Frankia菌—細枝木麻黃共生體系對土壤Pb污染的響應研究

趙佳怡, 熊茂岑, 王鑫, 鐘鏌宇, 王婷, 潘遠智

四川農業大學風景園林學院，四川 成都 611130

細枝木麻黃（Casuarina cunninghamiana）屬于木麻黃科（Casuarinaceae）木麻黃屬常綠喬木，具有耐干旱、耐瘠薄、抗鹽堿生物固氮等特性[1]。隨著不斷深入研究，木麻黃屬植物已經運用在固氮改土、鹽堿地植被恢復和建立農林復合系統等方面[2]。有研究表明木麻黃對鉛的耐受濃度可達1800 mg·kg-1[3]。經本課題組預實驗發現細枝木麻黃在600 mg·kg-1鉛處理下受到脅迫但不致死。

Frankia菌作為放線菌中的一個屬，可以與非豆科植物共生結瘤[4]。作為木麻黃屬植物重要的共生菌，Frankia菌在固定氮素、培肥地力、提高植物生長勢和土壤生態修復等方面有著獨特優勢，目前已有研究表明木麻黃屬植物和Frankia菌之間的生物組合與木麻黃屬植物的固氮量密切相關[5]。另有研究表明Frankia菌株體內具有結合重金屬的蛋白質，因此具有積累Pb等重金屬的特性[6-9]。

鉛（Pb）毒性強、持久，殘留在土壤中可嚴重危害動植物生長。研究表明，隨著Pb進入土壤，土壤中的酶活性、土壤微生物生物量碳和微生物活性等都能受到一定抑制，土壤的理化性狀受到一定程度的影響[10]。近些年，我國重金屬污染土壤修復技術發展迅速，不斷創新，常見的例如：隔離包埋技術，固化穩定技術，氧化還原技術，微生物修復技術和植物修復技術等[11]。

隨著對Frankia菌的相關研究越來越深入，大量研究證明Frankia菌與木麻黃屬植物建立共生關系可以提高木麻黃對干旱、鹽堿、金屬毒害的抗性[12]。其中有研究證明木麻黃屬植物可以積累大量重金屬，且各林齡木麻黃對重金屬均有很好的富集作用，且根是木麻黃屬植物富集重金屬的主要部位[13，14]。然而，關于Frankia菌與木麻黃屬植物細枝木麻黃共生體系對土壤Pb污染的響應的影響還鮮有報道。本研究通過盆栽試驗，分析接種Frankia菌對細枝木麻黃結瘤量、礦質元素吸收，丙二醛、滲透調節物質含量及其根系活力的影響，以期為Frankia菌接種到植物中增加植物對重金屬的抗性提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

栽培基質：由珍珠巖、蛭石按體積比1∶1混合而成，試驗基質預先經過110 KPa、121℃高壓蒸汽滅菌2 h以確保殺死其他雜菌，備用。

細枝木麻黃（Casuarina cunninghamiana）苗木從廣州海田樹業有限公司購入，栽種于以草木灰為基質的塑料盆內，對其進行常規管理，待其生長出足夠的枝條，采取長勢一致、半木質化的枝條進行水培生根[14]，至根長約5 cm作為供試苗。

Frankiacasuarinae菌株購自德國萊布尼茨研究所“德國微生物菌種保藏中心”。實驗所用菌根接種劑是將購入凍干粉菌種進行擴大培養，經離心收集后輕微勻漿，用蒸餾水稀釋成為的菌懸液。

1.2 方法

試驗于2018年五月底至2021年二月在四川農業大學風景園林學院設施大棚內進行。在同一Pb濃度處理的條件下，試驗設3個Frankia菌梯度：0 mg·株-1（CK）、10 mg·株-1、20 mg·株-1處理，每個處理3次重復，每個重復8株，共72株苗木。將細枝木麻黃水培苗部分根尖剪去0.5～1 cm，在菌懸液中浸泡過夜，栽種于塑料花盆（直徑16 cm），每盆基質150 g，將浸泡根系后的菌懸液環繞澆在根部，置于28℃下培養3個月，每星期每株苗施無氮霍格蘭營養液100 mL。接種后每月觀察結瘤情況。對照不施肥，3個月后測苗高、地徑，用水洗凈根部，計數根瘤個數。

接種3個月后，每5 d對每株細枝木麻黃施加Pb濃度為600 mg·kg-1的醋酸鉛溶液，以分析純的(CH3COO)2Pb溶于蒸餾水中，環形澆施。28℃常規管理30 d后進行相關生理指標的測定。

1.3 測試指標及方法

1.3.1 植物Pb含量及其礦物質含量的測定

Pb脅迫處理后，將細枝木麻黃苗木小心取出，將干燥的植物樣品與土壤樣品研磨至通過1.5 mm篩，植物樣品采用HNO3-HClO4法消化（V∶V=5∶1），待測液用AA-700原子吸收分光光度計（島津，日本）測得細枝木麻黃枝條的Pb、K、Ca、Mg、Cu、Mn含量。

1.3.2 植物生理指標的測定

參考鄭炳松[15]硫代巴比妥酸法與考馬斯亮藍法分別測定細枝木麻黃地上部分丙二醛(MDA)含量與可溶性蛋白（Soluble Proteins，SP）含量，參考李合生[16]磺基水楊酸提取茚三酮顯色法測定葉片游離脯氨酸（Proline）含量；蒽酮比色法測定可溶性糖（Soluble Sugar，SS）含量；采用甲醇浸泡法測根系活力。

1.3.3 數據處理

Excel 2019統計軟件用于數據統計與繪圖，SPSS24.0軟件用于分析數據，采用單因素方差分析（OneWay ANOVA)，Duncan法進行多重比較，Pearson法進行相關性分析（雙尾檢驗）。

2 結果與分析

2.1 Frankia菌對Pb脅迫下細枝木麻黃生長的影響

由表1可知，在600 mg·kg-1Pb脅迫下，施用Frankia菌20 mg·株-1時，細枝木麻黃結瘤量相比接種10 mg·株-1增加了33.32%，接種Frankia菌10、20 mg·株-1，結瘤率均為100%。

表 1 Frankia菌對Pb處理下細枝木麻黃結瘤量的影響Tab. 1 Effect of Frankia bacteria on nodulation amount of Casuarina cunninghamiana under Pb treatment

2.2 Frankia菌對Pb脅迫下細枝木麻黃對各礦物質吸收能力的影響

由圖1分析可得，在相同Pb處理下，隨著接種量的增加，細枝木麻黃體內礦質元素出現了不同的趨勢：與CK相比，10～20 mg·株-1Frankia菌處理細枝木麻黃枝條中Pb含量顯著下降（P＜0.05），20 mg·株-1處理時，Pb含量相比對照下降了58.06%；圖2表明K含量在10 mg·株-1處理時達到最低值，僅為對照的66.95%，當接種量上升到20 mg·株-1時，K含量升高到對照的84.83%，與對照差異不顯著；Cu含量隨Frankia菌濃度升高呈現先上升后下降的趨勢，10 mg·株-1處理時，Cu含量達到最大值，比對照上升了64.0%。

圖 1 Frankia菌對Pb、Cu、Mn脅迫下細枝木麻黃地上部Pb積累量的影響Fig. 1 Effects of Frankia bacteria on Pb accumulation inaboveground part of Casuarina cunninghamiana under Pb, Cu and Mn stress

圖 2 Frankia菌對Pb脅迫下細枝木麻黃地上部K、Ca、Mg含量的影響Fig. 2 Effects of Frankia bacteria on K, Ca and Mg contents in aboveground part of Casuarina cunninghamiana under Pb stress

由表2分析可得，在相同濃度的Pb脅迫下，Frankia菌接種量與細枝木麻黃枝條中Pb含量呈極顯著負相關，細枝木麻黃枝條中Pb含量與Mn、K元素含量呈顯著正相關，說明Frankia菌接種量可以與細枝木麻黃地上部Pb含量變化有著密切的關系。

2.3 Frankia菌對Pb脅迫下細枝木麻黃生理的影響

由表3分析可得，當Frankia菌濃度為10 mg·株-1時，MDA含量相比對照顯著上升了22.87%，20 mg·株-1處理時，MDA含量相比對照下降了37.51%（P＜ 0.05）。

表3分別顯示了Pb脅迫下，不同接種量細枝木麻黃枝條中游離脯氨酸與可溶性糖的含量?？扇苄蕴呛侩S著接種量的上升，呈現先減少后升高的趨勢，接種量為10 mg·株-1時，可溶性糖比對照組下降了37.10%；接種量為20 mg·株-1時，可溶性糖含量相比對照下降了10.10%。接種量為10 mg·株-1時，游離脯氨酸小幅上升，但與對照差異不顯著，接種量上升到20 mg·株-1時，游離脯氨酸顯著變化（P＜0.05），相比對照降低了56.04%。

表 2 細枝木麻黃地上部分金屬含量與Frankia接種量間的相關性Tab. 2 Correlation between metal content in aboveground part of Casuarina cunninghamiana and inoculation amount of Frankia

表 3 Frankia對Pb處理下細枝木麻黃逆境生理指標的影響Tab. 3 Effects of Frankia bacteria on stress physiological index of Casuarina cunninghamiana under Pb treatment

圖3顯示了，Frankia菌接種量為10 mg·株-1時，細枝木麻黃根系活力小幅增強；接種量為20 mg·株-1時細枝木麻黃的根系活力TTC還原強度最強，與對照相比上升了87.12%。

圖 3 Frankia對Pb處理下細枝木麻黃根系活力的影響Fig. 3 Effect of Frankia bacteria on root activity of Casuarina cunninghamiana under Pb treatment

3 討論

植物根系作為直接與Frankia菌接觸的器官，在一定濃度范圍內，隨著接種量的增大，植株接種效果越好[17]，本試驗結果表明，在600 mg·kg-1Pb脅迫下，接種Frankia菌可以使其全部結瘤，且高接種量Frankia菌（=20 mg·株-1）時，結瘤數量上升明顯，這一結果與李遙研究Frankia菌接種量對榿木生長的影響一致。

植物從土壤中吸收重金屬，并把它們固定在根部，限制重金屬向地上部分轉移[18]。本試驗中隨著接種量的增加，細枝木麻黃枝條Pb含量明顯減少。這與蘇芳芳[19]雙接種（AMF與Frankia菌）楊梅葉片中Pb含量的變化一致?？赡苁且驗槟韭辄S根限制重金屬進入地上部分，而與Frankia菌的結合增加了對重金屬的富集作用[13，19]。Mn可以維持葉綠體膜正常結構，并且直接參與光合作用[20]，Mg離子螯合酶將Mg離子插入到原卟啉中，進一步反應形成最終產物葉綠素[21]，這兩種必須元素對植物光合作用有重要影響。與CK相比，本試驗中施用不同量的Frankia菌細枝木麻黃地上部Mn含量變化與Mg含量變化均不顯著，這說明Frankia菌可能對細枝木麻黃光合作用無影響。

丙二醛（MDA）作為膜脂過氧化的產物之一，是植物遭受逆境傷害程度的重要指標，其積累能夠加劇膜脂過氧化作用，增加植物體內的活性氧、打破活性氧的代謝平衡以應對逆境脅迫[22，23]。劉慧芹[24]等的研究認為隨著脅迫時間及Pb濃度的增加，黑麥草幼苗體內MDA含量與Pb濃度呈線性正相關(r2＞0.96)。本試驗結果表明，在Pb脅迫下，Frankia接種量為20 mg·株-1時，MDA含量有明顯的降低，表明高接種量細枝木麻黃細胞膜脂過氧化作用有所減緩，Frankia菌可以通過降低細枝木麻黃體內的MDA的含量來抵御Pb脅迫。但是接種量較低時，細枝木麻黃細胞受損程度反而比對照組升高，這與前人研究結果不一致，其原因有待進一步研究。

游離脯氨酸作為蛋白質的一種重要組分，會在植物受到脅迫時隨著蛋白質的分解釋放出來，增加細胞質的濃度以維持細胞代謝活動[25]?？扇苄蕴?、游離脯氨酸是植物體內的滲透調節物質，植物在遭受逆境的時候通常會通過積累可溶性糖、游離脯氨酸等滲透調節物質抵御逆境脅迫[26]。毛雪飛[27]等的研究認為，在一定范圍內隨著Pb濃度的增加，游離脯氨酸、可溶性糖含量有所增加。不同植物體內可溶糖含量的變化較為復雜[24]。本試驗結果表明接種了Frankia菌的細枝木麻黃積累的可溶性糖更少，游離脯氨酸的積累量也更低。

根系是植物吸收土壤水分和養分的重要器官，可以直接影響植物的正常生長[28]。土壤重金屬向植物根部遷移是植物吸收累積重金屬的重要途徑[29]，重金屬脅迫后植物的根系活力能表現出該植物對重金屬的逆境脅迫處理的機體反應[30]。本試驗中，Frankia菌接種量達20 mg·株-1可以顯著提高細枝木麻黃的根系活力，根系活力高表明Frankia菌從一定程度上降低了重金屬Pb對根系生長發育的抑制作用。

4 結論

（1）接種Frankia濕菌體量由10 mg·株-1增加到20 mg·株-1時，細枝木麻黃結瘤量也增加，結瘤率都可達100%。

（2）從幼苗細枝木麻黃枝條的Pb含量來看，接種Frankia可以降低細致木麻黃枝條內Pb與K的含量，顯著地增加了Cu的含量，但對其他礦質元素的影響并不顯著。今后可以適當的增加Frankia菌的接種量，進一步探究Frankia菌接種量與細枝木麻黃礦質元素吸收之間的關系。

（3）在同一Pb脅迫濃度下，接種量為20 mg·株-1時，細枝木麻黃生長良好，Frankia菌可以有效的緩解細枝木麻黃對土壤高濃度Pb毒害的響應，在防治土壤Pb污染上具有很大的潛力和價值。