液相色譜-串聯質譜法測定嬰幼兒奶粉中的脂溶性維生素

鄭國建，林毅侃，印杰

（上海市質量監督檢驗技術研究院，上海 200233）

0 引言

嬰幼兒配方奶粉作為非母乳喂養嬰兒的主要食物來源，含有其生長發育的所有營養[1]。脂溶性維生素是嬰幼兒進行正常新陳代謝所必須的。如維生素A缺乏可導致兒童失明[2]；維生素D缺乏會對骨骼造成影響[3]；維生素E缺乏可導致人體生殖系統、肌肉系統等異常[4]。因此國家對嬰幼兒配方奶粉制定了嚴格的產品標準，如GB 10765-2010[5]，GB 10767-2010[6]。用于測定脂溶性維生素（維生素A、E、D、K1、）的國家標準有2個：GB 5009.82-2016[7]、GB5009.158-2016[8]。相應的AOAC方 法 有3個：AOAC 2012.10[9]、AOAC 2016.05[10]、AOAC 2015.09[11]。在使用上述方法時需對樣品進行差異化處理，且處理過程復雜，同時需使用多臺套設備進行定性定量分析。本研究將建立一個同時檢測該4種脂溶性維生素的液相色譜-串聯質譜方法，簡化樣品處理步驟，提高處理能力，提高檢測效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

維生素A、維生素A棕櫚酸酯、維生素醋酸酯、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素D3、維生素K1、二丁基羥基甲苯（BHT）購于Sigma公司；二氯甲烷、甲醇、乙腈、異丙醇、甲酸為色譜純購于Fisher Scientific；正己烷、環己烷、乙醚、石油醚、甲基叔丁基醚、異辛烷、丙酮為化學純購于國藥化學試劑有限公司；超純水由Millipore Milli-Q超純水儀生產。

1.2 儀器與設備

Waters XEVO TQXS液相色譜-串聯質譜儀，配有大氣壓化學電離離子源（APCI），沃特世科技（上海）有限公司；Eppendorf 5804離心機，艾本德中國有限公司；Wiggens Votex 3000渦旋振蕩儀，維根技術(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Waters BEH C182.150 mm，1.7μm。流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為1%二氯甲烷甲醇溶液，梯度洗脫：0~0.5 min，20%A保持不變；0.5~4 min，20%A線性變化至0%A；4~8.5 min，0%A保持不變；8.51 min變化至20%A，保持2 min；柱溫為40℃；流速為0.5 mL/min；進樣量為2μL。

1.3.2 質譜條件

大氣壓化學電離離子源（APCI），正電離模式；電暈電流：15.0μA；錐孔電壓：30 V；離子源溫度：400℃；干燥氣流速為800 L/h；錐孔反吹氣流速為150 L/h。離子對、碰撞能量如表1所示。

表1 質譜參數

1.3.3 樣品處理

試樣前處理條件參考了AOAC 2012.10和AOAC 2015.09，并做了適當修改：精確稱取0.500 g試樣，加0.1 g BHT，加10 mL水，渦旋混勻，加入20 mL甲醇，渦旋20 s后靜置10 min，加入10 mL異辛烷，渦旋20 s，在9 000 r/min轉速下離心2 min。取1 mL上清于40℃水浴中氮吹吹干，用丙酮復溶后過0.22μm有機濾膜過濾，進樣分析。

2 結果與分析

2.1 液相色譜-串聯質譜條件的優化

用于脂溶性維生素測定的儀器方法包括正相色譜法[12]、反相色譜法[13-14]、液相色譜-串聯質譜法[15-16]等。維生素A和維生素D有紫外吸收基團，維生素E既有紫外吸收基團又有熒光響應，因此可在液相條件下同時檢測。但是維生素K1由于無紫外吸收基團，需使用鋅粉還原柱進行還原后再進行檢測，導致這4類脂溶性維生素無法同時使用液相色譜分析。因此本研究使用通用性更好的液相色譜-串聯質譜儀實現這4類脂溶性維生素的同時檢測。

由于采用了直接提取法，所以實驗需考慮嬰幼兒奶粉中維生素A、E、D、K的所有添加形式。參考了AOAC 2012.10（維生素A、E）[9]、AOAC 2016.05（維生素D）[10]、AOAC 2015.09（維生素K1）[11]可知維生素A主要包含維生素A棕櫚酸酯和維生素A醋酸酯；維生素E包括alpha-生育酚和維生素E醋酸酯；以及維生素D3和維生素K1。

由于脂溶性維生素的極性較小，因此當采用直接提取法時，往往使用正相色譜分析，如AOAC 2012.10[9]和AOAC 2015.09[11]中使用了正己烷、甲基叔丁基醚、異辛烷等正相溶劑。而正相體系對液相色譜-串聯質譜的硬件要求比較高，需要配置專門的正相脫氣包。且正相體系在質譜中應用有一定的危險性。因此本實驗探索使用C18反相色譜進行脂溶性維生素的分析。

實驗研究了甲醇、乙腈等溶劑對維生素A、維生素A棕櫚酸酯、維生素A醋酸酯、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素D3、維生素K1在C18色譜柱上的洗脫能力。實驗發現當使用乙腈作為流動相時，對維生素A棕櫚酸酯的洗脫能力較弱，導致其出峰時間過長；甲醇的洗脫能力強于乙腈，但還是無法滿足實驗要求的10 min內完成分析的目標。為了加強流動相的洗脫能力，實驗在流動相中加入少量的二氯甲烷。當二氯甲烷質量分數達到1%時能顯著改善維生素A棕櫚酸酯的出峰時間，使其變得尖銳。同時為了保證維生素A、維生素A醋酸酯不要出峰太早，在初始階段加入適當的水增加流動相的極性，優化后的色譜條件見1.3.1，色譜圖如圖1所示。圖1（a）中，3個峰依次為維生素A、維生素A醋酸酯和維生素A棕櫚酸酯。

圖1 脂溶性維生素標準品的液相色譜-串聯質譜色譜

在電離方法選擇上，由于脂溶性維生素極性較小，因此更適合使用大氣壓化學電離（APCI）對其進行離子化[17]。通過優化APCI的電離參數，優化各脂溶性維生素的選擇離子和碰撞能，最終得到各化合物的特征離子對和碰撞能，如表1所示。

2.2 前處理條件的優化

嬰幼兒奶粉中脂溶性維生素的提取方法分為直接提取法[8-9,11]和堿溶液皂化提取法[7,10]。由于維生素K1在堿性條件下極不穩定[18]，因此為了實現對脂溶性維生素的同時提取，本研究選用直接提取法。

維生素A、維生素A棕櫚酸酯、維生素A醋酸酯、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素D3、維生素K1屬于脂溶性維生素，易溶于乙醚、石油醚、正己烷、環己烷等有機溶劑。實驗選用一實驗室陽性奶粉樣品進行實驗，實驗方案為：先用45 g水溶解5 g奶粉樣品，渦旋混勻后，取5 g試樣，加5 mL水，用20 mL甲醇沉淀蛋白，再使用10 mL適當的有機溶劑提取其中的脂溶性維生素，離心取上層溶劑氮吹吹干后，使用適當的溶劑進行溶劑轉換后進樣分析。實驗中考察了乙醚∶石油醚（1∶1，體積比）、正己烷∶環己烷∶乙醚（4∶4∶2，體積比）、正己烷、異辛烷等提取溶劑的提取效果。

當使用乙醚∶石油醚（1∶1，體積比）和正己烷∶環己烷：乙醚（4∶4∶2，體積比）體系時，離心后水相和有機相之間存在較厚的乳化層，導致測試結果偏低，見表2。當使用正己烷、異辛烷時，離心后水相和有機相能得到較好的分離，但正己烷的提取效率不及異辛烷，如表2所示。最終選擇異辛烷作為提取溶劑。

表2 提取溶劑的提取效果

由于異辛烷溶液不能直接進入反相色譜體系，因此需對其進行溶劑轉換。在選擇復溶溶劑時對比了異丙醇、甲醇、乙腈和丙酮的復溶效果。當使用異丙醇、甲醇和乙腈復溶時，不能完全溶解氮吹后的殘渣，溶液比較渾濁。而用丙酮時能完全溶解殘渣。因此選擇丙酮作為復溶溶劑。

2.3 基質效應

質譜的基質效應是指樣品中復雜的干擾物對分析物質譜響應的抑制或增強，可用基質標準曲線與標準校準曲線斜率的比值進行評估[19-20]。維生素A、維生素A棕櫚酸酯、維生素A醋酸酯、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素D3、維生素K1在奶粉基質中的基質效應比值分別為0.81、0.83、0.78、0.84、0.94、0.76、0.80，均小于1，表明脂溶性維生素的響應被樣品中的干擾物質輕微抑制。因此為了減輕基質效應的影響，在配制標準工作液時應選擇空白基質溶液進行配制。

2.4 線性關系和定量限

使用儲備液，用空白基質溶液稀釋成不同濃度的標準工作液，進行液相色譜-串聯質譜分析。以標準工作液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標制作標準曲線，各脂溶性維生素的線性相關系數r≥0.99，見表3。

使用空白基質溶液對標準溶液進行稀釋，直至化合物的峰高略大于10倍信噪比作為方法的定量限，各脂溶性維生素的定量限在（1~20）μg/100g之間，如表3所示。

表3 線性范圍、相關系數及定量限

2.5 回收率和精密度

分別在空白奶粉基質中進行加標回收實驗。其中加標濃度點的低點為0.5倍左右脂溶性維生素在嬰幼兒奶粉中的平均添加量，中間點為脂溶性維生素在嬰幼兒奶粉中的平均添加量，高點為1.5倍左右的平均添加量。每個加標水平進行6次重復，總體回收率在81.7%~99.8%之間，相對標準偏差在1.13%~6.33%之間，結果如表4所示。

表4 脂溶性維生素在奶粉基質中的回收率、精密度μg/100g

2.6 實際樣品檢測

采用本方法對市售的5批次嬰幼兒配方奶粉中脂溶性維生素進行檢測,見表5。所測得值均大于產品標簽明示值，說明為了防止脂溶性維生素在貨架期內降解，生產廠家對該類維生素進行了過量添加以保證產品質量。檢測中發現嬰幼兒奶粉中沒有檢測到維生素A，可能是由于維生素A穩定性較差[21-22]。所以企業主要以維生素A醋酸酯和維生素A棕櫚酸酯的形式添加。

表5 實際樣品檢測 μg/100g

3 結 論

本文建立了一種使用液相色譜-串聯質譜法測定嬰幼兒奶粉中脂溶性維生素的方法。該方法在各自的范圍內其線性相關系數≥0.99；維生素A、維生素A棕櫚酸酯、維生素A醋酸酯、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素D3、維生素K1定量限在1μg/100g~20μg/100g之間；方法在奶粉基質中的3個濃度水平具都有非常好的加標回收率和精密度，回收率在81.7%~99.8%之間，相對標準偏差為1.13%~6.33%。該方法適用于嬰幼兒奶粉中脂溶性維生素的測定。