淡豆豉提取物不同溶劑萃取物的抗氧化活性

劉俊澤 胡力銘 王仁廣 王淑敏 王 歡

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

淡豆豉(fermented soya beans)是豆科植物大豆(黑豆)的成熟種子與中藥青蒿、桑葉經發酵得到的加工品[1]，是一種歷史悠久的健康食品[2]，被衛生部列在中國首批藥食兩用名單中[3]。其含有多種天然活性成分，如大豆異黃酮、豆豉多糖、大豆皂苷、大豆低聚糖、維生素以及發酵過程中產生的纖溶酶、γ-氨基丁酸等[4-5]，具有降血脂、降血壓、抗氧化、免疫調節、預防骨質疏松等保健作用[6-7]；臨床上還可用于治療感冒、寒熱頭痛、煩燥胸悶、虛煩不眠等病癥[8]。目前淡豆豉抗氧化活性的研究主要集中于大豆異黃酮類、豆豉多糖、大豆皂苷等成分，但有關淡豆豉粗提物不同溶劑萃取物抗氧化活性成分的研究尚未見報道。

自由基是一種廣泛存在于人體細胞中的游離基[9]，與人體的新陳代謝、正常生長發育以及疾病發生等有著密切的聯系。研究發現，淡豆豉中的多糖[10]、異黃酮[11]、大豆皂苷等成分在體外表現出良好的自由基清除能力，可被用作天然抗氧化劑添加到食品中。試驗擬采用70%乙醇對淡豆豉進行提取，并用不同溶劑對粗提物進行萃取，測定粗提物與各萃取物中總黃酮、總多糖以及6種大豆異黃酮含量，評價粗提物與不同溶劑萃取物對DPPH自由基、ABTS自由基、OH自由基的清除能力，并進行相關性分析，以期為進一步研究和開發淡豆豉抗氧化食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

淡豆豉：批號36919004，經長春中醫藥大學藥學院王淑敏教授鑒定為豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的干燥成熟種子(黑豆)的發酵加工品，河北仁心藥業有限公司；

蘆丁、1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)：分析純，上海源葉生物科技有限公司；

大豆苷元、大豆苷、染料木素、染料木苷、黃豆黃素、黃豆黃苷標準品：批號分別為DST191011-020、DST190819-019、DST190915-002、DST200319-003、DST190819-009、DST1903312-008，HPLC≥98%，成都德斯特生物科技有限公司；

2，2′-聯氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

過硫酸鉀：分析純，上海沃凱生物技術有限公司；

L-抗壞血酸、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉：分析純，天津市光復精細化工研究所；

無水乙醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇：分析純，天津市永大化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

高效液相色譜儀：LC-2030型，島津(中國)有限公司；

多功能酶標儀：Infinte M200 Pro型，TECAN帝肯(中國)有限公司；

雙光束紫外可見分光光度計：TU-1901型，北京普析通用儀器有限責任公司；

萬分之一電子天平：ME204E型，梅特勒—托利多國際有限公司；

旋轉蒸發儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 稱取200 g淡豆豉干燥粉末，以料液比(m淡豆豉∶V乙醇)1∶10 (g/mL)加入70%乙醇[12-13]，超聲處理(120 W，40 kHz)1 h，重復3次，合并提取液，過濾，減壓濃縮，干燥至恒重，得50.54 g浸膏。

取32.00 g浸膏，加水制成懸濁液，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，共3次，合并萃取液，過濾，減壓濃縮，干燥至恒重得不同極性部位萃取物。分別取適量粗提物及各溶劑萃取物，用70%乙醇配制成2.0 mg/mL 的溶液作為供試品。

1.2.2 總黃酮含量測定 參照文獻[14-15]稍作修改，分別吸取3 mL粗提物及各溶劑萃取物供試品于10 mL具塞試管中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.40 mL，靜置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.40 mL，靜置6 min；加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，混勻，靜置15 min。以蘆丁作為對照品制作標準曲線；以70%乙醇代替各供試品溶液作為空白對照。測定506 nm處吸光度，計算粗提物與各萃取物中總黃酮含量，結果以每克萃取物含有的總黃酮的毫克數表示(mg/g)。

1.2.3 總多糖含量測定 參照文獻[16]稍作修改，將各供試品溶液稀釋至0.5 mg/mL，各取1 mL于10 mL具塞試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻；加入濃硫酸5 mL，搖勻，室溫下避光反應20 min。以無水葡萄糖作為對照品制作標準曲線；以70%乙醇代替各萃取物溶液作為空白對照。測定490 nm處吸光度，計算粗提物與各萃取物中總多糖含量，結果以每克萃取物含有的總多糖的毫克數表示(mg/g)。

1.2.4 大豆苷等6種大豆異黃酮含量測定 色譜柱為安捷倫 ZORBAX Extend-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為0.1%磷酸(A)—乙腈(C)；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；進樣量10 μL，檢測波長254 nm；梯度洗脫程序為0～5 min，17% A；5～26 min，17%～28% A；26～30 min，28% A；30～33 min，28%～30% A；33～38 min，30%～35% A；38～43 min，35% A；43～45 min，35%～17% A；55 min，17% A。對萃取物中6種異黃酮類成分進行指認，并根據各化合物峰面積與相應化合物標準曲線進行定量，結果以每克萃取物所含該種異黃酮的毫克數表示(mg/g)。

1.2.5 DPPH自由基清除能力測定 根據文獻[17]，并按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

c——自由基清除率，%；

A2——供試品溶液吸光度值；

A1——空白對照組溶液吸光度值；

A0——溶劑代替不同供試品溶液吸光度值。

1.2.6 ABTS自由基清除能力測定 根據文獻[18]，并按式(1)計算ABTS自由基清除率。

1.2.7 OH自由基清除能力測定 根據文獻[19]，并按式(1)計算OH自由基清除率。

1.3 數據統計與分析

采用Excel 2010、SPSS 26.0、GraphPad Prism 8.0軟件對數據進行單因素方差分析(ANOVA)、相關性分析及圖像繪制，所有試驗重復3次，結果表示為(x±s)。

2 結果與分析

2.1 含量分析

2.1.1 總黃酮、總多糖含量 由表1可知，乙酸乙酯萃取物的總黃酮含量最高為(92.912±1.130)mg/g，其次為正丁醇萃取物，說明淡豆豉中的黃酮類成分大多為中等極性。正丁醇萃取物中的總多糖含量最高為(83.381±0.754)mg/g，其次是萃余物、70%乙醇粗提物、乙酸乙酯萃取物。說明淡豆豉中所含有的黃酮、多糖類化學物質可被中強極性(乙酸乙酯、正丁醇)溶劑富集，推測這些物質屬于中強極性物質。

表1 粗提物與不同溶劑萃取物中總黃酮、總多糖含量測定結果?Table 1 Determination results of total flavonoids,and total polysaccharides in crude extract and different solvent extracts

2.1.2 6種大豆異黃酮含量 由圖1和表2可知，正丁醇萃取物中的大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素含量均顯著高于其他萃取物，含量分別為(2.042±0.053)，(8.074±0.006)，(21.366±0.117)，(11.686±0.003)mg/g。黃豆黃苷在乙酸乙酯萃取物中富集最多，達(4.917±0.026)mg/g。黃豆黃素在二氯甲烷萃取物中含量最高，為(4.664±0.011)mg/g。綜上，正丁醇可以較好地萃取淡豆豉中的異黃酮成分，其次為乙酸乙酯，而萃余部位中的6種異黃酮含量低于檢測限。

1.大豆苷 2.黃豆黃苷 3.染料木苷 4.大豆苷元 5.黃豆黃素 6.染料木素 S1.萃余物 S2.石油醚萃取物 S3.二氯甲烷萃取物 S4.乙酸乙酯萃取物 S5.70%乙醇粗提物 S6.正丁醇萃取物 S7.6種大豆異黃酮混標圖1 粗提物與各溶劑萃取物HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of the crude extract and the solvent extracts

表2 粗提物與各溶劑萃取物中6種異黃酮含量?Table 2 Determination results of 6 isoflavones in crude extract and solvent extracts mg/g

2.2 抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除活性 由圖2可知，淡豆豉粗提物與各溶劑萃取物對DPPH自由基的清除作用均呈現一定的量效關系。其中，正丁醇萃取物與乙酸乙酯萃取物對DPPH自由基的清除能力較強，IC50分別為(0.371±0.007)，(0.499±0.007)mg/mL，在質量濃度范圍內，二者對DPPH自由基的清除作用雖弱于抗壞血酸，但隨質量濃度的升高，其對DPPH自由基清除作用可能會進一步增強；其次為70%乙醇粗提物部位，其對DPPH自由基清除率的IC50為(0.867±0.020)mg/mL；萃余物與二氯甲烷萃取物對DPPH自由基的清除作用較接近，IC50分別為(1.216±0.098)，(1.814±0.037)mg/mL；石油醚萃取物對DPPH自由基的清除能力最弱。

圖2 粗提物、各溶劑萃取物的DPPH自由基清除活性Figure 2 DPPH free radical scavenging activity of crude extracts and solvent extracts

2.2.2 ABTS自由基清除活性 由圖3可知，隨著粗提物與各溶劑萃取物質量濃度的升高，ABTS自由基的清除能力也增強，其中抗壞血酸對ABTS自由基的清除能力明顯高于粗提物和各萃取物。正丁醇萃取物對ABTS自由基的清除能力優于粗提物與其他萃取物，其IC50為(0.199±0.003)mg/mL；其次為乙酸乙酯萃取物和70%乙醇粗提物，IC50分別為(0.203±0.008)，(0.264±0.003)mg/mL；除正丁醇萃取物外，其余萃取物在質量濃度為0.0～0.2 mg/mL時，對ABTS自由基的清除能力接近，當質量濃度>0.2 mg/mL時，乙酸乙酯萃取物的清除能力略高于70%乙醇粗提物和二氯甲烷萃取物；萃余物與二氯甲烷萃取物清除ABTS自由基的IC50分別為(0.405±0.010)，(0.336±0.008)mg/mL，較為接近；石油醚萃取物對ABTS自由基的清除能力最弱。

圖3 粗提物、各溶劑萃取物的ABTS自由基清除活性Figure 3 ABTS free radical scavenging activity of crude extracts and solvent extracts

2.2.3 OH自由基清除活性 由圖4可知，淡豆豉粗提物與各溶劑萃取物對OH自由基均具有一定的清除作用，且趨勢相近，其中正丁醇萃取物清除OH自由基能力優于粗提物及其他萃取物，IC50為(0.162±0.002)mg/mL，當樣品質量濃度<0.4 mg/mL時，正丁醇萃取物與抗壞血酸對OH自由基的清除能力相近，當質量濃度>0.4 mg/mL 時，抗壞血酸的清除能力優于正丁醇萃取物；其次為乙酸乙酯萃取物，IC50為(0.166±0.006)mg/mL，略低于正丁醇萃取物；70%乙醇粗提物、二氯甲烷萃取物、石油醚萃取物及萃余物對OH自由基的清除能力較弱，最弱為石油醚萃取物。

圖4 粗提物、各溶劑萃取物的OH自由基清除活性Figure 4 OH radical scavenging activity of crude extract and solvent extracts

2.3 抗氧化能力與總黃酮、總多糖及6種異黃酮含量的相關性

由表3可知，總黃酮含量與DPPH自由基、ABTS自由基和OH自由基的清除能力顯著相關(P<0.05)；總多糖含量與DPPH自由基的清除能力極顯著相關(P<0.01)，與ABTS自由基的清除能力顯著相關(P<0.05)?？傸S酮含量與6種大豆異黃酮含量均表現出相關性，異黃酮中的大豆苷、大豆苷元、染料木苷及染料木素含量與3種自由基的清除能力極顯著相關(P<0.01)；黃豆黃苷含量與DPPH自由基和OH自由基的清除能力極顯著相關(P<0.01)，與ABTS自由基的清除能力顯著相關(P<0.05)。

表3 抗氧化能力與總黃酮、總多糖及6種異黃酮含量的相關性?Table 3 Correlation analysis of antioxidant capacity and content of total flavonoids,total polysaccharides and 6 kinds of isoflavones

3 結論

采用3種體外抗氧化活性評價方法，對淡豆豉粗提物的不同極性溶劑萃取物的抗氧化活性進行了研究。結果表明，正丁醇萃取物的抗氧化活性高于其他萃取物，其總多糖含量最高，總黃酮含量僅次于乙酸乙酯萃取物的，且其中的大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素含量明顯高于粗提物及其他萃取物的。由相關性分析結果可知，總黃酮含量與3種抗氧化活性指標的相關性最大，總多糖含量的次之。3種抗氧化活性指標與大豆異黃酮中的大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素含量極顯著相關(P<0.01)，與黃豆黃苷含量顯著相關(P<0.05)。綜上，總黃酮中的大豆異黃酮類成分是發揮抗氧化活性的主要物質，特別是大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素這4種大豆異黃酮，而正丁醇可以較好地萃取淡豆豉中的這4種大豆異黃酮，是抗氧化成分的最優萃取溶劑。淡豆豉在發酵過程中，結合型的大豆異黃酮糖苷轉化成游離型的大豆異黃酮苷元，使其具備更強的抗氧化能力；此外，淡豆豉的發酵工藝以及引入的輔料青蒿、桑葉對淡豆豉的抗氧化活性影響有待進一步探究；后續將繼續探究淡豆豉的炮制工藝，以及淡豆豉中大豆皂苷、大豆蛋白等其他成分與抗氧化活性間的關系以及作用機理。