肝母細胞瘤Wnt/β-catenin信號通路研究進展

俞星雨 顧松 李云潔 喬夢媛 岑宇航

上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心普外科,上海 200127

肝母細胞瘤(hepatoblastoma,HB)是兒童最常見的肝臟惡性腫瘤，占兒童惡性腫瘤總數的1%，常見于3歲以下患兒。作為胚胎源性腫瘤，HB由胚胎發生過程中出現惡性轉化的肝細胞前體細胞產生。Wnt/β-catenin信號通路異常是肝母細胞瘤發生的主要原因，肝母細胞瘤也是人類癌癥中CTNNB1(編碼β-catenin的基因)突變率最高的腫瘤之一[1]。目前手術切除和以順鉑為基礎的化療是HB治療的主要手段，但仍有20%的病例預后不良。因此，尋找合適的靶點對HB進行靶向治療具有重大的研究意義。本文旨在敘述Wnt/β-catenin信號通路在肝母細胞瘤中的研究進展，并探討Wnt/β-catenin信號通路在HB鑒別診斷、治療和預后中的應用前景。

一、Wnt/β-catenin信號通路

Wnt通路主要由四個部分組成，分別是細胞外的Wnt配體蛋白、細胞膜上的受體、胞漿內的信號轉導部分和核內的轉錄調控部分，可分為依賴β-catenin的經典途徑和不依賴β-catenin的非經典途徑[2-3]。同時Wnt通路還可受其他分子的調控，與其他通路相互作用。在成熟的健康肝臟中，Wnt途徑大多是無活性的，但在細胞更新、再生的過程中以及某些病理狀況下可被重新激活[4]。

經典Wnt途徑以β-catenin為核心分子，在調節細胞增殖、存活和分化中起重要作用。正常Wnt/β-catenin信號在成年肝組織中的失活是通過破壞復合物和拮抗劑的平衡調節來實現的。但在異常情況下，β-catenin無法被降解，從而在細胞質中積累，并轉移到細胞核與轉錄因子結合，打開下游靶基因的轉錄，誘導細胞增殖，促進腫瘤的發生[5]。

經典的Wnt通路還可與其他分子和通路相互作用，如磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)可與Wnt相互作用，激活經典的Wnt/β-catenin信號通路[6]。而神經激肽-1受體(NK-1 receptor,NK-1R)的阻斷則會抑制經典Wnt途徑，HB細胞生長速度也隨之下降，因此P物質(substance P,SP)/NK1R復合物是包括HB在內的多種腫瘤的抗癌靶點[7]。除此之外，核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、轉化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)等也被認為與Wnt/β-catenin信號通路存在相互作用[8]。這些通路和分子都為HB的靶向治療提供了可能性。

非經典Wnt途徑是β-catenin非依賴性的Wnt通路，它更多地與分化、細胞極性和遷移相關，因其依賴的核心分子不同而分為許多不同的種類，調控不同的生理過程。其中最典型的是細胞平面極性通路(Wnt/polarity通路)，它可在胚胎發育階段調控細胞骨架重排，參與原腸胚的形成[9]。

以上經典和非經典通路并不是獨立工作、互不打擾的，而是相互交叉、相互影響，在胚胎發育、干細胞生長、組織穩態等復雜過程中共同扮演重要角色。

二、Wnt/β-catenin信號通路異常促進HB發生發展

大量研究已經證實，Wnt/β-catenin信號通路異常與HB的發生發展具有密切的關系。在正常肝組織中，Wnt/β-catenin信號通路一般處于非活性狀態，僅在肝臟發育、細胞分化、內環境穩定和損傷修復等過程中發揮至關重要的作用。而基因突變、遺傳表觀修飾的異常以及部分蛋白、分子的異常表達都會導致Wnt/β-catenin信號通路的異常激活，進一步影響HB的發生發展。

(一)Wnt/β-catenin信號通路相關基因的突變

CTNNB1基因突變是Wnt/β-catenin信號通路異常的常見原因。該基因編碼β-catenin蛋白，其外顯子3的框內缺失或錯義突變會阻止β-catenin的磷酸化，進而阻礙其降解，導致β-catenin在細胞質和細胞核中聚積[10]。細胞核中積累的β-catenin與T細胞因子/淋巴樣增強因子(T-cell factor/lymphoid enhancer-binding factor,TCF/LEF)家族的轉錄因子結合，招募共激活因子打開下游靶基因的轉錄，誘導細胞增殖，促進肝母細胞瘤的發生[5]。根據Stefania等[11]的研究，CTNNB1在不同HB亞型中的突變存在差異。在純胎兒型HB中為CTNNB1的大缺失，包括第3和第4外顯子的一部分，而在胚胎型HB中則局限于第3外顯子的點突變。整體而言，60%～80%的HB可發生CTNNB1突變。

(二)遺傳表觀修飾異常

遺傳表觀修飾的異常是導致Wnt/β-catenin信號通路異常激活的重要原因。近年來表觀遺傳調節(包括DNA甲基化、組蛋白乙?；?、RNA甲基化等修飾)作為癌癥治療的新靶點受到關注。在HB中，甲基化修飾的異常已得到廣泛研究，而組蛋白乙?；揎椀南嚓P研究仍較為缺乏。

目前研究發現，HB中的基因顯示出整體低甲基化，伴有特定腫瘤抑制基因 (specific tumor suppressor genes,TSGs) 的高甲基化[12]。例如APC基因在HB中由于DNA的高甲基化失去功能，因此β-catenin無法與APC蛋白結合而降解，過量的β-catenin蛋白在細胞核聚積，進而通過Wnt/β-catenin信號通路促進HB的發生發展[13]。Carrillo-Reixach等[14]的研究通過不同程度的DNA低甲基化和CpG島高甲基化鑒定出2個表觀基因組簇(Epi-CA、Epi-CB)，定義了第一個HB分子風險分層(molecular risk stratification of HB,MRS-HB)，改進了目前的臨床風險分層方法。

RNA編輯的失調也是HB發生發展的重要原因，例如信使RNA中N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修飾的異常。經m6A-seq分析可得，與Wnt/β-catenin信號通路相關的基因CTNNB1、CCND1和NKD1中m6A甲基化增加。研究認為HB中高表達的甲基轉移酶樣蛋白3(methyltransferase-like 3,METTL3)通過調節m6A修飾激活CTNNB1，使Wnt/β-catenin信號升高，促進腫瘤發展[15]。

(三)Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白、分子的異常表達

癌蛋白Myc是公認的Wnt/β-catenin信號通路的直接靶標之一，在超過80%的HB患者中都能檢測到強c-Myc免疫反應性[10]。使用n-Myc抑制劑可引起HB細胞紡錘體紊亂和(或)凋亡，這為靶向治療提供了可能[16]。

轉錄因子YAP是Hippo通路的主要下游效應分子，與β-catenin協同誘導HB形成[17]。根據核定位發現YAP在大約80%的人類HB樣本中被激活，YAP/TAZ的活化上調可促進HB的形成[16,18]。而NFE2L2/NRF2轉錄因子的突變或過表達可加速由Wnt/β-catenin和Hippo通路突變產生的肝母細胞瘤的生長，以及腫瘤相關的囊腫和壞死[19]。這也為HB更精細的分類和治療設計提供了依據。

大腦表達的X連鎖蛋白1(brain-expressed X-linked protein 1,BEX1)與人類 runt相關轉錄因子3(human runt-related transcription factor 3,RUNX3)建立相互作用來阻斷其對β-catenin轉錄的抑制，從而激活Wnt/β-catenin信號通路，并在HB中維持干性[20]。因此，BEX1可以成為HB有價值的治療靶點。

三、Wnt/β-catenin通路在HB臨床中的應用

(一)Wnt/β-catenin信號通路與HB鑒別診斷

目前，HB主要依靠影像學和病理學檢查進行診斷，其中甲胎蛋白是最常使用的指標，也可聯合β-catenin、胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor-2,IGF-2)等生物標志物以及部分miRNAs的表達水平幫助明確診斷。

β-catenin是鑒別肝母細胞瘤亞型的重要依據之一。肝母細胞瘤根據組織病理學特征分為上皮型和混合上皮間質亞型，定義為C1和C2[21]。在這兩種亞型中，β-catenin突變率相似，但定位有差異，在C1型腫瘤中靠近質膜，而在C2型中主要位于細胞核[22]。

Huang等[23]對18個未處理的HB樣本和22個新輔助化療后的HB樣本進行檢測，發現 Wnt/β-catenin信號通路的下游靶標谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)可作為新型免疫組織化學標記物用于肝臟腫瘤的鑒別診斷，是肝臟腫瘤中Wnt/β-catenin信號通路活化的標志。HB中常見核β-catenin染色和彌漫性GS染色，該方法對化療后殘留的腫瘤細胞鑒定效果更好[23]。

(二)Wnt/β-catenin信號通路與HB靶向治療

針對Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑大致可分為生物抑制劑(單克隆抗體和重組核酸)和小分子化合物(常規藥物和新型藥物)兩類。生物抑制劑包括抗Wnt抗體、β-catenin siRNA等。使用抗Wnt抗體可誘導過表達Wnt-1的腫瘤細胞凋亡，抑制小鼠腫瘤生成，具有特異性和選擇性[24]。而β-catenin siRNA可以特異性抑制β-catenin的表達，降低β-catenin的下游信號活性。一些miRNA也可通過抑制β-catenin表達來滅活Wnt/β-catenin信號通路，延長G0/G1期并縮短S期，抑制體外腫瘤細胞的增殖[25]。

乳腺癌雌激素調控基因1(growth regulating estrogen receptor binding 1,GREB1)被發現可以作為Wnt/β-catenin信號通路的靶基因，對HB的發生發展具有重要意義，可能成為治療HB的分子靶點[26]。GREB1作為核蛋白，可針對性使用核酸來抑制。GREB1反義寡核苷酸(GREB 1 antisense oligonucleotides,GREB1 ASOs)抑制GREB1合成，在小鼠模型中可抑制HB樣腫瘤生成，可以作為HB靶向治療的候選藥物。

具有Wnt/β-catenin信號通路抑制作用的化合物有塞來昔布、伊馬替尼和黃酮類藥物等。塞來昔布可將β-catenin釋放到細胞質，并靶向糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,GSK -3)磷酸化，同時損害酪氨酸激酶受體的自磷酸化，導致Wnt/β-catenin信號傳導受抑制[27]。伊馬替尼是一種酪氨酸激酶抑制劑，可間接抑制β-catenin酪氨酸磷酸化[24]。而對于黃酮類藥物，研究證明天然存在的類黃酮表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)可誘導腫瘤抑制因子SFRP1重新表達，并下調Wnt靶基因從而抑制Wnt/β-catenin信號傳導[28]。

目前來看，HB的靶向治療大多停留在實驗室研究階段，需要進一步探索。而作為較為明確的HB形成機制，Wnt/β-catenin信號通路可作為靶向治療的重點研究方向。

(三)Wnt/β-catenin信號通路與HB預后

目前已知甲胎蛋白表達水平與HB預后、治療和復發有一定的相關性[29]。關于Wnt/β-catenin信號通路對HB臨床預后意義的實驗研究較為缺乏，但已有研究表明β-catenin的表達及細胞核定位對HB預后具有一定的預測意義，其在兩種HB亞型中的定位差異導致了下游不同靶標的激活，從而影響兩種不同亞型HB的預后[30]。

綜上所述，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活會導致β-catenin在細胞核中蓄積，從而促進細胞增殖，這一現象是HB的主要標志。Wnt/β-catenin信號通路中相關基因的突變、表觀修飾的改變以及相關蛋白、分子的異常表達可影響HB的發生發展。目前已有針對Wnt/β-catenin信號通路及其相關通路中一些靶點的HB治療藥物，并在細胞水平或動物模型中進行了研究，但尚未在HB臨床治療中推廣應用。Wnt/β-catenin信號通路在HB臨床預后中的作用還有待進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明文獻檢索為俞星雨、喬夢媛、李云潔、岑宇航，觀點梳理為俞星雨，論文撰寫為俞星雨、喬夢媛、李云潔、岑宇航，論文審校為顧松