利用生防菌防治棉花黃萎病效果的制約因素

劉海洋，王 偉，張仁福，溫切木·阿布列孜，姚 舉

(1.新疆農業科學院植物保護研究所/農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091； 2. 阿勒泰市菜籃子工程辦公室, 新疆阿勒泰 836500)

0 引 言

【研究意義】2019年新疆棉花種植面積占全國76.1%，產量占全國84.9%，棉花黃萎病發生也日漸嚴重[1,2]。生產上缺乏抗病種質資源且抗性易丟失[3]，利用環境友好的生物技術對棉花黃萎病進行防治優勢凸顯?！厩叭搜芯窟M展】土壤中的大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)的微菌核是棉花黃萎病的主要侵染源，微菌核數量與黃萎病的發生程度顯著正相關[4]，微菌核抗逆性強[5]，降低土壤中的微菌核數量是防控棉花黃萎病的前提。LóPezescudero等[6]利用Diplotaxisvirgata,Lavandulastoechas和Thymusmastichina制成的有機改良劑顯著降低了大麗輪枝菌產微菌核的能力，降低了該病的發生程度。吳藹民等[7]利用內生菌拮抗菌73 a對棉苗蘸根處理后移栽入人工病田，后期調查發現內生菌73 a對棉花黃萎病具有良好的防治效果且還有一定的促進作用；林玲等[8]同樣發現，生防內生細菌Jaascd的發酵液在棉苗移栽前噴施和灌根都能有效防治棉花黃萎病。石磊等[9]利用滴灌設施滴施枯草芽孢桿菌可濕性粉劑、哈茨木霉菌劑、中農綠康等生物藥劑對棉花黃萎病進行了防治，發現3種生物藥劑均對黃萎病發病具有明顯的防治效果?！颈狙芯壳腥朦c】新疆南疆生產上利用不同生防菌劑防治棉花黃萎病時發現存在防效不穩定、效果不佳的問題。由于生防菌與土壤中土著微生物存在競爭，生防菌與作物根部的親和能力以及其它非生物因子同樣是限制生防菌劑防治能力的重要原因[10]。生防菌(菌劑)的施用方式、施用時間等也是影響生防菌防治效果的重要因素?！緮M解決的關鍵問題】以庫爾勒棉田利用生防菌防治棉花黃萎病為例，從土壤中病原菌數量、滴施時間、生防菌定植、抑菌能力等方面分析生防菌防治棉花黃萎病過程中的主要制約因素，為棉花黃萎病的生物防治提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試品種

感病品種：軍棉1號、新陸中36號；耐病品種：中棉所49、中植棉2號，均由新疆農業科學院植物保護研究所提供。

1.1.2 供試菌株

生防菌株AL7是新疆棉田土壤中分離的一株具有廣譜抑菌活性的甲基營養型芽孢桿菌，攜帶有四環素(tetracycline，Tet)抗性基因和gfp基因[11]。

1.1.3 供試土壤

2017年6月中旬，在農業部庫爾勒作物有害生物科學觀測實驗站棉花黃萎病病圃(E85.801821、E41.750644)采集軍棉1號健康株與黃萎病株根圍0～10、10～20和20～40 cm土層的土壤，各取3個重復，帶回實驗室4℃保存，備用。

1.2 方 法

1.2.1 棉花黃萎病發生程度以及滴灌時期調查

于6月15日起按全國統一病情分級標準調查庫爾勒病圃內4個棉花品種的黃萎病發生情況。病情指數=∑(各級病株數×發病級別)/(調查總株數×4)×100。

記錄棉田滴灌一水時間，于灌水1 d后測量水分滲透深度。

1.2.2 不同深度土層微菌核數量檢測

配制選擇性培養基[12]，稱取3 g土壤樣品用研缽研細，3份，分別放入盛有200 mL水的三角瓶中，加入少量玻璃珠，靜置10 min，在200 r/min的搖床上搖30 min。然后倒入上層150 μm下層38 μm的雙層細篩，在自來水下將泥土沖洗干凈。留在下層篩網上的土壤殘留物全部轉移到50 mL三角瓶中，用無菌水定容到30 mL。將定容好的土樣液每次均勻吸取2 mL于改良微菌核選擇分離培養基表面均勻涂布，接種5皿，在超凈工作臺上吹干， 28℃下黑暗培養10 d檢查。每5皿的檢驗結果數目之和就是所測1 g土樣中所含棉花黃萎病菌微菌核的數量，3次重復。

1.2.3 生防菌AL7在土壤中的定植檢測

將含有四環素抗性基因的生防菌AL7在含10 mg/L四環素的固體LB培養基上劃線活化。待長出單菌落后，挑取單菌落接種于含有5 mL LB液體培養基的試管中，于搖床中37℃、200 r/min振蕩搖培8 h。取30 μL此菌懸液接種到300 mL含有10 μg/mL四環素的LB液體培養基中，37℃，200 r/min搖床搖培3 d，離心收集菌體，用無菌水清洗菌體3次，最后用無菌水稀釋到l×108cfu/mL的接種濃度，重復制備10份。在病圃內棉苗2葉期時棉花根圍進行灌根，單株棉花根圍灌根菌懸液量與滴灌水量盡量相同。分別于接種后5、20、40、60 d取棉花根圍0～20 cm、20～40 cm耕層土樣。利用選擇平板稀釋法回收土壤中菌株AL7[12]。

1.2.4 土壤浸提液對生防菌AL7生長量的影響

取棉花根圍土壤250 g加入無菌水250 mL(室溫振蕩5 h靜置24 h后取上層清液，3層濾紙過濾，再經0.45 μm 濾膜過濾，得1∶1原液，繼而配制成1∶2、1∶4的土壤浸提液，置于4℃冰箱保存。將生防菌株AL7在LB培養基上活化，轉入裝有5 mL(液體LB培養液的試管中，30℃下180 r/min搖培4 h后，取1 mL(菌懸液分別接入配制好的1∶1、1∶2、1∶4的土壤浸提液，30℃，180 rpm/min搖培，每1 h利用分光光度計測菌懸液的OD600值，10 h后停止測量，根據OD600值畫出菌株的生長曲線，評價土壤浸提液對生防菌AL7生長的影響。

1.2.5 生防菌對微菌核的抑制能力

將生防菌株AL7在固體LB培養基上劃線活化，挑取單菌落接種于含有250 mL LB液體培養基的三角瓶中，于搖床中37℃、120 r/min振蕩搖培2 d，制成AL7菌懸液；市場上購買某品牌生物菌劑制成推薦濃度懸液。將保存的病圃土壤放置于φ10 cm、深度10 cm的盆缽中，將上述制備好的生防菌AL7、生物菌劑懸液灌入盆缽中，使之全部浸透，10 d后均勻取盆缽中土壤，檢測微菌核數量，并制備懸液灌第2次，10 d后再次均勻取盆缽中土壤，檢測微菌核數量。設清水對照，3次重復。

校正抑制率(%)=[1-(處理后微菌核數量×對照前微菌核數量)/(處理前微菌核數量×對照后微菌核數量)]×100。

1.3 數據處理

利用Excel軟件對數據進行整理、匯總并作圖。

2 結果與分析

2.1 棉花黃萎病發生動態與滴灌

研究表明,6月初庫爾勒棉田黃萎病已開始顯癥，6月15日黃萎病病圃內軍棉1號的病情指數為8.67，至7月15日病情指數迅速升至63.92。同期相比，6月15日中棉49號的病情指數為0.71，至7月15日病情指數僅為0.58。中棉49號對黃萎病表現出極強的耐受性。圖1

庫爾勒棉區滴灌頭水日期為6月中旬，病圃滴灌一水時期為6月19日，田間棉花黃萎病已顯癥。頭水的滲透深度為32.0 cm，軍棉1號的主根系平均長度為38.5 cm，平均株高為19.6 cm，發病棉株的維管束變色高度平均為15.5 cm。棉田滴一水時，黃萎病菌已經由主根系或側根系完成侵染并沿維管束向上蔓延，并使棉花顯現病癥。滴施生物菌劑時期嚴重遲于黃萎病菌的侵染時間。且灌水的滲透深度與棉花根系長度相差6.5 cm，并不能完全將生防菌劑等輸送至棉花根尖等易受黃萎病菌侵染的組織部位。

圖1 不同棉花品種黃萎病發生動態Fig.1 Occurrence dynamics of Verticillium wilt in different cotton varieties

2.2 棉田不同深度土層中大麗輪枝菌微菌核數量

研究表明，健康與發病棉株根圍土壤中棉花黃萎病菌微菌核的含量及垂直分布存在顯著差異。健康棉株根圍土中的微菌核總量為232個/g土，主要集中在0～10 cm土層中，該土層微菌核數量為224個/g土，占全部微菌核數量的96.6%；發病棉株根圍土中微菌核總量為721個/g土，其中0～10 cm土層中微菌核含量為310個/g土，占總量的43.0%；10～20 cm土層中微菌核數量為366個/g土，占總量的50.8%；20-40 cm土層中微菌核數量為45個/g土，占總量的6.2%。圖2，圖3

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05), 誤差線表示平均值的標準誤差(n=4)

圖3 土壤中分離出的大麗輪枝菌微菌核在選擇性培養基上的生長狀態Fig.3 Growth status of microsclerotia isolated from soil on selective medium

2.3 生防菌AL7在土壤中的定植

研究表明，接種5 d時，生防菌AL7在0～20 cm的土層中的定植數量為4.5×106個/g土，在20～40 cm的土層中AL7的定植數量為2.8×105個/g土；接種20 d時，AL7在土壤中的定植量開始降低，在0～20 cm的土層中定植數量為3.3×106個/g土，在20～40 cm土層中的定植數量為1.3×105個/g土；至40～60 d時，AL7在0～20 cm的土層中的定植量明顯降低至約1×106個/g土，在20～40 cm土層中的定植數量約0.5×105個/g土。生防菌AL7未在土壤中自然增殖，其定植數量隨著時間延長開始下降，20 d后下降較為明顯，主要定植在0～20 cm的土層中。圖4

圖4 生防菌AL7在不同深度土層土壤中的定植(1×105)Fig.4 The colonization of bio-control bacteria AL7 in soil at different depths

2.4 土壤浸提液對生防菌AL7生長的影響

研究表明，經過10 h的培養，生防菌AL7在純土壤浸提液處理中的OD600值始終最高，顯著高于其它處理。而生防菌AL7在1/2和1/4土壤浸提液2個處理中0～7 h的OD600值與清水對照處理沒有顯著差異；在8～10 h階段，生防菌AL7在1/2和1/4浸提液2個處理中的OD600值均超過了清水對照，且生防菌AL7在1/2浸提液處理的OD600值高于1/4浸提液處理。棉田土壤浸提液對生防菌的生長無抑制作用。圖5

圖5 土壤浸提液對生防菌生長量的影響Fig.5 The effect of soil extract on the growth of bio-control bacteria

2.5 生防菌AL7與生物菌劑對大麗輪枝菌微菌核的抑制作用

研究有明，生防菌AL7發酵原液首次施用10 d后，土壤中微菌核數量由253個/g土降至44個/g土；生物菌劑處理土壤中微菌核數量由264個/g土下降至181個/g土；而對照土壤中微菌核數量由393個/g土下降至205個/g土，經計算生防菌AL7發酵液的校正抑制率為66.7%，其200 X液的抑制率僅為5.0%；而生物菌劑處理的校正防效為負值，沒有抑制效果。

第2次施用10 d后，生防菌AL7發酵原液處理土壤中微菌核數量下降至10個/g土，校正防效為70.5%，200 X液的校正抑制率僅為5.5%；而生物菌劑處理每克土壤中微菌核數量由上升至224個/g土，沒有抑制效果，相反還促進微菌核數量增加了43個/g土。表1

表1 生防菌(生物菌劑)對大麗輪枝菌微菌核的抑制作用(個/g土)Table 1 Inhibitory effect of bio-control bacteria(agent)on the microsclerotia of Verticillium dahliae (per/g soil)

3 討 論

3.1棉花黃萎病作為嚴重威脅新疆棉花生產的土傳病害，難以防治，利用生物防治技術進行防控是一項重要措施[7-9]。諸如在營養缽育苗土和大盆缽移栽土中施用微生物有機肥對棉花黃萎病的防治率可達80%以上[13]；田間利用西蘭花殘體對黃萎病的防治效果達43.06%[14]，能夠降低微菌核的數量[15]；多種生防菌制成有機改良劑能顯著降低棉花黃萎病菌產生微菌核的能力，降低了棉花黃萎病的發病程度[6]，田間拌種和隨水滴施枯草芽孢桿菌S37和S44對棉花黃萎病的防治效果可達30%～50%[16]；利用滴灌隨水滴施枯草芽孢桿菌可濕性粉劑、哈茨木霉菌劑、中農綠康等生物藥劑對棉花黃萎病的防治效果可達33.5%～70%以上[9]。

3.2在庫爾勒棉區影響生防菌(菌劑)防治棉花黃萎病效果的首要因素是防治時期錯位。由于庫爾勒棉區沒有實行北疆的干播濕出的栽培模式，滴施生防菌(菌劑)的時間延遲至6月中旬(頭水)，此時與石磊等[9]相比推遲了50 d，沒有在第一時間占據棉花根圍生態位；而6月中旬棉花黃萎病已開始顯癥，防治時期的嚴重錯位對于維管束系統侵染病害依然無效。

3.3生防菌在土壤中的定植、增殖能力決定其生防效果。研究中土壤浸提液并未抑制生防菌的生長，但是生防菌在棉田中的自然增殖能力較差，主要定植在0～20 cm土層中，在20～40 cm土層中的定植量較低，所以對20～40 cm土層中的黃萎病菌微菌核的抑制效果便會打折扣。

3.4庫爾勒試驗病田土壤中黃萎病菌微菌核含量高，發病棉株根圍0～40 cm土層中微菌核平均含量約為240個/g土，核算總量約為3.1×107個，在如此大的病原菌基數下，棉花根系承受巨大的侵染壓力。

3.5微菌核抗逆性強[5]，生防細菌(菌劑)對其僅有抑制生長作用而無殺死能力，生防細菌AL7的200 X發酵液對微菌核的抑制率非常低，僅為5.5%，尤為甚者生物菌劑對微菌核沒有抑制效果，反而促進了其數量的增長，與Marzano等[17]、Olanya等[18]、Eo等[19]研究結果接近。

土傳病原菌通常是從宿主根部的傷口或在初生根和次生根的交界處開始入侵，而生防菌對生態位點的提前占領能有效防止病原菌侵染植物根系[20]。

4 結 論

4.1庫爾勒棉區隨水滴施生物菌劑時間為6月中旬，較出苗期推遲約60 d，大大遲于棉花黃萎病菌的侵染始期。應探索適合當地的棉花干播濕出技術，提前施用生物菌劑。

4.2生防菌在土壤中的定植、自然增殖能力較差。應增施羊糞等有機肥，增加土壤中有機質的含量，改善土壤微生態并促進有益微生物的增長。

4.3重病田土壤中棉花黃萎病菌微菌核基數過大，達107數量級，甚至更高。重病棉田生防菌劑只能作為輔助措施，主要應依靠種植抗病品種。

4.4生防菌(菌劑)對土壤中微菌核的抑制能力較差。應施用以拮抗菌為主導包括促生、分解類有益微生物的微生物復合制劑，抑制病原真菌的同時提高作物的抗性以抵御病原菌的侵襲。