2019新型冠狀病毒核酸檢測體系性能驗證

吳 劍 龔純全 傅后榜 龔 虹 張恒超 支林俊 徐 媛 劉 宇

福建省邵武市立醫院檢驗科,福建省邵武市 354000

自2019年12月以來，2019-nCoV所造成的疫情已對全球公共衛生安全造成了巨大的威脅，給全世界的政治、經濟帶來了巨大壓力。在2019-nCoV所導致的冠狀病毒病(COVID-19)疫情阻擊戰中，新冠病毒核酸檢測成了疫情排查的重要手段。在國家衛健委發布的多版新冠病毒肺炎診療指南中均將實時熒光RT-PCR 檢測新型冠狀病毒核酸陽性作為診斷COVID-19的“金標準”[1]。依據國務院應對新型冠狀病毒肺炎疫情聯防聯控機制醫療救治組發布的《醫療機構新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊(試行第二版)》中“實驗室質量控制與管理”對性能驗證的要求[2]，為評估本實驗室的新冠核酸檢測體系是否能在質量上滿足臨床的需要，參照CNAS-GL02《醫學實驗室質量和能力認可準則》(ISO15189：2007)對醫學實驗室檢測系統性能評價的相關要求，結合CNAS-GL039《分子診斷檢驗程序驗證指南》對本實驗室采用的新冠核酸檢測體系進行性能驗證實驗。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 陽性樣本：2019-nCoV核酸檢測試劑盒內陽性對照品(四川邁克生物股份有限公司，批號：0121101，-20℃保存)；第三方新型冠狀病毒核酸檢測弱陽性質控品(北京康徹斯坦生物科技有限公司，批號：202012008，濃度：1 000copies/ml，-20℃保存]；新型冠狀病毒核糖核酸基因組標準物質[中國計量科學研究院，編號：GBW(E)091098，批次編號：2001，定值日期：2020年2月27日，-70℃保存]。陰性樣本：健康人陰性標本。所有樣本均一次凍融。

1.2 試劑與儀器 采樣管(滅活型，康康醫療器械，規格DVSI-3.0-1，批號：210124)，內含RNA保存液。核酸提取試劑盒(重慶中元匯吉生物技術有限公司，批號：5101143)，2019-nCoV核酸檢測試劑盒(四川邁克生物股份有限公司，批號：0121101)，全自動核酸提取儀(山東博科BK-HS32)，實時熒光定量PCR分析儀(羅氏LightCycler480II)。

1.3 方法

1.3.1 檢驗原理。磁珠法提取出新冠病毒核酸后，利用針對2019-nCoV(ORF1ab/E/N基因)設計的特異性引物和熒光探針，應用實時熒光定量PCR技術，通過監測熒光信號的變化實現對新冠病毒核酸的定性檢測。

1.3.2 反應體系。qRT-PCR反應液17μl與qRT-PCR酶混合液3μl共同組成qRT-PCR混合液，加入已提取出的待測核酸或處理好的質控品20μl，形成終體積為40μl的樣本，以含有內參檢測基因的RNA假病毒為內對照，FAM通道采集ORF1ab基因熒光信號，ROX通道采集E基因熒光信號，CY5通道采集N基因熒光信號，VIC通道采集內對照熒光信號。結果判斷：根據試劑說明書中所說明的擴增曲線及循環閾值(Ct值)進行判讀。

1.3.3 陰陽性符合率驗證。陽性符合率：20例添加新型冠狀病毒核糖核酸基因組標準物質的臨床樣本作為真實臨床陽性樣本的替代，其中10例配制為接近1.5倍最低檢測限濃度水平(750copies/ml，編號P1～P10)，另10例配制為接近4倍最低檢測限濃度水平(2 000copies/ml，編號P11～P20)；陰性符合率：20例陰性樣本為健康人陰性樣本。根據檢測結果與臨床判斷是否一致，計算陽性、陰性符合率，若≥95%，則該檢測體系的陰陽性符合率能達到要求。

1.3.4 精密度驗證。批內精密度：同一天內分別同時分析試劑盒內陽性對照與第三方弱陽性質控品，每個樣本重復檢測20次，收集實驗數據進行統計分析，以變異系數(CV)≤5%為合格標準；批間精密度：每天分析試劑盒內陽性對照與第三方弱陽性質控品，每個樣本重復檢測4次，連續測定5d，收集實驗數據進行統計分析，以變異系數(CV)≤5%為合格標準。

1.3.5 最低檢測限驗證。將新型冠狀病毒核糖核酸基因組標準物質用采樣管內RNA保存液稀釋至2019-nCoV核酸檢測試劑盒廠家聲明的最低檢測限濃度(500copies/ml)，每個基因使用檢測體系重復提取、擴增10次，≥95%樣本檢測呈陽性，則最低檢測限驗證通過。

1.3.6 交叉反應驗證?？紤]核酸序列具有同源性，將易引起相同或相似臨床癥狀的其他病原體及人基因組DNA，包括：人冠狀病毒 HCoV-229E(1.0×104～1.0×105copies/ml)、人冠狀病毒 HCoV-OC43(1.0×104～1.0×105copies/ml)、人冠狀病毒 HCoV-HKU1(1.0×104～1.0×105copies/ml)、人冠狀病毒 HCoV-NL63(1.0×104～1.0×105copies/ml)、人冠狀病毒 MERS-Cov(1.0×104～1.0×105copies/ml)、EB病毒(1.0×104～1.0×105copies/ml)、甲型流感病毒(5.4×106copies/ml)、乙型流感病毒(2.5×106copies/ml)、人副流感病毒Ⅰ型(2.4×106copies/ml)、人巨細胞病毒(1.8×103IU/ml)、肺炎支原體(1.0×106～1.0×107copies/ml)、腺病毒Ⅰ型(1.0×104～1.0×105copies/ml)、人基因組DNA定量標準物質(3.59×104copies/μl)，對以上樣本利用本核酸檢測體系提取、擴增，進行交叉反應驗證，結果如為陰性，表明本檢測體系與上述樣本無交叉反應。

2 結果

2.1 陰陽性符合率 陽性樣本的ORF1ab基因、N基因與E基因的Ct值均<37，判斷為陽性結果，陽性符合率100%(見圖1)；陰性樣本未出擴增曲線及Ct值，陰性符合率100%。

圖1 陽性樣本ORF1ab基因、N基因與E基因的Ct值

2.2 精密度 陽性對照與弱陽性質控品ORF1ab基因、N基因與E基因的批內精密度(見表1)CV≤5%，批間精密度(見表2)CV≤5%，該檢測體系精密度符合要求。

表1 弱陽性質控品與陽性對照ORF1ab基因、N基因與E基因批內精密度

表2 弱陽性質控品與陽性對照ORF1ab基因、N基因與E基因批間精密度

2.3 最低檢測限 新型冠狀病毒核糖核酸基因組標準物質稀釋至2019-nCoV核酸檢測試劑盒廠家聲明的最低檢測限濃度(500copies/ml)的每個基因重復提取、擴增10次，每次均出現了擴增曲線，Ct值均<37，判斷為陽性，檢出率100%，廠家申明的最低檢出限得到驗證(見表3、圖2～4)。

圖2 標準物質稀釋至500copies/ml，ORF1ab基因擴增曲線

表3 標準物質稀釋至500copies/ml，ORF1ab基因、N基因與E基因擴增結果

2.4 交叉反應 對人類冠狀病毒(HKU1、OC43、NL63和229E)、MERS冠狀病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人副流感病毒Ⅰ型、腺病毒Ⅰ型、EB病毒、人巨細胞病毒、肺炎支原體及人基因組DNA進行檢測，結果均為陰性，本檢測體系對上述樣本無交叉反應，特異性好(見表4)。

表4 交叉反應驗證結果

3 討論

2019-nCoV屬于冠狀病毒科，β冠狀病毒屬，直徑為60～140nm[3]的單股正鏈RNA病毒。2019-nCoV經呼吸道飛沫、接觸或氣溶膠[4]等傳播途徑入侵機體后與細胞表面ACE2受體結合而進入宿主細胞，復制增殖，從而導致以發熱、咳嗽、呼吸困難與乏力為主要表現的臨床癥狀[5-8]，約20%的患者會進展為多器官功能障礙[7，9-10]。

核酸檢測作為COVID-19疫情排查的工作重點之一，質量保證尤為重要。有研究表明[11]不同的新冠核酸檢測試劑對樣本的檢測能力存在差異。新冠核酸檢測所包含的試劑儀器有采樣管、核酸提取試劑、核酸擴增試劑及相應的儀器，其中任何一個環節出現問題，均會影響新冠核酸檢測的結果。采樣管中的病毒保存液分為滅活型與非滅活型，滅活型主要是在病毒保存液中添加胍鹽，有研究標明[12]胍鹽滅活導致的假陰性更少，但另有研究表明，胍鹽的濃度是否合適，對提取效果的影響非常大[13]。核酸提取在新冠核酸檢測中的作用不可輕視，是檢測結果精密度的重要保證[14]。用于新冠核酸提取的方法主要有磁珠分離法、離心柱法與一步法，目前實驗室最常用的核酸提取方法是磁珠分離法，但據中國海洋大學的研究人員研究表明:不同的磁珠對標本的親和性不同[15]，因此，不同的提取試劑根據其標本、磁珠、試劑用量及洗滌次數的不同，提取效能是有差異的。目前各醫療機構新冠核酸擴增主要運用反轉錄PCR擴增(RT-PCR)與等溫擴增兩種技術，兩種方法各具優勢：RT-PCR技術成熟度最高，應用最為廣泛，而等溫擴增不需要反復升降溫就可實現核酸的擴增，可以達到快速檢測的目的。綜上所述，在核酸采樣、提取與檢測過程中的每一步，都會影響到檢測質量，因此，選擇配套儀器試劑時，性能驗證是非常重要的一環。

圖3 標準物質稀釋至500copies/ml，N基因擴增曲線

圖4 標準物質稀釋至500copies/ml，E基因擴增曲線

經本次性能驗證發現，本實驗室采用的康康醫療器械生產的采樣管、重慶中元匯吉生物技術有限公司生產的核酸提取試劑(磁珠法)，四川邁克生物股份有限公司生產的2019-nCoV核酸檢測試劑盒與山東博科生產的全自動核酸提取儀(BK-HS32)及羅氏公司的實時熒光定量PCR分析儀(LightCycler480II)在2019-nCoV核酸檢測配套使用時，陰陽性符合率一致，重復性好，最低檢測限與廠家聲明一致，與能引起相同或相似臨床癥狀的其他病原體及人基因組DNA不產生交叉反應，特異性好，能夠在質量上保證臨床新冠核酸檢測的需要，可為其他實驗室選擇檢測體系配套方案提供參考依據。但本研究僅對檢測體系的一個批號進行驗證，并且本實驗室自開展新冠核酸檢測以來并未發現陽性病例，未采用真實陽性臨床樣本進行性能驗證，故后續還應對不同批號做性能測試，且與多家實驗室進行結果比對。