發酵乳干預對超重肥胖孕產婦母乳成分和母子健康的影響

范 瑞，劉彥品，趙軍英，劉 斌，劉 茜，高子晴*，陳歷俊*

（1 大連工業大學生物工程學院 遼寧大連 116034 2 北京三元食品股份有限公司 國家母嬰乳品健康工程技術研究中心北京市乳品工程技術研究中心 母嬰研究技術創新中心 北京 100163）

孕產期女性受激素等因素影響，其身體和心理發生重大變化[1]。母乳是嬰幼兒最理想的食物來源，母乳成分受母親膳食影響。臨床研究發現母體在孕期補充乳酸雙歧桿菌動物菌株HNO19，可以在初乳和3 個月的母乳中檢測到同株菌[2]。母乳中的微生物可以傳遞給嬰兒，如雙歧桿菌、乳酸桿菌等，可抑制病原微生物在嬰兒腸道內生長定植，促進嬰兒腸道微生態健康[3-6]。純母乳喂養方式下，母乳中蛋白質、脂肪等主要營養物質含量可能直接影響嬰幼兒早期生長發育[7]，母乳里的蛋白質可以促進2～12 周的嬰幼兒的生長速率[8]。有研究表明膳食干預會影響母乳中的脂肪、干物質和總能量[9]。然而，由于膳食干預對母乳成分的影響不顯著，使用益生菌干預母乳成分逐漸成為學者們爭相探究的課題。

益生菌是指活的微生物，當量足夠大時，會賦予宿主健康益處。有研究以肥胖大鼠作為試驗對象，發現嗜酸乳桿菌及短雙歧桿菌均能一定程度上改善肥胖大鼠的肥胖指數、血脂紊亂及胰島素抵抗[10]。Park 等[11]研究發現，植物乳桿菌HAC01 通過調節毛羅菌科和瘤胃菌科，減輕肥胖小鼠脂肪堆積，上調脂質氧化相關基因的表達。此外，臨床研究也顯示，益生菌能有效調節肥胖患者的體質量，嗜黏蛋白阿克曼氏菌能夠改善腸道屏障功能，調節高脂飲食相關的代謝紊亂，如體重增加、代謝性內毒素血癥、脂肪組織炎癥及胰島素抵抗等[12]。對于嬰幼兒而言，母親孕期增重過多也可能導致學齡前兒童發生超重或肥胖[13]。益生元的最新定義為：一種可以被宿主微生物選擇性利用，從而賦予健康益處的基質[14]，包括低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉等[15]。目前常見的益生元包括乳果糖、低聚果糖。益生元能夠增加飽腹感和降低食欲[16]，能夠被人體腸道益生菌發酵利用，增加原籍益生菌，遏制有害菌，減低機體炎癥狀態，改善糖脂代謝，調節腸道激素變化，從而改善肥胖及肥胖相關代謝紊亂[17]，是超重或肥胖人群控制體重的理想選擇。

抑郁癥是當今世界最常見的精神障礙，具有顯著持久的心境低落、興趣減退和快感缺失等臨床特征[18]，在全球的發生率高達10%～30%[19]。研究發現產后抑郁和嬰幼兒心理行為發育的關系呈正比[20]，對嬰兒體格發育和發育商有負面影響的可能[21]。另外，產后抑郁還是嬰幼兒社會情緒能力發展不良的重要風險因素[22]。為了提高產后母子精神健康水平，研究人員們發現給予幼年大鼠益生菌，能夠改善親子分離應激模型小鼠抑郁癥狀，且有益效應延續到小鼠成年以后，用益生菌調節胃腸功能同樣能改善臨床患者的抑郁癥狀[23-24]。瑞士乳桿菌R0052 和長雙岐桿菌R0175 也可以改善抑郁焦慮癥狀[25]。此外，有證據證明益生元通過推動有益微生物的生長，改善焦慮、抑郁癥狀[26]。

有關益生菌、益生元對超重肥胖孕婦的影響已有部分報道，然而，不同菌株或其組合與代謝物具有不同功效，目前缺少益生菌孕產期干預對母子健康功效的研究。本文探究既富含益生菌，又富含益生元的發酵乳對母乳成分、母子身體和心理健康水平的影響。

1 材料與方法

1.1 受試者納入及排除標準

納入標準：年齡18～35 歲；單胎妊娠；入組孕周8～12 周零6 天 （根據末次月經或B 超監測）；BMI≥25 kg/m2，在京居住至少5年，無孕前高血壓、糖尿病、高脂血癥、肝炎、腎炎、消化道疾?。晕秆?、腸炎、胃潰瘍及十二指腸潰瘍等）及感染性疾病史（肝炎、肺結核等）。

排除標準：近1 個月服用抗生素、益生菌或益生元，規律吸煙、飲酒，輔助生育技術受孕，精神類疾病不能正確回答問題或不愿進行問卷調查者不納入本研究；減肥手術史；不能依從膳食推薦；乳糖不耐受；牛奶蛋白過敏。

1.2 受試者招募、干預與跟蹤

招募Y（發酵乳組）84、C（對照組）62 名受試者（產婦），研究獲得首都醫科大學附屬北京地壇醫院醫學倫理委員會批準（2017-KY-015-02），所有志愿者簽署知情同意書，每日飲用一瓶富含益生菌益生元的衡安堂166 發酵乳（簡稱166 發酵乳）200 mL。166 發酵乳配料如下：生牛乳、菊粉（1%～2%，質量分數，下同）、低聚果糖（1%～2%）、聚葡萄糖（≤1%）、低聚異麥芽糖（≤1%）、低聚半乳糖（1%～2%）、低聚木糖（≤1%）、甜菊糖苷、羅漢果甜苷、格氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、短雙岐桿菌（Bifidobacterium breve）、乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactobacillus）、長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）。

分別在產后1～5 d，42±3 d，3～6 個月收集采集母乳；產后42 d 收集母嬰健康隨訪表、嬰幼兒神經心理評估量表ASQ-3、愛丁堡產后抑郁量表（Edinburgh Postnatal Depression Scale，EPDS）。母乳采集方法：用香皂或洗手液洗凈雙手，并用干凈的濕巾輕輕擦拭乳頭及乳暈，上午9：00-11：00 用消毒后的吸奶器吸空一側乳房乳汁，將前乳和后乳混勻后取10 毫升于無菌的離心管中，采集后暫時存放在-20 ℃冰箱中，24 h 內低溫轉移到-80 ℃冰箱。受疫情影響，各階段有部分受試者退組以及個別信息缺填情況。由于初乳采集量較少，而母乳成分和微生物分析樣本用量較高，因此沒有對初乳進行檢測與分析；產后6 周內是抑郁癥的高發期[27]，以產后42 d 為代表分析發酵乳干預對產后近期母嬰健康、產婦抑郁、嬰幼兒神經心理發育的影響。各階段采集的樣本數量及量表收集數量見表1。

表1 樣本及量表采集數量Table 1 Number of collected samples and scales

1.3 樣本檢測和健康評估量表

母乳微生物檢測：采用CTAB 或SDS 法提取母乳樣本基因組DNA，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的濃度和純度，然后對母乳菌群16S rRNA V3-V4 區進行聚合酶鏈式反應擴增，擴增引物為515F-806R，位于16S V4 區，擴增產物由2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后使用Qiagen 公司提供的膠回收試劑盒進行純化，利用Illumina 公司TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好文庫后，通過Qubit 和Q-PCR 定量，最后通過NovaSeq6000 進行上機測序。

母乳宏量成分檢測：首先使用3 mL 加熱至40 ℃的CLEAN 液對Miris HMA 母乳分析儀進行清洗，注入3 mL 的CHECK 液進行指標校正。接著使用離心管取3～5 mL 的母乳樣本進行超聲，再使用5 mL 規格注射器將樣本注入母乳分析儀中，檢測完成之后進行儀器清洗，防止影響下次使用。

母子健康指標：母親身體質量指數（Body Mass Index，BMI）、嬰幼兒體重增長指標，通過愛丁堡產后抑郁量表、嬰幼兒神經心理評估量表ASQ-3 分別評估產婦、嬰幼兒神經心理發育狀況。

1.4 統計分析

對比兩組母親的身體質量指數（BMI）、愛丁堡產后抑郁量表（EPDS）得分等指標。

試驗數據的分析處理以及圖表繪制：SPSS，Oringin 等軟件。

2 結果與分析

2.1 發酵乳干預對母乳菌群相對豐度的影響

從圖1可以看出，在屬水平上，對照組在產后42 d 以不動桿菌屬（Acinetobacter）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）為優勢菌屬；發酵乳組以不動桿菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬、鏈球菌屬、沙雷氏菌屬（Serratia）為優勢菌屬。在產后3～6 個月，對照組以不動桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬為優勢菌屬；發酵乳組以不動桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬為優勢菌屬。

圖1 發酵乳干預對產后42 d，3～6 個月母乳菌群屬水平上相對豐度的影響Fig.1 Effect of fermented dairy intervention on the relative abundance of breast milk flora at genus level on postpartum 42 days and 3-6 months

2.2 發酵乳干預對母乳菌群整體結構的影響

圖2顯示，在產后42 d，母乳菌群的群落構成具有顯著差異 （P=0.001），且發酵乳組逐漸沿著PCo2（貢獻率9.8%）拉開距離，同時也說明存在造成這種顯著差異的關鍵菌屬；在產后3～6 個月，發酵乳組和對照組的母乳微生物存在部分重合（P=0.885）。即發酵乳干預可以顯著改變產后42 d 母乳微生物菌群的整體結構。

圖2 PCoA 分析Fig.2 PCoA analysis

2.3 發酵乳組和對照組的差異菌屬分析

將發酵乳組和對照組產后42 d、3～6 個月的母乳微生物比較發現，在屬的水平上，與對照組相比，產后42 d 發酵乳組的羅爾斯通菌屬（Ralstonia）、細球菌屬（Micrococcaceae）顯著上升；韋榮氏球菌屬（Veillonella）、痤瘡丙酸桿菌（Cutibacterium）、鏈球菌屬、泛菌屬（Pantoea）、兼性雙球菌屬（Gemella）、羅斯氏菌屬 （Rothia）、奈瑟氏菌屬（Neisseria）等菌屬顯著下降（P＜0.05）（圖3a）。在產后3～6 個月，經過發酵乳干預后，母乳中的細球菌屬、大腸志賀氏桿菌（Escherichia-Shigella）、罕見小球菌屬顯著上升；鏈球菌屬顯著下降（P＜0.05）（圖3b）。

圖3 母乳微生物的差異菌屬分析Fig.3 Differential bacteria analysis on dominant genus

2.4 發酵乳干預對母乳宏量成分的影響

根據發酵乳組和對照組在產后42 d 和產后3～6 個月兩組母乳中的宏量成分比較分析，發現在脂肪、總蛋白、真蛋白、糖類、干物質以及總能量中，僅產后3～6 個月時，發酵乳組母乳中的真蛋白含量顯著高于對照組（P=0.033），其它宏量成分在兩組中無統計學差異（圖4）。

圖4 發酵乳干預母乳中的宏量成分Fig.4 Effect of fermented dairy on breast milk macronutrient

2.5 發酵乳干預對產后母子體重、心理健康及嬰幼兒神經發育的影響

根據發酵乳組和對照組在產后1～5 d，產后42 d 以及產后3～6 個月母親的身體質量指數，發現兩組的母親身體質量指數在產后兩個時間點均沒有統計學差異（P＞0.05）（圖5a，5b，5c）。圖5d 同樣顯示在產后1～5 d，產后42 d 以及產后3～6 個月嬰幼兒的體重增長在兩組中無顯著差異 （P＞0.05）。

圖5 發酵乳干預產后母子身體質量指數和體重Fig.5 Effect of fermented dairy on mother and child's increased body mass index and weight

發酵乳組和對照組產婦在產后42 d 愛丁堡抑郁量表平均得分分別為5.87 和5.80 分（圖6）。發酵乳組有四分之一的人得分超過10 分，有四分之一的人得分低于1.25 分，有一半的人得分是在1.25 和10 分之間；均值高于中位數，說明分值右偏。對照組有四分之一的人得分超過7.4 分，有四分之一的人得分低于2.4 分，有一半的人得分在2.4～7.4 分之間；均值高于中位數，說明分值右偏。發酵乳干預對產后抑郁沒有統計學差異。圖7顯示發酵乳干預對產后42 d 的嬰幼兒精細動作僅具有10%水平上的統計學差異，另外發酵乳干預對產后42 d 嬰幼兒的溝通、粗大動作、解決問題、個人-社會方面的影響不具有統計學差異。

圖6 發酵乳干預產后42 d 愛丁堡抑郁量表得分Fig.6 Effect of fermented dairy on scores of Edinburgh postnatal depression scale during the puerperium

圖7 發酵乳干預產后42 d 嬰幼兒ASQ-3Fig.7 Effect of fermented dairy on ASQ-3 for infants during the puerperium

3 討論

本次臨床實驗通過檢測和解析受試人群產后兩個階段的母乳發現，富含益生菌益生元的發酵乳對母乳微生物的結構具有調節作用。在產后42 d，發酵乳組的痤瘡丙酸桿菌、羅斯氏菌、奈瑟氏菌屬顯著減少，痤瘡丙酸桿菌通過表達蛋白酶，使受體、TNF-α、TLR 活化，激活先天性免疫反應以及角質細胞表達IL-8/12/1、基質金屬蛋白酶，導致毛囊皮脂腺角化過度[28]。羅斯氏菌可能會導致炎癥性腸病的發生[29]，奈瑟氏菌屬與胰腺癌風險增加有關[30]。另外，不論是在產后42 d，還是產后3～6個月，酸奶組中的鏈球菌屬相對豐度均顯著下降，有研究發現鏈球菌屬屬于“促癌菌”，該菌可以通過抑制免疫，從而刺激促炎細胞因子的釋放，或者直接與癌細胞互作，刺激癌細胞增殖[31]。本項研究表明發酵乳干預對產后3～6 個月的母乳中的真蛋白具有顯著促進作用。真蛋白包括α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、溶菌酶等，α-乳白蛋白具有調節乳糖合成及乳汁分泌的作用[32]，乳鐵蛋白可抗真菌、抗病毒、抗氧化等[33]，溶菌酶具有增強新生兒抗感染能力的作用[34]，研究表明真蛋白的合成主要受到乳腺代謝通路的影響，受膳食作用較小。因此，發酵乳干預是否改善了乳腺的代謝通路，以及干預母乳微生物和宏量成分的機制還需進一步研究。本項臨床實驗研究發現，相較于對照組，發酵乳組在ASQ-3 溝通、粗大動作、解決問題等方面不具有顯著差異性，這主要是因為嬰兒的神經心理發育受到多種因素的影響。因此，本研究說明富含益生菌益生元的發酵乳通過調整母乳的菌群結構、宏量成分等營養組成，具有提高嬰幼兒神經心理發育的潛在作用，具有一定的科學研究價值和前景。