家蠶Fox轉錄因子在精巢中的表達特征及BmFoxL2在精巢發育中的功能初探

胡啟豪，戴玉玲，裴夢圓，肖妍虹，趙丹琿，余小強，盧玉珍

(華南師范大學生命科學學院，廣東省昆蟲發育生物學與應用技術重點實驗室，廣州 510631)

家蠶是我國重要的經濟益蟲，經過長期的馴化和人工育種，目前已經培育出大批具備優良性狀的家蠶品種。遺傳雜交是人工育種的關鍵步驟，其中雄性家蠶精子質量的高低直接影響著后代的性狀。精巢作為精子發生的場所，其發育機制的研究對于家蠶遺傳育種有著重要的意義。

Fox家族蛋白存在于植物以外的生物類群當中，具有一個約含100個氨基酸的保守結構域，根據不同Fox蛋白的保守性，可分為19個亞族：FoxA～FoxS(Weigeletal., 1989; Kerschneretal., 2014)。不同Fox蛋白已被證明在哺乳動物和昆蟲的組織發育和先天免疫等多種生物學過程中發揮關鍵作用。在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中，FoxN3(CHES-1-like)的過表達會導致精巢形態異常，并抑制精子發生的過程(Yuetal., 2016)。甜菜夜蛾SpodopteraexiguaSeFox蛋白結構與家蠶BmFoxA相似，并且在精巢中有一定水平的表達(Zhaoetal., 2014)。家蠶的BmFoxG-1可能通過調節BmCyclinA等細胞周期基因的表達，從而調節家蠶精巢的發育(胡啟豪等, 2021)。Song等通過基因芯片(Microarray)的方法分析發現不同Fox基因在家蠶精巢中都有不同程度的表達(Songetal., 2015)。這些研究都說明Fox基因的功能可能與精巢發育相關，但其具體作用機制仍不清楚。

本研究通過qRT-PCR檢測了不同BmFox基因在家蠶5齡第5天(L5D5)幼蟲和預蛹期精巢中的表達水平，結果發現BmFoxL2亞族基因在兩個時間點均有高水平表達。本研究利用生物信息學方法對家蠶FoxL2亞族蛋白的結構進行了分析，并進一步分析BmFoxL2-1和BmFoxL2-2在家蠶不同發育階段精巢中的表達情況以及在Bm12中的表達定位。最后，在家蠶Bm12細胞中分別過表達BmFoxL2-1和BmFoxL2-2蛋白，并分析了BmVasa等生殖和細胞周期相關基因的表達變化。本研究的結果初步說明BmFoxL2亞族蛋白參與了家蠶精巢發育及精子發生的過程。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

本研究使用的大造家蠶品種由廣東省蠶業技術推廣中心提供，家蠶的培養條件參考的方法胡啟豪等( 2021)。家蠶Bm12細胞、大腸桿菌DH5α和細胞過表達載體IE1-pEGFP-N1等均為本實驗室保存材料。

Trizol總RNA提取試劑購自中國艾科瑞生物公司；反轉錄試劑盒和qRT-PCR試劑購自康為世紀生物技術有限公司；細胞轉染試劑購自Qiagen公司；引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成；去內毒素質粒小量抽提試劑盒購自廣州美基生物科技有限公司；實驗所用其它試劑均為國產分析純試劑。

1.2 生物信息學分析

從家蠶基因組數據庫SilkDB中獲得BmFoxL2-1(BGIBMGA000635)和BmFoxL2-2(BGIBMGA000838)基因及蛋白質序列。蛋白質理化性質預測通過ExPASy進行，磷酸化位點及糖基化位點利用Cbs網站進行分析，蛋白結構域利用SMART進行分析。

1.3 不同發育階段家蠶精巢cDNA制備

收集5齡第3天(L5D3)幼蟲至成蟲第3天的雄性家蠶，在PBS緩沖液中進行解剖并取出精巢。采用Trizol法提取總RNA。逆轉錄反應按照康為世紀HiFiScript gDNA removal RT Master Mix 說明書進行，cDNA保存于-20℃。

1.4 不同Fox基因在家蠶不同發育階段精巢中的表達量檢測

以稀釋后的cDNA為模板，采用qRT-PCR方法分析目標基因的表達情況，以家蠶rp49作為內參基因。qRT-PCR循環條件如下：95°C 5 min；95°C 10 s，60°C 30 s，40個循環。本研究所用引物序列見表1。

表1 實驗所用引物的序列

1.5 BmFoxL2-1/-2細胞過表達重組質粒的構建

根據BmFox2-1/-2的cDNA序列，設計上下游引物(表1)，克隆方法參考的方法胡啟豪等(2021)。利用SacⅠ和BamHⅠ對目的片段及pEGFP-N1-GFP載體進行雙酶切，DNA凝膠回收后用T4連接酶將兩者連接構建重組載體，經PCR與雙酶切驗證后轉化進大腸桿菌DH5α中保存。采用去內毒素質粒抽提試劑盒抽提質粒供轉染使用。

1.6 BmFoxL2-1/BmFoxL2-2在 Bm12細胞株的過表達及細胞定位分析

將Bm12細胞用新鮮培養基懸浮，分裝至6孔板中，并補足培養基至每孔2 mL，當每孔細胞密度達到80%以上時，參考Qiagen轉染試劑說明書的方法將BmFoxL2-1-EGFP和BmFoxL2-2-EGFP質粒轉染Bm12細胞。

轉染48 h后，去除細胞培養液，加入適量PBS清洗細胞。用4%多聚甲醛固定細胞，用1‰ PBT(含1‰ Triton X-100的PBS)對固定后的細胞進行通透。往細胞中加入適量濃度的DAPI對細胞進行染色，結束后用1‰ PBT清洗多余的DAPI。制片后于激光共聚焦顯微鏡下分析BmFoxL2-1-EGFP和BmFoxL2-2-EGFP在細胞中的定位。

2 結果與分析

2.1 不同Fox基因在家蠶精巢中的表達

家蠶存在有核與無核兩種形態的精子，分別在幼蟲階段和預蛹期形成，因此本研究收集了5齡第5天(L5D5)幼蟲和預蛹期(PP)家蠶精巢。定量分析顯示，在兩個時期的家蠶精巢中，BmFoxL2-2的表達水平均顯著高于其它BmFox基因，FoxL2亞族的BmFoxL2-1和FoxO亞族的BmFoxO-1/BmFoxO-2的表達水平次之(圖1)。因此，在后續的研究中將重點分析BmFoxL2-1和BmFoxL2-2在精巢發育中的作用。

圖1 不同BmFox基因在幼蟲和預蛹期家蠶精巢中的表達Fig.1 Expression of different BmFox genes in the testis of Bombyx mori larvae and prepupae注：A，5齡第5天幼蟲；B，預蛹。不同字母表示差異性顯著(單因素方差分析，Turkey多重比較，P<0.05)。Note: A, The day 5 of 5th instar larvae; B, Prepupae. Different letters indicated significant difference between the two groups (One way ANOVA: Tukey’s HSD tests, P<0.05).

2.2 BmFoxL2蛋白的結構及理化性質分析

為進一步了解BmFoxL2的功能，本研究對BmFoxL2蛋白的理化性質進行分析。結果顯示BmFoxL2-1和BmFoxL2-2蛋白的分子量分別為20.35 kDa和24.52 kDa，等電點分別為9.85和5.87，BmFoxL2-1蛋白的磷酸化和糖基化位點都高于BmFoxL2-2(表2)。利用SMART網站對2個BmFoxL2亞族蛋白的結構預測，結果顯示均含一個Forkhead結構域(圖2-A)，并且Forkhead結構域的序列與其它昆蟲以及人類FoxL2亞族蛋白的高度保守(圖2-B)。

圖2 BmFoxL2-1和BmFoxL2-2蛋白結構、序列和定位分析Fig.2 Structural analysis, sequence aglinment and cellular localization of BmFoxL2-1 and BmFoxL2-2注：A，蛋白結構預測；B，氨基酸序列比對；C，細胞定位分析。Note: A, Structural analysis; B, Sequence aglinment; C, Cellular localization.

表2 BmFoxL2-1和BmFoxL2-2蛋白理化性質分析

為了進一步確認BmFoxL2-1/BmFoxL2-2的亞細胞定位，將構建好的BmFoxL2-1-EGFP和BmFoxL2-2-EGFP質粒轉染家蠶Bm12細胞株(圖2-C)。結果顯示BmFoxL2-1定位于細胞核，BmFoxL2-2在細胞核與細胞質中都有分布，這可能是由于BmFoxL2-1和BmFoxL2-2上所含的磷酸化和O-糖基化位點數目不一所導致的。以上結果說明BmFoxL2-1和BmFoxL2-2的功能可能存在差異。

2.3 BmFoxL2亞族基因在精巢中的表達

為進一步分析BmFoxL2亞族基因的功能，本文檢測了兩個FoxL2亞族基因在5齡第5天家蠶幼蟲精巢和卵巢中的表達變化，發現兩個BmFoxL2亞族基因在精巢中的表達均顯著高于卵巢(圖3-A)。由于精巢是精子發生的主要場所，因此本研究對5齡第5天家蠶幼蟲精巢的精巢膜和精巢內容物進行分離。對精巢膜和內容物的基因表達檢測顯示兩個BmFoxL2亞族基因在精巢內容物中的表達水平均顯著高于精巢膜(圖3-B)，說明BmFoxL2蛋白可能參與精子發生。

圖3 BmFoxL2-1 和BmFoxL2-2基因在家蠶中的表達Fig.3 Expression of BmFoxL2-1 and BmFoxL2-2 transcripts in silkworm注：A，BmFoxL2-1和BmFoxL2-2基因在家蠶精巢和卵巢中的表達；B，BmFoxL2-1和BmFoxL2-2基因在精巢內容物與精巢膜中的表達；C，BmFoxL2-1和BmFoxL2-2基因在不同發育階段的精巢中的表達變化。柱上標有星號表示兩組的表達差異顯著(*，P<0.05；***，P<0.001；t檢驗)。Note: A, Expression of BmFoxL2-1 and BmFoxL2-2 transcripts in the testis and ovary of silkworm at day 5 of 5th instar larvae; B, Expression of BmFoxL2-1 and BmFoxL2-2 mRNAs in different parts of the testis at day 5 of 5th instar larvae; C, Expression of BmFoxL2-1 and BmFoxL2-2 transcripts in the testis of silkworm at different developmental stages. The asterisk above the column indicated significant difference between the two groups (*, P<0.05; ***, P<0.001; t-test).

為了分析BmFoxL2基因在精巢中的表達模式，本研究在5齡第3天幼蟲到成蟲第1天的家蠶精巢中通過qPCR檢測兩個BmFoxL2基因的表達量。結果顯示，BmFoxL2-1的表達水平隨著精巢的發育逐漸升高，但在幼蟲階段增速緩慢，而進入蛹期后，上升速度開始加快。BmFoxL2-2的表達水平在5齡幼蟲末期(L5D5)達到一個高峰，在變態發育階段逐漸下降(L5D5-PP)，在蛹期階段(P0-P5)緩慢回升，到了成蟲階段迅速下降。但BmFoxL2-2在不同發育階段精巢中的表達均高于BmFoxL2-1(圖3-C)。該結果進一步暗示BmFoxL2-2可能在有核精子的形成中發揮作用，而BmFoxL2-1和BmFoxL2都可能與無核精子的形成相關。

2.4 BmFoxL2亞族蛋白對精巢生殖細胞發育的影響

細胞周期蛋白與生殖細胞有絲分裂和減數分裂等過程有著密不可分的關系。報道顯示BmFoxG-1可能通過調節細胞周期等基因的表達，參與精子發生過程。本研究在Bm12細胞株中過表達了BmFoxL2-1基因，發現細胞周期基因BmCyclinA的表達顯著上調，而生殖干細胞發育關鍵基因BmNanos的表達也發生了顯著上調(圖4)。而過表達BmFoxL2-2基因后，BmCyclinA、BmCyclinB和BmCyclinB3等細胞周期基因的表達顯著上調，BmNanos和BmVasa等生殖干細胞發育關鍵基因的表達也發生了顯著上調(圖5)。以上結果說明，兩個BmFoxL2亞族蛋白都可能通過調節生殖干細胞的發育及精細胞分裂等過程，影響家蠶精子的發生，而且BmFoxL2-2的調控功能更加顯著。

圖4 BmFoxL2-1蛋白對精子發生相關基因表達的影響Fig.4 Effect of BmFoxL2-1 overexpression on the expression of genes related to spermatogenesis注：柱上標有星號表示兩組的表達差異顯著；NS兩組的表達差異不顯著(*，P<0.05；**，P<0.01；t檢驗)。Note: Asterisks above the columns indicated significant difference between the two groups, “NS” indicates non-significant between the two groups (*, P<0.05; **, P < 0.01; t-test).

圖5 BmFoxL2-2蛋白對精子發生相關基因表達的影響Fig.5 Effect of BmFoxL2-2 overexpression on the expression of genes related to spermatogenesis注：柱上標有星號表示兩組的表達差異顯著；NS兩組的表達差異不顯著(*，P<0.05；t檢驗)。Note: Asterisks above the columns indicated significant difference between the two groups; “NS” indicated non-significant between the two groups (*, P<0.05; t-test).

3 結論與討論

FoxL2為Fox家族蛋白的一員，被認為是動物性別分化的關鍵因子。在小鼠中，FoxL2純合突變可以導致次級卵泡的缺失和卵母細胞的閉鎖(Uhlenhautetal., 2009)。在褐飛虱Nilaparvatalugens和沙漠飛蝗Schistocercagregaria中也發現FoxL2在卵巢中有較高水平的表達，并影響卵巢的發育(De Loofetal., 2010; Yeetal., 2017)。盡管也有研究顯示FoxL2在泥蟹Scyllaparamamosain等動物精巢中的表達高于卵巢，家蠶Microarray數據也顯示FoxL2-2基因在精巢中的表達高于卵巢，但FoxL2蛋白在精巢中的功能仍不清楚(Songetal., 2015; Wanetal., 2021)。本研究通過qRT-PCR實驗發現兩個家蠶BmFoxL2基因在精巢中的表達水平顯著高于卵巢，并且主要在精巢內容物中表達。

在家蠶精子發生過程中，精原細胞可以分化為有核精子與無核精子。在無核精子的輔助下，有核精子與家蠶卵結合形成受精卵(Sahara and Kawamura, 2002; Pereira and Santos, 2015)。家蠶精子的二型分化具有嚴格的時期特異性，即有核精子在幼蟲階段開始發生，而無核精子的發生則要到預蛹期(PP)才能開始，這些過程受到不同基因的嚴格調控(Sahara and Kawamura, 2002)。本研究分析了BmFoxL2-1和BmFoxL2-2在不同發育階段家蠶精巢中的表達變化，結果發現BmFoxL2-1在幼蟲精巢中的表達水平較低，在預蛹期開始上升；而BmFoxL2-2的表達在5齡幼蟲末期達到高峰后開始下降，到了預蛹期后逐漸上升。這些表達變化與二型精子發生的時期相近，推測兩個BmFoxL2亞族基因的功能可能與家蠶精子的二型分化相關。

精子發生的過程是一個復雜且精細的過程，在黑腹果蠅中，生殖干細胞通過增殖與分化首先形成性原細胞。一個性原細胞經歷有絲分裂和減數分裂后形成64個精細胞，這些過程受到Vasa、Nanos以及細胞周期相關基因的調控(Fabian and Brill, 2012; Fairchildetal., 2016)。研究顯示，與黑腹果蠅相似，家蠶生殖干細胞增殖與分化的過程同樣需要Vasa和細胞周期等基因的參與(賀真等, 2020)。本研究的結果顯示，在Bm12細胞中過表達BmFoxL2-2蛋白可以顯著上調細胞周期基因BmCyclinA、BmCyclinB、BmCyclinB3和BmCyclinA，以及生殖干細胞發育關鍵基因BmNanos和BmVasa的表達(圖5)。另外，過表達BmFoxL2-1蛋白也可以上調BmCyclinA和BmNanos的表達，但效果不如BmFoxL2-2的顯著(圖4)。由此推測家蠶FoxL2亞族蛋白都可以參與精子發生過程。但由于BmFoxL2-1和BmFoxL2-2蛋白的理化性質和亞細胞定位均存在差異(圖2)，導致了兩者對精子發生相關基因的表達調控存在差異。

綜上，本研究結果說明BmFoxL2亞族蛋白的功能與精子發生過程相關。以上結果完善了FoxL2亞族基因在雄性生殖系統發育中的功能，同時也為研發通過提高精子質量優化家蠶性狀的技術提供理論依據。