Box-Behnken響應面法結合熵權法優化千金子二萜醇酯類成分的閃式提取工藝

王佩華，張桂梅，王慧楠，楊子燁，陳夢雨，姜明瑞，岳珠珠，王志成，張婧秋，王英姿

(北京中醫藥大學中藥學院，北京102488)

千金子為大戟科植物續隨子(EuphorbialathyrisL.)的干燥成熟種子[1]，含有脂肪油、二萜、甾醇、黃酮、香豆素、揮發油等多種化學成分[2]。二萜醇酯類化合物是其主要活性成分，具有瀉下逐水、祛斑美白、抗炎鎮痛、抗腫瘤等多種藥理作用，其中千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3是含量相對較高且具有顯著藥理活性的二萜醇酯類成分[3-4]。千金子二萜醇酯類成分的傳統提取方法主要有回流提取法、冷浸提取法和超聲提取法等，這些方法存在有效成分富集效率低、試劑用量大、耗時繁瑣等缺點[5-7]。而閃式提取法具有提取快速、無需加熱、有效成分損失少等優點，廣泛適用于中藥根、莖、葉、花、果實、種子等的提取[8-9]，目前未見閃式提取千金子二萜醇酯類成分的報道。

響應面法是一種綜合實驗設計和數學建模的優化方法，將因素與指標的相互關系用多元二次回歸多項式方程近似擬合，可有效指導工藝參數的優化[10-11]。熵權法是一種確定指標權重的客觀賦權法，可用于確定多指標評價系統中各指標權重[12-13]。2020版《中華人民共和國藥典》對千金子中千金子甾醇(即千金子素L1)的含量進行了規定[1]，因此，作者選用千金子中主要的二萜醇酯類成分千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3為指標成分，以料液比(g∶mL，下同)、提取時間、提取電壓為考察因素，通過Box-Behnken響應面法結合熵權法對千金子二萜醇酯類成分的閃式提取工藝進行優化，以期為千金子二萜醇酯類成分的提取提供新的思路。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

千金子藥材，購自安徽亳州，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定為大戟科植物續隨子(EuphorbialathyrisL.)的干燥成熟種子。

千金子素L1對照品(批號111789-200901)、千金子素L2對照品(批號111790-200901)、千金子素L3對照品(批號111791-200901)，純度均大于98%，中國藥品生物制品檢定所；甲醇，質譜純，Fisher公司；乙醇，化學純，北京虹湖聯合化工產品有限公司。

閃式提取器，北京金鼎科技發展有限公司；高效液相色譜儀，美國Thermo Fisher；KH7200DB型數控超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；BSI10型萬分之一電子天平，德國Sartorius。

1.2 千金子二萜醇酯類成分的提取

精密稱取一定量的千金子加入閃式提取器中，在一定條件下提取，減壓抽濾，收集濾液，轉移至1 000 mL容量瓶中定容至刻度，即得提取液。

1.3 千金子二萜醇酯類成分含量的測定

1.3.1 對照溶液的配制

分別精密稱取千金子素L1對照品5.13 mg、千金子素L2對照品5.12 mg、千金子素L3對照品5.08 mg，加甲醇溶解并定容至5 mL容量瓶中，搖勻，即得1.026 mg·mL-1千金子素L1、1.024 mg·mL-1千金子素L2、1.016 mg·mL-1千金子素L3的對照儲備液，臨用前用甲醇稀釋成相應濃度的對照溶液。

1.3.2 供試溶液的配制

精密量取提取液0.5 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾后，取續濾液作為供試溶液。

1.3.3 色譜條件

ODS-3 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫程序：0～5 min，75%A；5～35 min，75%～70%A；35～45 min，70%～85%A；45～60 min，85%～90%A；60～65 min，90%～75%A；檢測波長275 nm；流速1 mL·min-1；柱溫25 ℃；進樣量20 μL。

各對照溶液及供試溶液的HPLC圖譜如圖1所示。

圖1 千金子素L1對照溶液(a)、千金子素L2對照溶液(b)、千金子素L3對照溶液(c)及供試溶液(d)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC spectra of standard solution of euphorbia factor L1(a),euphorbia factor L2(b) and euphorbia factor L3(c)，and test solution(d)

1.4 響應面實驗

根據前期預實驗及單因素實驗結果，使用Design-Expert 10.0軟件進行Box-Behnken設計，以料液比、提取時間、提取電壓為考察因素，以提取液中千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3通過熵權法計算的綜合評分(Y)為響應值。響應面實驗的因素與水平如表1所示。

表1 響應面實驗的因素與水平Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

1.5 綜合評分的計算

采用熵權法計算指標的權重，先將各指標的數據進行標準化處理，根據公式(1)計算第j個指標的信息熵Ej，根據公式(2)計算j指標的權重Wj，再根據公式(3)計算j指標的綜合評分Y。

(1)

(2)

Y=千金子素L1的提取率×千金子素L1的權重+千金子素L2的提取率×千金子素L2的權重+千金子素L3的提取率×千金子素L3的權重

(3)

2 結果與討論

2.1 方法學考察

2.1.1 線性關系

分別精密移取適量各對照儲備液，加甲醇稀釋成6個濃度的對照溶液，按1.3.3色譜條件進樣分析。以對照溶液濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線，擬合結果如表2所示。

表2 千金子素L1、千金子素L2 、千金子素L3的線性關系Tab.2 Linear relationships of euphorbia factor L1,euphorbia factor L2，and euphorbia factor L3

由表2可知，各成分在相應濃度范圍內線性關系良好。

2.1.2 精密度

精密移取千金子素L1對照儲備液1.500 mL、千金子素L2對照儲備液0.625 mL、千金子素L3對照儲備液1.250 mL于5 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得0.308 mg·mL-1千金子素L1、0.128 mg·mL-1千金子素L2、0.254 mg·mL-1千金子素L3的混合對照溶液，按1.3.3色譜條件連續進樣6次，測得千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3峰面積的RSD值分別為0.26%、1.20%、1.08%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復性

取同一供試溶液6份，按1.3.3色譜條件進樣分析，測得千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3的平均提取率分別為0.49%、0.19%、0.43%，RSD值分別為1.90%、2.55%、1.23%，表明該方法重復性良好。

2.1.4 穩定性

取同一供試溶液，分別室溫放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后，按1.3.3色譜條件進樣分析，測得千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3峰面積的RSD值分別為0.30%、0.29%、0.20%，表明供試溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.5 加標回收率

取已知含量的供試溶液6份各0.25 mL，按千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3含量的100%水平精密加入混合對照溶液0.25 mL，按1.3.2方法制備供試溶液，按1.3.3色譜條件進樣分析，測得千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3的平均加標回收率分別為103.22%、98.33%、97.76%，RSD值分別為1.22%、0.75%、1.14%，表明該方法準確度良好。

2.2 響應面實驗結果

2.2.1 Box-Behnken響應面實驗設計及結果(表3)

表3 Box-Behnken響應面實驗設計及結果Tab.3 Design and results of Box-Behnken response surface methodologies

2.2.2 回歸模型方程與方差分析

通過Design-Expert 10.0軟件對表3中的綜合評分進行多元二次回歸擬合，得回歸模型方程：Y=-5.36757+0.20140A+0.027576B+0.066837C+0.00741401AB-0.000814960AC-0.000461503BC-0.00409654A2-0.013082B2-0.000210412C2。對回歸模型進行方差分析，結果如表4所示。

表4 回歸模型的方差分析Tab.4 Variance analysis of regression model

2.2.3 響應面交互作用分析

利用Design-Expert 10.0軟件根據模型繪制各因素交互作用對綜合評分影響的響應面圖與等高線圖，如圖2所示。

響應面和等高線可以直觀形象地反映各因素的交互作用，響應面越陡峭，說明兩因素的交互作用越顯著[15]；等高線的形狀越趨于橢圓說明交互作用越顯著，越趨于圓形說明交互作用越不顯著[16]。由圖2可知，料液比與提取電壓的響應面最陡峭，且等高線呈橢圓形，表明料液比與提取電壓的交互作用對千金子二萜醇酯類成分提取率的影響最顯著；其次是料液比與提取時間的響應面較陡峭，表明料液比與提取時間的交互作用對千金子二萜醇酯類成分提取率有一定程度的影響；而提取時間與提取電壓的響應面最平緩，表明提取時間與提取電壓的交互作用對千金子二萜醇酯類成分提取率的影響不顯著。

圖2 各因素交互作用對綜合評分影響的響應面圖與等高線圖Fig.2 Response surface plots and contour plots for effect of interaction between each factor on comprehensive score

根據Design-Expert 10.0軟件優化分析得到千金子二萜醇酯類成分的最佳閃式提取工藝為：料液比1∶14.021(g∶mL)、提取時間2.5 min、提取電壓128.932 V，此條件下，3種二萜醇酯類成分提取率綜合評分的預測值為0.396。

2.2.4 最佳工藝的驗證實驗

由于儀器精度等條件的限制，將最佳閃式提取工藝調整為：料液比1∶14(g∶mL)、提取時間2.5 min、提取電壓130 V，進行3次驗證實驗，得到3種二萜醇酯類成分提取率綜合評分的平均值為0.370(RSD=0.412%)，證明該模型選擇合理，實驗結果理想。

3 結論

采用Box-Behnken響應面法結合熵權法對千金子二萜醇酯類成分的閃式提取工藝進行優化，確定最佳提取工藝為：料液比1∶14(g∶mL)、提取時間2.5 min、提取電壓130 V，在此條件下，3種二萜醇酯類成分提取率的綜合評分為0.370，與模擬預測值(0.396)接近。閃式提取方法簡便、節能、省時，可應用于千金子主要二萜醇酯類成分的快速提取，對二萜醇酯類成分的深入研究及千金子的開發利用具有十分重要的意義。