葛根素通過miR- 490/E3泛素連接酶抑制非小細胞肺癌細胞生長、侵襲和遷移

張鈺欣，張臻臻，趙利剛，趙琳琳

華北理工大學藥學院，河北唐山 063000

肺癌是最常見的癌癥之一，也是目前全球癌癥死亡的主要原因之一[1- 2]。根據組織學類型分類，肺癌主要包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌患者約占83%，且大多數確診患者均為晚期疾病，治療難、易復發、生存期短[3- 4]。因此，探究治療藥物及其作用機制對延長患者生存期，改善預后至關重要。

葛根素(puerarin)是從葛根中提取的主要生物活性成分，屬于異黃酮類化合物[5- 6]，具有舒張血管、保護心臟、保護神經、抗氧化、抗癌、抗炎、減輕疼痛、促進骨形成、抑制酒精攝入和減輕胰島素抵抗等作用，因此被廣泛應用于心腦血管疾病、糖尿病、帕金森病、骨壞死以及子宮內膜異位癥等疾病的治療[7- 10]。近期研究發現，葛根素具有抗癌作用，能夠抑制胃癌、肝癌、乳腺癌等癌細胞生長，并誘導細胞凋亡[11- 12]。目前有關葛根素對肺癌細胞影響的研究甚少，且葛根素在肺癌細胞中的調控機制尚未明確。

有研究發現，葛根素可通過調控細胞內microRNA的表達，發揮抑癌作用[13- 14]。本課題組前期實驗顯示，不同濃度葛根素處理后miR- 490的表達明顯升高。miR- 490是目前研究較多的抑癌因子之一，可抑制胃癌、乳腺癌、結腸癌、食管癌等惡性腫瘤的生長、遷移和侵襲[15- 17]。miR- 490在非小細胞肺癌中同樣具有抑癌作用[18]。且經過生物信息學篩選發現miR- 490潛在下游靶基因為E3泛素連接酶(denticleless E3 ubiquitin protein ligase，DTL)，DTL在非小細胞肺癌中表達異常上調[19]。本研究通過培養非小細胞肺癌細胞株A549細胞，并對細胞進行分組處理，研究了葛根素對非小細胞肺癌生長、侵襲和遷移的影響，探討相關的分子調控機制。

材料和方法

細胞培養及分組A549細胞購自ATCC庫，37 ℃、5% CO2條件下采用90% RPMI- 1640+10% FBS培養基，同時補充10%胎牛血清(Gibco，Thermo Fisher Scientific，USA)和100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素進行培養。葛根素以100 mmol/L濃度的儲備液儲存于DMSO中，溫度為-20 ℃，并用無血清培養基稀釋，以供實驗使用。細胞培養24 h后，采用0、5、10、20 μmol/L濃度的葛根素處理A549細胞，處理24 h，然后進行分組以供后續實驗，包括如下6組：(1)對照組：單純DMSO處理；(2)葛根素組：單純葛根素處理；(3)葛根素+miR- 490陰性對照組：葛根素處理，轉染miR- 490陰性對照；(4)葛根素+miR- 490沉默模擬物組：葛根素處理，轉染miR- 490沉默模擬物；(5)葛根素+miR- 490沉默模擬物+DTL陰性對照組：葛根素處理，轉染miR- 490沉默模擬物和DTL陰性對照；(6)葛根素+miR- 490沉默模擬物+DTL沉默質粒組：葛根素處理，轉染miR- 490沉默質粒和DTL沉默質粒。此外，為確認質粒轉染成功并采用雙熒光素酶報告分析驗證miR- 490靶向調控DTL表達，將未經葛根素處理的A549細胞分為以下4組：(1)miR- 490過表達對照組：轉染miR- 490模擬物陰性對照；(2)miR- 490過表達模擬物組：轉染miR- 490過表達模擬物；(3)miR- 490沉默陰性對照組：轉染miR- 490沉默陰性對照；(4)miR- 490沉默組：轉染miR- 490沉默質粒。miR- 490過表達模擬物和抑制物及其陰性對照購自上海吉瑪基因公司。si-NC與Si-DTL均由美國Thermo fisher公司設計并合成。將A549細胞分別以1×106個/孔接種于6孔板中過夜，采用Lipofectamine 2000轉染試劑轉染細胞。

qRT-PCR檢測根據操作說明書，采用Trizol試劑從細胞中提取總RNA，TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]進行反轉錄，SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒(日本Takara公司)進行qRT-PCR，其中，miR- 490使用U6進行標準化分析，DTL、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)使用GAPDH進行標準化分析。采用ABI 7500檢測系統(美國Applied Biosystems公司)進行qRT-PCR檢測，每個樣本重復3次，用2-ΔΔCt法計算相對表達水平。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

Western blot檢測取處理后的細胞，移除細胞培養瓶中的細胞培養液，用預冷的PBS洗3遍，加入含有10%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液 (MCE，USA)，將細胞樣品移至1.5 ml離心管中，13 000 ×g離心10 min取上清，BCA法測定蛋白質濃度后保存于-20 ℃備用。采用SDS-PAGE凝膠試劑盒配制12%分離膠和濃縮膠，在聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離蛋白后采用濕轉方法將蛋白轉至NC膜上，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h。滴加稀釋的一抗兔抗DTL (ab184548，abcam，USA)、E-cadherin (14- 3249- 82，Thermo Fisher，USA)、N-cadherin(PA5- 19486，Thermo Fisher，USA)、Vimentin (PA5- 27231，Thermo Fisher，USA)。4 ℃過夜，次日用PBST洗膜3次，每次10 min，孵育二抗IgG (a0208，上海碧云天生物技術有限公司)，室溫置于搖床振蕩2 h，再次用PBST洗膜3次，每次10 min。加入顯影劑并通過Bio-Rad凝膠成像系統顯影 (MG8600，北京托摩根生物科技有限公司)，使用IPP7.0軟件 (Media Cybernetics，Singapore) 進行定量分析。

CCK- 8法檢測采用CCK- 8試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)檢測葛根素對A549細胞生長的抑制作用，具體為：A549細胞以3000個/孔的密度接種于96孔板中，用5、10、20 μmol/L葛根素處理不同時間點的細胞，并設不加藥物處理(0 μmol/L)的細胞作為對照組；向每個孔中加入1/10體積的CCK- 8溶液，37 ℃、5% CO2條件下將培養皿再培養2 h；使用微板閱讀器(Bio-Rad Laboratories，USA)在450 nm波長下測定光密度。每個實驗分3次進行，結果表示為抑制率(inhibition rate，IR)，計算公式如下：IR(%)=[(A-B)/A]× 100，其中A和B分別為對照組和樣品組在不同孵育時間點后的吸光度。

Transwell檢測采用包被基質凝膠(Becton Dickinson，USA)的Transwell膜對A549細胞進行體外侵襲性檢測，無包被基質凝膠的Transwell膜進行細胞遷移能力檢測。用加葛根素(20 μmol/L)預處理24 h的A549細胞在無血清培養基中以2×104個/孔的速度被鍍在上腔中，在下腔的培養基中加入20%的胎牛血清。孵育24 h后，用棉簽從上孔中取出非侵襲性細胞，底部細胞用95%乙醇固定，蘇木精染色。隨機選取10個視野進行細胞計數，實驗重復3次。

雙熒光素酶報告檢測使用TargetScan數據庫(http：//www.targetscan.org/vert_72/)進行miR- 490和DTL結合位點分析，并獲取含有作用位點的片段序列。分別克隆擴增miR- 490全長、DTL的3’UTR區到pmirGLO (E1330，Promega，USA) 熒光素酶報告載體上，命名為DTL-Wt。預測miR- 490和DTL的結合位點，進行定點突變，構建DTL-Mut載體，內參為表達海腎熒光素酶的pRL-TK載體 (E2241，Promega，USA)，miR- 490過表達質粒及過表達陰性質粒分別與熒光素酶報告載體共轉染進入293T細胞，熒光檢測儀 (Glomax20/20，Promega，USA) 檢測熒光強度。

統計學處理采用SPSS 23.0統計軟件，符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用Studentt檢驗或方差分析，并進行Bonferroni校正[20]，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

葛根素抑制非小細胞肺癌細胞生長，上調miR- 490表達，下調DTL表達用不同濃度的葛根素處理A549細胞，CCK- 8法檢測經葛根素處理后細胞生長抑制率，結果顯示，隨著濃度逐步升高，細胞抑制率逐步升高(F=105.375，P<0.001)(圖1A)。qRT-PCR檢測細胞中miR- 490和DTL的表達，結果顯示，隨著葛根素濃度升高，miR- 490表達逐步升高(F=32.919，P<0.001)，DTL表達逐步降低(F=116.120，P<0.001)(圖1B)。

miR- 490靶向抑制DTL的表達通過網站(http：//www.targetscan.org/vert_72/)查詢發現，miR- 490和DTL之間存在結合位點(圖2A)。雙熒光素酶報告分析顯示，與miR- 490過表達對照組相比，miR- 490模擬物和pGL3-DTL Wt共轉染后，miR- 490過表達模擬物組熒光素酶活性顯著降低(t=7.762，P=0.016)(圖2B)。qRT-PCR檢測結果顯示，與miR- 490過表達對照組相比，miR- 490過表達模擬物組的miR- 490 mRNA表達顯著升高(t=13.319，P<0.001)，DTL mRNA表達顯著降低(t=7.415，P=0.002)；與miR- 490沉默陰性對照組相比，miR- 490沉默組細胞中miR- 490表達顯著降低(t=9.523，P=0.001)，DTL mRNA的表達顯著升高(t=11.305，P<0.001)(圖2C)。Western blot檢測結果顯示，與miR- 490過表達對照組相比，miR- 490過表達模擬物組的DTL蛋白表達顯著降低(t=7.953，P=0.001)；與miR- 490沉默陰性對照組相比，miR- 490沉默組細胞中的DTL 蛋白表達顯著升高(t=10.552，P<0.001)(圖2D、2E)。經葛根素處理后，qRT-PCR檢測結果顯示，與對照組相比，葛根素組細胞miR- 490表達顯著升高(t=10.255，P=0.001)，DTL mRNA表達顯著降低(t=6.682，P=0.003)；與葛根素+miR- 490陰性對照組相比，葛根素+miR- 490沉默模擬物組細胞中miR- 490表達顯著降低(t=10.995，P<0.001)，DTL mRNA表達顯著升高(t=12.478，P<0.001)；與葛根素+miR- 490沉默模擬物+DTL陰性對照組相比，葛根素+miR- 490沉默模擬物+DTL沉默質粒組細胞miR- 490表達差異無統計學意義(t=1.081，P=0.341)，DTL mRNA表達顯著降低(t=14.321，P<0.001)(圖2F)。Western blot檢測結果顯示，與葛根素+miR- 490陰性對照組相比，葛根素+miR- 490沉默模擬物組DTL蛋白表達顯著升高(t=11.423，P<0.001)；與葛根素+miR- 490沉默模擬物+DTL陰性對照組相比，葛根素+miR- 490沉默模擬物+DTL沉默質粒組細胞的DTL蛋白表達顯著降低(t=12.080，P<0.001)(圖2G、2H)。

DTL：E3泛素連接酶

Mr：相對分子質量

葛根素通過miR- 490/DTL抑制非小細胞肺癌細胞增殖CCK- 8法檢測結果顯示，與對照組相比，葛根素組細胞增殖能力顯著降低(F=129.27，P<0.001)；與葛根素+miR- 490陰性對照組相比，葛根素+miR- 490沉默模擬物組細胞增殖能力顯著升高(F=75.12，P<0.001)；與葛根素+miR- 490沉默模擬物+DTL陰性對照組相比，葛根素+miR- 490沉默模擬物+DTL沉默質粒組細胞增殖能力顯著降低(F=52.59，P<0.001)(圖3)。

葛根素通過miR- 490/DTL抑制非小細胞肺癌細胞遷移Transwell檢測結果顯示，與對照組相比，葛根素組細胞遷移能力顯著降低(t=8.963，P=0.001)；與葛根素+miR- 490陰性對照組相比，葛根素+miR- 490沉默模擬物組細胞遷移能力顯著升高(t=12.117，P<0.001)；與葛根素+miR- 490沉默模擬物+DTL陰性對照組相比，葛根素+miR- 490沉默模擬物+DTL沉默質粒組細胞遷移能力顯著降低(t=12.934，P<0.001)(圖4)。

葛根素通過miR- 490/DTL抑制非小細胞肺癌細胞侵襲Transwell檢測結果顯示，與對照組相比，葛根素組細胞侵襲能力顯著降低(t=4.710，P=0.009)；與葛根素+miR- 490陰性對照組相比，葛根素+miR- 490沉默模擬物組細胞侵襲能力顯著升高(t=13.264，P<0.001)；與葛根素+miR- 490沉默模擬物+DTL陰性對照組相比，葛根素+miR- 490沉默模擬物+DTL沉默質粒組細胞侵襲能力顯著降低(t=13.476，P<0.001)(圖5)。

與對照組比較，aP<0.001；與葛根素+miR- 490陰性對照組比較，bP<0.001；與葛根素+miR- 490沉默模擬物+DTL陰性對照組比較，cP<0.001

葛根素通過miR- 490/DTL抑制非小細胞肺癌細胞上皮細胞-間充質轉化進程為進一步研究葛根素通過miR- 490/DTL對非小細胞肺癌上皮細胞-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程的影響，本研究采用Western blot檢測EMT的標志因子E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達，結果顯示，與對照組相比，葛根素組E-cadherin蛋白表達顯著升高(t=7.137，P=0.002)，N-cadherin(t=8.828，P=0.001)和Vimentin蛋白表達(t=6.594，P=0.003)顯著降低；與葛根素+miR- 490陰性對照組相比，葛根素+miR- 490沉默模擬物組細胞中E-cadherin蛋白表達顯著降低(t=12.376，P<0.001)，N-cadherin(t=13.436，P<0.001)和Vimentin蛋白表達(t=11.467，P<0.001)顯著升高；與葛根素+miR- 490沉默模擬物+DTL陰性對照組相比，葛根素+miR- 490沉默模擬物+DTL沉默質粒組E-cadherin蛋白表達顯著升高(t=13.081，P<0.001)，N-cadherin(t=10.835，P<0.001)和Vimentin蛋白表達(t=11.862，P<0.001)顯著降低(圖6)。

討 論

葛根素是葛根中含量最豐富的次生代謝產物，且隨著對葛根素的深入研究，發現葛根素不僅對退行性神經疾病和心腦血管疾病具有顯著療效，還可發揮抗癌作用[20- 21]。近年來，越來越多的文獻報道葛根素在各類癌細胞中的作用。Deng等[22]研究顯示，葛根素可下調促腫瘤細胞因子水平，顯著降低炎癥反應，抑制EMT，進而抑制結腸癌的進展。Yi等[23]研究發現，基于納米給藥系統，體內實驗證實葛根素可抑制腫瘤細胞生長。Tao等[24]研究認為，葛根素可干預肺癌干細胞樣細胞活力，抑制自我更新和侵襲能力，可作為治療肺腺癌的候選化合物。此外，葛根素可抑制膀胱癌T24細胞增殖并誘導凋亡，其機制可能與抑制沉默信息調節因子1、p53信號通路有關[25]。有研究報道，葛根素在非小細胞肺癌中同樣具有抑癌作用，可抑制非小細胞肺癌遷移和侵襲[26]，但是葛根素在非小細胞肺癌中的調控機制目前尚未明確。本研究采用不同濃度的葛根素處理非小細胞肺癌細胞株A549細胞，結果發現隨著處理濃度的升高，A549細胞生長逐步受到抑制。

與對照組比較，a P=0.001；與葛根素+miR- 490陰性對照組比較，bP<0.001；與葛根素+miR- 490沉默模擬物+DTL陰性對照組比較，cP<0.001

與對照組比較，aP=0.009；與葛根素+miR- 490陰性對照組比較，bP<0.001；與葛根素+miR- 490沉默模擬物+DTL陰性對照組比較，cP<0.001

A.蛋白免疫印跡圖；B.上皮細胞-間充質轉化相關蛋白E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達

葛根素通常通過調控癌細胞生長、遷移和侵襲相關的分子機制，進而抑制腫瘤細胞的發展。有研究顯示，在乳腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤中，可通過調控microRNA的表達，起到抑制腫瘤發展的作用[27- 28]。本研究顯示，用不同濃度葛根素處理A549細胞，miR- 490的表達出現明顯變化，隨著葛根素處理濃度升高，miR- 490表達也隨之逐步升高。因此推測在非小細胞肺癌中，葛根素可能通過上調miR- 490的表達，進而影響非小細胞肺癌的生長、侵襲和遷移。miR- 490是目前研究較多的抑癌因子之一，其在膽管癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等癌癥中均具有抑癌作用[29- 30]。Gu 等[31]研究表明miR- 490在肺癌細胞中表達顯著下調，并且具有抑制肺癌細胞增殖的作用。

為證實這一推測，對細胞進行葛根素與miR- 490抑制物聯合處理，并檢測處理后的A549細胞生長、遷移和侵襲的情況，結果顯示，miR- 490抑制后，葛根素對A549細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用被顯著阻斷，由此表明葛根素可通過上調miR- 490的表達，進而抑制非小細胞肺癌生長、侵襲和遷移。

DTL已被證實是一種潛在的促癌因子[32]。Perez-Pea 等[33]研究表明，DTL在乳腺癌和肺癌中的表達均顯著升高。本研究通過生物信息學篩選發現，miR- 490與DTL之間存在結合位點，因此推測DTL可能是miR- 490新的靶基因。雙熒光素酶報告初步顯示，miR- 490與DTL之間存在靶向關系。通過對miR- 490抑制聯合DTL沉默處理證實，miR- 490可通過抑制DTL的表達，抑制非小細胞肺癌的生長和遷移。

綜上，本研究結果顯示，在非小細胞肺癌中，葛根素可通過上調miR- 490的表達，靶向抑制下游靶基因DTL的表達，進而抑制非小細胞肺癌生長和遷移。