；常規手術獲取脂肪損傷較大，但獲取的脂肪較多，更便于脂肪干細胞的分離培養；微創手術取脂肪也是吸脂術的一種，相關報道較少，該方法在采集脂肪時，選用穿刺的方式將脂肪提取出來。無論采用何種方式，在采集脂肪后，應盡快將脂肪組織冷藏并進行下一步實驗。在干細胞產量方面，Faustin和 Schreml等認為手術切除法和吸脂術提取的脂肪干細胞量相等；在成脂分化能力方面，Vallee等認為相較于其他方法吸脂術提取的脂肪干細胞具有更好的成脂分化能力；在不同提取物對干細胞生長活性影響方面，Sinno等認為注射器和真空泵吸脂，獲得脂肪干細胞的活性未見明顯差異。

（三）供體選擇

研究的熱點主要集中于供體的年齡、性別和健康狀況等。有研究認為，年輕供體的脂肪干細胞產量、增殖速度和分化能力優于年老供體；也有研究顯示，年齡因素并不影響脂肪干細胞的增殖、分化和衰老。Ogawa等認為雌性小鼠的成脂能力優于雄性，Aksu等認為男性的脂肪干細胞分化能力優于女性。有研究顯示，肥胖者的脂肪干細胞分化能力較低；糖尿病大鼠和健康大鼠的脂肪干細胞，在體外的增殖速度和生長曲線無明顯差異，而糖尿病大鼠的脂肪干細胞則會分泌更多的瘦素和脂連蛋白。

二、脂肪干細胞的分離

（一）組織塊貼壁法

在無菌采集脂肪組織后，將脂肪組織轉運至實驗室，先用生理鹽水沖洗，再通過雙抗PBS沖洗、基礎培養基沖洗等步驟后，將脂肪組織剪成適宜大小的組織塊，然后貼放到培養皿中進行培養，為了使組織塊貼壁更緊湊、不漂浮于培養液中，也可將組織塊貼放到細胞培養皿中，于二氧化碳培養箱中培養30min，然后再滴加細胞培養液，于37℃、5%CO2飽和濕度下培養16h后補加培養液，繼續培養，24h后換液，之后隔天換液，于倒置相差顯微鏡下，每天觀察細胞生長形態和特征。

（二）酶消化法

酶消化法是目前主要的脂肪干細胞的分離方法，其原理是將已剪成碎塊的脂肪組織，通過消化酶消化，以去除細胞間質，再經過濾、洗滌和離心等步驟去除其他細胞，從而最終獲得脂肪干細胞。在選用酶的類型方面，Ⅰ型膠原酶最為常見，也有研究選用Ⅱ型、IV型、Ⅷ型膠原酶或者胰酶，以及膠原酶與胰酶聯合應用；在酶的使用濃度方面，0.75g·L-1至2.5g·L-1不等；酶的消化時間從0.5h至3h不等。酶消化法是一種費時、昂貴的方法，且在使用酶的類型、濃度、消化時間等方面缺乏統一的標準。由于上述各種因素的影響，分離的脂肪干細胞表型、增殖和分化能力有一定差異。

（三）其他方法

1.其他人工分離方法：將吸脂術的液體通過特制材料制作的吸附柱，以此來獲取脂肪干細胞的方法，該方法僅適用于抽脂術的液體成分，而且需要大量的樣品，且細胞提取率不高。此外，還有直接離心法、機械振蕩法和胎牛血清法等。這些方法的優點是不使用膠原酶，避免了異種污染，但組織消化時間長、干細胞產量低，但也有研究認為直接離心法和機械振蕩法獲取的脂肪干細胞其活動更高、生長速度更快；胎牛血清法是一種利用體積分數為100%的胎牛血清，替代膠原酶和胰蛋白酶來消化脂肪組織的方法。

2.自動分離方法：除了人工分離方法外，目前市場上還有幾種商業化的脂肪干細胞自動分離系統，例如Cytori公司的Celution System，Tissue Genesis公 司 的Icellator X System等。Celution System是通過一次性無菌耗材自動化和標準化分離和富集脂肪干細胞，該系統使得實時獲取自體、臨床級的脂肪干細胞流程變得更加簡易，并可在同一個外科手術過程中實現床旁細胞治療。Icellator X System是一款高性能的醫療點設備，可以在完全封閉的自動化過程中，無須人工干預，在不超過一小時的時間里，從自體脂肪組織小型樣本中有效提取足以用于靜脈輸液的成年人干細胞。

三、脂肪干細胞的純化

（一）細胞傳代培養純化法

根據脂肪干細胞貼壁生長的特性，可以將脂肪干細胞與大部分的細胞進行分離，但是，在基質血管成分中成纖維細胞也能貼壁，且貼壁后的細胞形態也為梭形，因此無法通過形態區分脂肪干細胞，但是有研究認為原代培養48h后，所有貼壁的活細胞均為脂肪干細胞。該方法的主要步驟為：將分離獲得的脂肪干細胞在37℃、5%CO2及飽和濕度培養條件下，培養24h，更換培養液去除未貼壁細胞，在細胞融合達70%～80%時棄培養液，PBS漂 洗2次，每 次10min，棄PBS，使用0.25g·L-1胰蛋白酶消化貼壁細胞2次，每次10～20s，培養液沖洗并獲得原代細胞，按上述方法依次進行傳代培養。

（二）流式細胞術純化法

流式細胞術是一種比較成熟的干細胞純化、鑒定的方法，其主要步驟如下：

1.脂肪干細胞的準備：將胰酶消化或未消化的脂肪干細胞移入流式管內，800-1000r/min離心4～5min，取細胞沉淀，重復洗滌 2次，PBS重懸，將細胞濃度調整為（2.0～6.0）×106ml-1待用。

2.干細胞與抗體的孵育：將準備好的細胞樣品加入已加入抗體（CD34、CD44、CD45、CD105等）試劑的流式管內，每管100μL，充分混勻，置4℃冰箱避光孵育30min，孵育完成后每管加入PBS1ml，充分混勻，1000r/min離心5min，取細胞沉淀，重復洗滌1次，最終加入200μL重懸。

3.應用流式細胞儀檢測：文依信等使用流式細胞儀對犬的P3代脂肪干細胞進行了檢測，間充質干細胞表面標記蛋白CD29高表達（＞90%），而幾乎不表達造血細胞標記蛋白CD34和CD45（＜2%）。由于選擇表面標記蛋白和實驗方法的不同，細胞表面高表達的標記蛋白有CD44、CD90和CD105等；完全不表達的標記蛋白有CD31和CD45等；而造血干細胞標記蛋白CD34也有低表達或不表達的報道。此外，李珂雅等在用流式細胞儀對不同物種的脂肪干細胞表面標記物研究時發現，不同物種的脂肪干細胞表面標記物類似，這為脂肪干細胞的臨床前研究提供了良好的模型。

（三）免疫磁珠分選法

該方法與流式細胞術純化方法相似，不同點在于流式細胞分選是電荷式分選，而免疫磁珠分選是使用磁珠偶聯的特異性單抗去標記細胞表面抗原，當已標記好的單細胞懸液通過特定的外加磁場分選柱時，僅有與磁珠相結合的細胞才被吸附滯留在分選柱內，從而使細胞得以分離。免疫磁珠分選法將細胞生物學、磁力學和免疫學等知識融于一體，具有高度特異性分選細胞的特點。

（四）密度梯度離心法

密度梯度離心法是基于不同顆粒沉降系數的差異，在一定離心力作用下，不同顆粒以不同速度沉降，在密度梯度不同區域上形成區帶，從而使不同密度的細胞得以分離。目前常用的離心介質有聚蔗糖（Ficoll）和經過聚乙烯吡咯烷酮處理的硅膠顆?；鞈乙海≒ercoll）。有研究顯示，Ficoll更適用于制備人骨髓間充質干細胞，而Percoll在分離純化馬骨髓間充質干細胞時的細胞產量及自我更新潛能方面效果更佳。也有研究顯示不同密度的Ficoll，其分離純化的骨髓間充質干細胞在細胞的活性、產量、表型等方面差異顯著。因此，實施密度梯度離心法的關鍵在于介質及其密度的選擇。有研究通過該方法對負壓抽脂采集的豬皮下脂肪進行了干細胞分離，最終成功獲取了脂肪干細胞。

四、脂肪干細胞的應用前景

脂肪干細胞在組織損傷的修復、炎癥、自身免疫系統病、神經退行性疾病等多種疾病的治療中取得了較好的療效，這使得對該細胞的研究不斷深入。犬作為最常見的伴侶動物和新型實驗動物，隨著與人類工作和生活關系的逐漸密切，犬脂肪干細胞對多種疾病的療效，逐漸成為獸醫和人類臨床前動物試驗工作者關注的焦點，如骨關節炎、髖關節發育不良、關節軟骨損傷、心肌梗死、糖尿病、肝功能衰竭、腎功能衰竭和肺心病等，對人類疾病的診療也具有重要的參考價值。另外，有研究表明，犬脂肪干細胞具有腫瘤趨向性，因此可作為抗腫瘤分子的細胞載體，對于腫瘤疾病的治療也具有重要意義。