基于網絡藥理學的四君子湯治療心肌肥厚的作用機制分析

張毅 黃雯 盧僖

摘要：目的：運用網絡藥理學的方法探索四君子湯治療心肌肥厚的作用機制。方法：通過TCMSP數據平臺，獲取四君子湯的活性成分及作用靶點;利用GeneCards和Disgent數據篩選出心肌肥厚疾病相關靶點，將兩者取交集，導入Cytoscape3.8.0軟件構建藥物-疾病-靶點相互作用網絡;利用String11.5獲得PPI蛋白互作關系網絡;使用R語言進行GO、KEGG基因富集分析，獲得四君子湯干預心肌肥厚的潛在信號通路。結果：篩選出四君子湯有效活性成分136個，作用靶點254個;心肌肥厚疾病相關靶點4015個;四君子湯與心肌肥厚共同作用靶點160個;PPI關系網絡分析后得到TNF，IL-1β和IL-6等關鍵靶點;GO基因富集分析主要富集在藥物反應，細胞因子等相關的生物過程;KEGG通路分析主要集中在PI3K-AKT，TNF，MAPK以及HIF-1信號通路上。結論：四君子湯可能通過靶向TNF，IL-1β和IL-6等核心靶點達到干預心肌肥厚的作用，其機制與調控炎癥信號途徑，抑制炎癥反應激活有關。

關鍵詞：網絡藥理學;四君子湯;心肌肥厚

【中圖分類號】R542.2 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2022）08--02

心肌肥厚（hypertrophiccardiomyopathy）是心肌組織超負荷的一種代償性反應，主要特征為心肌細胞體積增大，蛋白合成增加以及間質成分改變，是引起多種心血管疾病如心率失常，心衰和心源性猝死發病率和病死率升高的獨立危險因素之一[1]。

四君子湯來源于宋《太平惠民和劑局方》，為益氣，健脾，化痰的代表方劑，由人參、白術、茯苓、甘草組成，具有補氣，益氣健脾之功效。研究表明，四君子湯可以改善慢性左心衰模型大鼠的心功能，緩解心力衰竭患者的臨床癥狀，提高心功能、延緩心室重構，改善生活質量及預后[2]，但其治療心肌肥厚的有效活性成分及作用機制仍不清楚。

網絡藥理學是以網絡信息為平臺，分析藥物-疾病-靶點之間“多成分、多靶點、多途徑”協同作用關系的新興學科。其整體性和系統性以及注重藥物與靶點以及疾病相互作用的特點與中醫藥學的研究理念不謀而合。為了明確四君子湯治療心肌肥厚的作用機制，本文基于網絡藥理學研究方法對四君子湯治療心肌肥厚的生物學物質基礎及藥效機制進行預測，并通過分子對接對藥物的主要的活性成分和潛在靶點間的相互作用進行驗證，初步闡明四君子湯治療心肌肥厚的作用機制。

1.材料與方法

1.1四君子湯活性成分收集與篩選

四君子湯包含人參、白術、茯苓、甘草四味中藥，將這四味中藥分別以中文名稱作為關鍵詞，輸入中藥系統藥理學數據庫平臺TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）進行檢索以其參數中的口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為限制條件進行篩選，篩選后獲得有效化學成分作為四君子湯的活性成分。再根據相應的活性成分尋找與之對應的靶點。

1.2四君子湯中活性成分潛在靶點與心肌肥厚的疾病靶點預測

基于TCMSP數據庫平臺得到的四君子湯的成分靶點，利用Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）將相應的蛋白質名稱轉化為Genesymbol。利用GeneCardsandDisgent數據庫（http：//www.genecards.org/和https：//www.disgenet.org/），以“hypertrophiccardiomyopathy”為關鍵詞搜索，得到心肌肥厚相關的靶點，在刪除其重復的靶點后，利用韋恩圖將藥物靶點與疾病靶點進行求交集作為“Hub”靶點，即四君子湯治療心肌肥厚的潛在作用靶點。

1.3“藥物-成分-靶點-疾病”網絡構建與分析

為了明確藥物是通過哪些成分及靶點作用于心肌肥厚的，我們利用Cytoscape3.8.0軟件進行“藥物-成分-靶點-疾病”網絡可視化的構建。

1.4靶蛋白相互作用網絡圖（PPI）構建

將四君子湯治療心肌肥厚的潛在作用靶點導入STRING11.5數據庫（http：//string-db.org），并將其物種限定為“homosapiens”，設置置信度≥0.4，同時去除孤立的靶點蛋白，得到蛋白與蛋白相互作用網絡。將該數據導入Cytoscape3.7.2軟件進行拓撲學分析，通過NetworkAnalyzer工具進行網絡分析從而獲得Degree值，從而確定該網絡中的核心基因。

1.5GO功能及KEGG通路富集分析

將四君子湯對心肌肥厚的潛在作用靶標基因利用R語言Clusterprofiler程序進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，設定P≤0.05得到相應的生物過程（BP）、細胞組成（CC）、分子功能（MF）以及KEGG信號通路。利用R語言pathview功能將GO富集的前12條條目及前20條信號通路制成氣泡圖。

2.結果

2.1四君子湯候選活性成分及候選靶標蛋白篩選

將人參、白術、茯苓和甘草作為關鍵詞分別輸入TCMSP數據庫進行檢索后，根據OB≥30%和DL≥0.18的候選化合物共得到136個成分，其中人參22個、白術7個、茯苓15個、甘草92個。然后將對應的化合物分子查詢相關蛋白，將所有蛋白全稱經Uniprot數據庫標準化。在刪除重復靶點后，共計獲得254個靶點蛋白。這表明四君子湯是通過多靶點的協同作用發揮功能的。

2.2四君子湯活性成分治療心肌肥厚的潛在靶點蛋白信息

在GeneCard和Disgenet數據庫檢索關鍵詞“hypertrophiccardiomyopathy”，結果得到相關基因共4015個。將4015個疾病相關基因和254個藥物潛在靶點進行映射，獲取兩者之間的交集基因160個（圖1 A），進一步通過Cytoscape3.8.0軟件構建四君子湯-靶點-心肌肥厚關系圖（圖1B），提示四君子湯對心肌肥厚的治療作用可能與這160個交集靶點有關。

2.3蛋白質相互作用關系分析（PPI）

我們進一步將得到的160個共同作用靶點上傳至String11.5數據庫中，得到蛋白質互作網絡信息，通過將PPI網絡導入Cytoscape3.7.2軟件中進行網絡分析，再按“degree”值進行排序，得到蛋白質相互作用關系網絡圖（圖2A）。該網絡由160個節點，3318條邊組成，其中degree值前10的蛋白靶點包括VEGFA，CASP3，HIF1A，AKT1，EGFR，TP53，JUN，TNF，IL-1β和IL-6（圖2B），提示它們可能是四君子湯作用于心肌肥厚的核心靶點。

2.4靶蛋白的富集分析

2.4.1GO富集分析

為了進一步明確160個靶點蛋白的生物學功能，將藥物-疾病的共同靶點輸入R語言Clusterprofiler程序中，分別進行分子功能（GOmolecularfunctions）、生物途徑功能（GObiologicalprocesses）和細胞成分（GOcellularcomponents）三個方面的GO富集分析，根據Count值由大到小，同時滿足p<0.05進行排序，分別在BP、MF和CC中選出排名前12的條目制作條形圖。結果顯示四君子湯與心肌肥厚交集基因在生物過程BP顯著富集在RNA轉錄，藥物反應，細胞凋亡和增殖等（圖3）。分子功能MF主要富集在蛋白結合，酶結合，細胞因子活性等。細胞組成CC主要富集在細胞外液，質膜，細胞液等中。

將藥物-疾病共同作用的160個靶點輸入R語言Clusterprofiler程序中KEGG通路富集分析得到163條通路，選取P值小和Count值較大的前20的通路，按GeneRatio大小順序排列進行可視化。由KEGG富集分析結果可知，四君子湯治療心肌肥厚的作用途徑與信號通路是復雜多樣的，最有可能與細胞增殖PI3K-AKT，炎癥相關的TNF，代謝相關的MAPK以及低氧應激HIF-1信號通路相關（圖4）。

四君子湯是益氣健脾的基礎方，其組方中包含人參，茯苓，白術，炙甘草四味中藥。方中人參甘溫扶脾養胃，大補元氣為君藥，白術苦溫，燥濕健脾為臣藥，茯苓甘淡，健脾祛濕為佐藥，甘草甘溫，益氣和中，調和諸藥，為佐使之藥[3]。研究篩選出四君子湯有效活性成分136個，可作用于心肌肥厚的作用靶點160個，這與中藥復方制劑多成分、多靶點干預疾病的特性相吻合。心肌肥厚的發生與機械性、神經體液、內分泌、交感神經系統活性、細胞因子、一氧化氮以及腸道菌群穩態等多種因素相關提示調節內分泌或者是腸道穩態能是干預心肌肥厚的重要方向之一[4]。有研究發現，四君子湯能夠通過調節腸道菌群失衡改善心肌線粒體功能等方面，對心肌肥厚發揮一定的治療作用[5]。由此可見，四君子湯治療心肌肥厚的作用機制可能與調節腸道微生態和提高線粒體活性有關。

本研究對四君子湯治療心肌肥厚的有效成分進行篩選，發現排名靠前的是山奈酚、木犀草素和槲皮素等核心化合物，提示這可能是四君子湯干預心肌肥厚的有效核心成分，而這些藥物都與抗炎和抗氧化有關[6]。進一步的研究發現，在君子湯干預心肌肥厚的靶點蛋白互作網絡中發現炎癥細胞因子白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）和低氧應激HIF-1參與其中，KEGG通路富集分析結果同樣也提示四君子湯治療心肌肥厚的信號途徑與TNF和HIF-1通路有關。GO功能富集分析結果表明共同作用靶點的生物過程主要涉及到細胞因子等。由此可見，四君子湯治療的心肌肥厚的分子靶點與作用機制可能與調控炎癥信號途徑，抑制炎癥反應激活有關。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學初步分析了四君子湯治療心肌肥厚的作用機制。結果發現四君子湯可能通過IL6、IL-1β和HIF-1等靶點起作用，通過對細胞增殖凋亡和細胞因子代謝的反應等生物過程調控，以及炎癥相關的TNF和低氧應激HIF-1等信號通路發揮干預心肌肥厚的作用。上述結果為探索四君子湯治療心肌肥厚的作用機制研究提供理論支撐與科學依據。

參考文獻：

[1]Heineke，J.andJ.D.Molkentin，Regulationofcardiachypertrophybyintracellularsignallingpathways[J].NatRevMolCellBiol，2006.7（8）：589-600.

[2]邱俊，劉友章，王超等.從四君子湯對慢性心衰大鼠心功能的影響探討“心脾相關[J].時珍國醫國藥，2013.24（10）：2564-2566.

[3]劉琳，李巖.四君子湯對胃腸道藥理作用的研究進展[J].醫學綜述，2019.25：990-994.

[4]Nakamura，M.andJ.Sadoshima，Mechanismsofphysiologicalandpathologicalcardiachypertrophy[J].NatRevCardiol，2018.15（7）：387-407.

[5]盧永康，陳窕圓，莊賢勉等.四君子湯調節大鼠腸道菌群改善心肌肥厚誘導心力衰竭的研究[J].現代中藥研究與實踐，2020.34（5）：29-33.

[6]He，Y.Q.，etal.，Naturalproductderivedphytochemicalsinmanagingacutelunginjurybymultiplemechanisms[J].PharmacolRes，2021.163：105224.