基于網絡藥理學和分子對接探討柴胡大黃藥對防治膽石癥的作用機制

高云霄　李澤　楊柳　郭榆西　郭彤　李博林　楊倩

摘要目的：基于網絡藥理學和分子對接技術初步探討柴胡大黃藥對治療膽石癥的有效物質基礎及作用機制。方法：借助中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）檢索柴胡、大黃的有效活性成分及潛在作用靶點;通過GeneCards、CTD、TTD數據庫得出膽石癥相關作用靶點。利用Cytoscape 3.7.2軟件及STRING數據庫構造藥物與疾病共同靶蛋白質蛋白質相互作用（PPI）網絡、中藥成分疾病靶點PPI網絡。采用DAVID 6.8數據庫及R 4.0.3軟件對藥物與疾病共同靶點進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析。運用AutoDockTools 1.5.6軟件進行分子對接驗證。結果：經過篩選柴胡大黃藥對共得出有效活性成分23個，成分靶點91，和936個膽石癥相關靶點取交集共得到35個共同靶點。通過GO分析顯示核心靶點具有一氧化氮生物合成過程的正調控、細胞對脂多糖的反應、平滑肌細胞增殖的正調控等生物學過程。KEGG通路分析發現核心靶點可能和癌癥信號通路、HIF1信號通路、TNF信號通路等相關。分子對接結果提示豆甾醇與TNF靶點有強烈的結合活性（-7.79 kcal/mol），豆甾醇與JUN靶點有較好的結合活性（-5.71 kcal/mol），豆甾醇與TP53靶點有一定的結合活性（-4.34 kcal/mol）。結論：柴胡大黃藥對中的豆甾醇、槲皮素、山柰酚等有效活性成分可能通過TNF、JUN、TP53等核心靶點調控炎癥介質及細胞缺氧反應信號轉導通路聯合治療膽石癥。

關鍵詞網絡藥理學;分子對接;柴胡大黃;膽石癥;作用機制

Study on the Mechanism of Bupleurumrhubarb in the Prevention and Treatment

of Cholelithiasis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

GAO Yunxiao，LI Ze1，YANG Liu， GUO Yuxi， GUO Tong， LI Bolin， YANG Qian

（1 Graduate School of Hebei University of Chinese Medicine，Shijiazhuang 050090，China; 2 The First Affiliated

Hospital of Hebei University of Chinese Medicine，Shijiazhuang 050011，China）

AbstractObjective：To explore the effective material basis and mechanism of bupleurumrhubarb in the treatment of cholelithiasis based on network pharmacology and molecular docking technology.Methods：TCMSP database was used to retrieve the active ingredients and potential targets of bupleuri and radix; GeneCards，CTD and TTD databases were used to find the targets related to cholelithiasis.The interaction networks of PPI and Chinese medicinecomponentsdiseasetarget were constructed with Cytoscape 3.7.2 software and STRING database.DAVID 6.8 database and R 4.0.3 software were used for enrichment analysis of GO and KEGG on mutual targets of drug and disease.AutoDockTools 1.5.6 software was used to verify molecular docking.Results：A total of 23 major active compounds and 91 component targets were screened from the bupleurumrhubarb pair，and 35 common targets were obtained by crossing 936 cholelithiasis related targets.GO analysis showed that the core targets had biological processes，such as positive regulation of nitric oxide biosynthesis，cellular response to lipopolysaccharide，and positive regulation of smooth muscle cell proliferation.KEGG pathway analysis found that the core target may be related to cancer signaling pathway，HIF1 signaling pathway and TNF signaling pathway.Molecular docking results showed that stigmasterol had a strong binding activity to TNF（-7.79 kcal/mol），a good binding activity to Jun（-5.71 kcal/mol），and a mild binding activity to TP53（-4.34 kcal/mol）.Conclusion：Stigmasterol，quercetin，kaempferol and other active components in bupleurumrhubarb pair may regulate inflammatory cytokines and hypoxia signal transduction pathway through TNF，Jun，TP53 and other core targets in the treatment of cholelithiasis.

KeywordsNetwork pharmacology; Molecular docking; Bupleurumrhubarb; Cholelithiasis; Mechanism

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.04.002

膽石癥（Cholelithiasis）是指包括膽囊及膽管在內的膽道系統發生結石的疾病[1]?，F代醫學根據膽石的外觀形態和化學組成分為膽色素結石、膽固醇結石、混合型結石3大類;中醫學根據膽石癥不同的臨床表現，將其歸屬于“膽脹”“脅痛”“黃疸”等范疇。隨著人們生活水平的提高和膳食結構的變化，膽石癥的發病率逐年升高，且女性發病率明顯多于男性[2]。其病因和發病機制非常復雜，與膽囊收縮功能出現障礙[3]、膽固醇代謝異常[4]、膽囊炎癥反應和寄生蟲感染[5]等因素有關。目前，現代醫學在臨床上以手術治療為主，輔以控制飲食、抗炎殺菌、溶石排石、對癥治療等，臨床癥狀改善迅速，但易反復發作[12]。中醫注重辨證論治，以中藥湯劑、針灸等創傷性較小的方法進行治療，在改善遠期預后上具有一定的優勢[2]。

柴胡和大黃首載于《神農本草經》，柴胡屬傘形科植物，性苦、辛、微寒，歸心包絡、肝、三焦、膽經，具有和解少陽、退熱、疏肝解郁、升舉陽氣之功?，F代藥理作用機制發現，柴胡具有抗炎、鎮痛、護肝、抗抑郁等作用[6]。大黃屬蓼科植物，性苦、寒，入脾、胃、大腸、肝、心經，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經、利濕退黃之效[7]?，F代藥理研究表明，大黃具有抗炎抑菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫調節、保肝利膽、降脂等藥理作用[8]。目前，對于柴胡大黃治療膽石癥的作用機制研究甚少，本文擬通過網絡藥理學及分子對接方法探討柴胡大黃藥對中有效活性成分治療膽石癥的作用機制，以期為今后臨床應用及實驗驗證提供理論基礎。

1資料與方法

1.1數據來源中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine SystemsPharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmspsearch.php）;STRING數據庫（https：//stringdb.org/）;GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）;CTD數據庫（http：//ctdbase.org/）;TTD數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）;UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）;DAVID 6.8數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）;RCSB PDB數據庫（http：//www.rcsb.org/）;Venny 2.1.0軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）;Cytoscape 3.7.2軟件;PyMOL軟件;AutoDockTools 1.5.6軟件;R 4.0.3軟件（ggplot2 package）;Windows10操作系統。

1.2研究方法

1.2.1收集柴胡大黃藥對潛在活性成分及靶點以“柴胡”“大黃”為關鍵詞，在TCMSP系統進行柴胡、大黃2味中藥潛在活性成分的檢索，同時將口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）和類藥性（Drug Likeness，DL）的篩選條件分別設置為大于等于30和0.18進行篩選[9]。篩選出符合條件的活性成分及相關作用靶點，應用UniProt數據庫查詢相關靶點對應的人類基因名[10]。

1.2.2獲取膽石癥相關靶點以“Cholelithiasis”為關鍵詞在GeneCards數據庫、CTD數據庫和TTD數據庫查找膽石癥相關靶點，整合并刪除重復項。通過UniProt數據庫對得到的疾病靶點名稱進行規范化處理。同時應用Venny2.1.0繪圖軟件將柴胡大黃藥對成分靶點與膽石癥相關靶點取交集，得到藥物疾病共同靶點基因。

1.2.3柴胡大黃藥對與膽石癥的交集靶點蛋白質蛋白質相互作用（PPI）網絡利用STRING數據庫，獲取上述藥對與疾病共同靶點所對應的基因靶點，設置物種為“Homo Sapiens”，構建PPI網絡圖，然后將網絡圖以.tsv格式下載保存，最后在Cytoscape 3.7.2軟件中依據“Degree”和“combined_score”進行節點大小、線條粗細和顏色的調整，構建共同作用靶點PPI網絡[11]。

1.2.4中藥成分疾病靶點網絡構建中藥成分疾病靶點互作網絡通過Cytoscape 3.7.2軟件構建。中藥、成分、疾病、靶點以節點（Node）表示。中藥成分疾病靶點之間的相互聯系以邊（Edge）表示。

1.2.5富集分析利用DAVID 6.8數據庫對上述篩選出的柴胡大黃藥對和膽石癥的共同靶點基因進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析[12]。GO包括生物過程（Biological Process，BP），細胞組分（Cellular Component，CC），分子功能（Molecular Function，MF）。將分析得出的結果運用R語言分析軟件以條形圖和氣泡圖的形式表示。

1.2.6核心活性成分和關鍵靶點基因的分子對接核心活性成分的篩選以中藥成分疾病靶點網絡中節點度值大于平均度值為條件產生，且將其2D結構（mol2文件）從TCMSP中下載獲得，應用AutoDockTools 1.5.6軟件，將mol2格式的文件轉換為pdbqt格式文件保存[11]。關鍵靶蛋白的3D結構從RCSB PDB數據庫中下載獲得，隨后將其導入PyMOL軟件中進行剔除水分子和非活性配體的處理，最后將其載入AutoDockTools 1.5.6軟件進行加氫、加電荷處理，以pdbqt格式輸出[11]。運用AutoDock進行分子對接，其結果以結合能的高低作為靶點與化合物結合程度的評價標準，通常認為配體與受體的結合能越低，結合程度越高，相互間的作用力越強，對接結果越可靠[1314]。最后應用PyMOL軟件對結果進行可視化處理。

2結果

2.1“柴胡大黃”的活性成分和作用靶點經過TCMSP數據庫查詢，“柴胡大黃”藥對中活性成分共441個，包含柴胡349個，大黃92個，通過OB≥30%和DL≥0.18的篩選條件篩選后，得出藥對中所含活性成分共33個，其中柴胡17個，大黃16個。將藥對共有的33個活性成分在TCMSP的“Related Targets”中查詢成分相關靶點，相關靶點去重后共得到91個。其中有10個活性成分含有0個相關靶點，去除這10個無靶點活性成分后共得到23個有效活性成分。見表1。

2.2藥對靶點與疾病靶點的Venny分析膽石癥相關靶點經過GeneCards，CTD和TTD數據庫查詢后共得出936個，柴胡大黃藥對共有91個成分靶點，取交集后獲得35個交集靶點，分別為PTGS2、PGR、NR3C2、NOS2、ESR1、AR、TNF、JUN、IL2、IL6、IL1B、TP53、MAPK1、VEGFA、EGFR等。見圖1。

2.3柴胡大黃藥對與膽石癥的交集靶點PPI網絡將上述得到的35個交集靶點上傳至STRING數據庫，構建共同作用靶點PPI網絡圖，應用Cytoscape 3.7.2軟件將其可視化處理，蛋白互作網絡圖由32個代表靶蛋白的節點（去除3個游離靶蛋白）和247條代表靶蛋白相互間作用關系的邊構成，靶蛋白間線條連接越多則關聯度越大。見圖2。Degree的平均值是14.1，大于14.1的靶點有19個，由此猜測這19個靶點可能為柴胡大黃藥對作用于膽石癥的關鍵靶點。將靶蛋白按照度值大小由高到低排序。見表2。

2.4中藥活性成分疾病靶點互作網絡構建將藥對、藥對有效活性成分、疾病、交集靶點信息導入Cytoscape 3.7.2軟件，且對上述4部分之間的聯系進行可視化處理。圖中節點共61個，包括中藥2個、活性成分23個、疾病1個、靶點35個;邊共151條，連接邊數越多的節點，關聯強度越大。篩選頻數≥3的靶點基因，共得到19個基因。見圖3。

2.5GO功能富集分析和KEGG通路富集分析35個交集靶點GO功能富集分析得出73個生物過程（BP）（P<0.01）、16個細胞組成（CC）（P<0.05）、19個分子功能（MF）（P<0.01），分別依據P值由小到大的順序，選取其前15個條目進行分析，其中BP主要與一氧化氮生物合成過程的正調控、DNA模板轉錄的正調控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、發燒的正調控、平滑肌細胞增殖的正調控、趨化因子生物合成過程的正調控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄起始、對缺氧的反應、序列特異性DNA結合轉錄因子活性的正調控、細胞對脂多糖的反應等功能有關;CC主要與細胞外間隙、分泌顆粒、胞外區、細胞表面、核染色質、細胞器膜、內質網膜、細胞核、細胞質、線粒體等有關;MF主要與酶結合、類固醇結合、類固醇激素受體活性、轉錄調控區DNA結合、細胞因子活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性，轉錄因子活性，序列特異性DNA結合，轉錄因子結合、核心啟動子序列特異性DNA結合等功能有關。見圖4。并通過KEGG富集分析得到46條信號通路（P<0.01），包括癌癥通路、HIF1信號通路、TNF信號通路、膀胱癌、胰腺癌、炎癥性腸病、類風濕性關節炎、甲型流感、雌激素信號通路、瘧疾等信號通路。將富集得到的前20個條目進行可視化處理。見圖5。相關度最大的為癌癥信號通路。見圖6。

2.6核心活性成分關鍵靶點的分子對接結果根據“表1”中有效化學組分的Degree值，計算得出23個化合物的平均度值約為5.04，取其大于平均度值的5個核心化合物為：MOL000098（槲皮素）、MOL000422（山柰酚）、MOL000354（異鼠李素）、MOL004598（3，3″，4″，5，5″，6，7六甲氧基黃酮）、MOL000449（豆甾醇），分別與度值>20的9個關鍵靶點VEGFA、IL6、TP53、MAPK1、EGF、PTGS2、JUN、EGFR、TNF進行分子對接。

對接結果顯示，豆甾醇和靶點基因TNF、JUN、MAPK1;槲皮素和靶點基因TNF;山柰酚和靶點基因TNF的結合能小于-5.0 kcal/mol（1 cal=4.184 J），其余結合能均大于-5.0 kcal/mol。見表3。以上“活性成分靶點蛋白”的對接圖形用Pymol軟件進行可視化。見圖7。

3討論

膽石癥屬于臨床上常見并多發的病癥，主要以膽管結石和膽囊結石為主[1516]。相關研究表明，在中醫藥治療膽總管結石用藥規律上，柴胡大黃為藥物出現頻次最高的藥對組合，并且其藥物組合關聯規則的置信度>0.9[17]，為其治療膽石癥提供了客觀的數據支撐?，F代藥理學表明，柴胡主要含有皂苷及黃酮類等活性成分，具有抗炎、促進免疫、抗氧化、保肝利膽、降血脂等藥理作用[18]。大黃主要有蒽醌類、蒽酮類、二苯乙烯類和苯丁酮類等活性成分，具有抗炎、鎮痛、降血脂、保護肝臟等藥理作用[1920]。本研究通過網絡藥理學和分子對接方法探討“柴胡大黃”治療膽石癥的分子作用機制，力求從化合物多成分、多靶點、多通路的角度去揭示藥物對膽石癥的作用機制。

通過以上研究得出，“柴胡大黃”藥對共有23個有效化學組分，相應靶點共91個，“柴胡大黃”藥對與膽石癥的交集靶點共35個。關鍵的化學組分包括：槲皮素、山柰酚、異鼠李素、3，3″，4″，5，5″，6，7六甲氧基黃酮、豆甾醇、茵陳黃酮、澤蘭黃醇、蘆薈大黃素等。相關研究表明，槲皮素可以通過影響脂肪的消化吸收、甘油磷脂代謝、AMPK信號通路、脂肪酸降解和膽固醇代謝來降低肉雞腹部脂肪沉積[21];此外，槲皮素還是一種理想的抗炎抗氧化劑，對炎癥性疾病和氧化應激有潛在的輔助治療作用[22]。程笑等[23]通過實驗研究發現山柰酚（KAE）可呈劑量依賴性降低腎組織炎癥介質（IL1β、IL6、TNFα）、黏附分子（ICAM1）的釋放，并可下調炎癥通路蛋白的表達，進而緩解由脂多糖（LPS）刺激引起的小鼠急性腎臟損傷和炎癥反應。異鼠李素可以顯著降低高脂動物模型的血清總膽固醇、LDLC、肝臟血清總膽固醇和三酰甘油的含量，并對HDLC的含量有明顯升高作用[2425]，同時，異鼠李素可以通過阻斷核因子κB信號通路發揮抗炎作用[26]。在一項探討豆甾醇（STG）對膠原性關節炎（CIA）模型RA抗炎作用機制的研究結果中顯示，豆甾醇通過下調核因子κB 65的表達來抑制炎癥介質（TNFα，IL6，IL1β，iNOS和COX2）的表達，增加抗炎細胞因子（IL10）的表達[27]。茵陳黃酮能夠降低OH基和DPPH自由基等的有效濃度，阻斷脂質的過氧化反應，同時對化學物質和炎癥引起的疼痛也具有一定的緩解作用[28]。蘆薈大黃素具有抗菌、抗腫瘤和瀉下作用，還有清除人體自由基、降脂等功效，具體藥理作用機制有待進一步研究[29]。3，3″，4″，5，5″，6，7六甲氧基黃酮、澤蘭黃醇等化合物的成分藥理作用研究未見詳細報道。

GO功能富集分析結果得出73個生物學過程（P<0.01），主要包括：一氧化氮生物合成過程的正調控、細胞對脂多糖的反應、平滑肌細胞增殖的正調控等方面。在正常情況下，肝內細胞僅合成極少量的一氧化氮，但在疾病狀態下誘發的一氧化氮合成增加，一方面可造成肝內代謝和酶作用的紊亂[30]，進而產生致石性病理膽汁而生成結石;另一方面由于一氧化氮能夠擴張管道，造成膽汁排空延緩、膽汁濃縮而生成結石[31]。推測柴胡大黃可能通過降低體內一氧化氮的含量來減少結石生成的過程。細菌感染是膽石癥形成的一項基本因素[32]，同時黏蛋白高分泌在許多膽石形成的動物模型中也是非常突出的;相關研究表明，某些細菌中提取的脂多糖是黏蛋白分泌的有效刺激劑[33]。由此揣測，柴胡大黃藥對可能通過調節細菌體內脂多糖的代謝來降低黏蛋白的分泌，從而減少結石的形成。

KEGG通路富集分析結果得出46條信號通路（P<0.01），富集靶點數目最多的是癌癥通路，另外還有HIF1信號通路、TNF信號通路等多條信號轉導通路與膽石癥存在一定的相關性。膽囊癌致癌模型的表觀遺傳學變化可表現為“膽石病→非典型增生→膽囊癌”;隨著疾病發展程度的增加，CpG島、基因啟動子區域、Wnt信號、Hedgehog信號和抑瘤基因甲基化的數量和幅度也隨之增加[34]。中醫藥在此疾病變化關系中可能通過直接或間接抑制相應基因甲基化表達，繼而阻止膽石病向膽囊癌發展，充分發揮了中醫“未病先防，既病防變”的治療作用。缺氧誘導因子1α（HIF1α）是控制細胞對缺氧反應的轉錄因子，在非酒精性脂肪肝患者肝細胞中被激活。國外一項動物實驗顯示，缺氧可上調HIF1α的表達，降低水通道蛋白8（AQP 8）的表達，并可抑制肝細胞水分泌而濃縮膽汁脂質，進而可促進膽固醇結石的形成;另外，其研究結果表明，有膽結石的小鼠肝臟HIF1α水平高于無膽結石的小鼠的肝臟[35]。

另外，我們一般認為配體和受體有一定的結合活性時結合能<-4.25 kcal/mol，當有較好的結合活性時結合能<-5.0 kcal/mol，有強烈的結合活性時結合能<-7.0 kcal/mol[36]。通過對PPI圖中的核心靶點與柴胡大黃有效活性成分進一步做能量和結構互補分析發現，豆甾醇與TNF靶點有強烈的結合活性，豆甾醇與JUN靶點有較好的結合活性，豆甾醇與TP53靶點有一定的結合活性。TNF是一種重要的炎癥介質，低濃度時具有抗炎抗病毒及免疫調節作用，高濃度時可刺激IL1和IL6等炎癥介質的分泌，加重炎癥反應[37]。劉龍忠等[38]研究發現具有利膽作用的中草藥可以明顯降低膽色素結石豚鼠的成石率，并認為這可能與藥物降低膽色素結石豚鼠膽組織TNFα、核因子κB蛋白的表達有關。最新研究發現，由cJun參與組成的活化蛋白1（AP1）可以和多種形式的蛋白形成同源或異源二聚體，與DNA結合參與多種生長因子、細胞因子的基因轉錄，進而調控腫瘤細胞的增殖、分化、轉化、侵襲和耐藥等過程[39]。TP53屬于腫瘤抑制蛋白，可根據生理環境和細胞類型，誘導細胞生長停滯或凋亡。TP53作為一種反式激活劑參與細胞周期調控，通過控制這一過程所需的一組基因來負調控細胞分裂。在一項回顧性研究中提到TP53基因突變會促使慢性膽囊炎向膽囊癌發生轉變[40]。提示柴胡大黃藥對中豆甾醇發揮藥物治療作用的活性成分最強，其可能通過調節TNF、JUN、TP53等相關靶點起到治療膽石癥的作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學及分子對接方法，初步闡述了柴胡大黃藥對治療膽石癥的關鍵靶點和多種活性成分、多個核心靶點、生物學過程及信號通路協同作用的分子機制，為今后更深一步地探索柴胡大黃藥對中有效活性成分治療膽石癥奠定了理論基礎，也為后續藥理實驗研究該藥對治療膽石癥提供了有益的思路。

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（2021-01-26收稿本文編輯：魏慶雙）

基金項目：河北省中醫藥管理局科研計劃項目（2020080）

作者簡介：高云霄（1995.10—），女，碩士研究生在讀，研究方向：中醫內科脾胃病，Email：2285410658@qq.com

通信作者：楊倩（1966.06—），女，碩士研究生，主任醫師，博士研究生導師，研究方向：中醫內科脾胃病，Email：yang0311qian@126.com