ε-聚賴氨酸鹽酸鹽對貯藏期間雙孢蘑菇表面微生物生長和保鮮的影響

魏 奇，李 婕，劉蓓蓓，羅小芳，方 婷，陳炳智，江玉姬*

（1 寧德師范學院生命科學學院 福建寧德 352100 2 福建農林大學食品科學學院 福州 350002）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus），俗稱紐扣蘑菇或白蘑菇，是一種高蛋白、低脂肪的食用菌，因味道鮮美、營養豐富而倍受各國人們的青睞。然而，采收后的雙孢蘑菇含水量較高（90%），組織結構柔軟，呼吸強度高，仍然有強烈的生理代謝活動。雙孢蘑菇在環境因素和微生物的作用下，比較容易發生色澤和風味的改變。雙孢蘑菇的質地柔嫩，在貯運和市場銷售過程中也更加容易受到機械損傷，從而導致雙孢蘑菇產生褐變和腐爛，不利于長期貯存[1]。

ε-聚賴氨酸鹽酸鹽（ε-PL）這種功能性多肽由多個賴氨酸殘基聚合而成，主要從鏈霉菌屬的代謝產物中獲得。較多文獻報道：ε-PL 具有廣譜抑菌的特性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌等具有抑制作用[2]。ε-PL 作為天然防腐抑菌劑，對人體安全無毒，在食品中應用具有良好的前景。早在2003年，FDA 就批準ε-PL 為安全食品保鮮劑，我國于2014 批準ε-PL 用于蔬果保鮮[3]。目前有關ε-PL 對食用菌的保鮮研究較少。預測微生物學模型是一種快速、高效的評估微生物生長潛力或預測特定條件下微生物生長的方法，被認為是評估產品貨架期和食品安全的重要工具，以執行危害分析并設置關鍵控制點，進一步制定風險評估計劃[4]。在食品加工和儲存過程中，預測微生物學模型可以用于描述致病或腐敗微生物的生長行為，其中，時間是重要的參數之一[5]。

目前，雙孢蘑菇常用的保鮮方法是低溫貯藏。本課題組前期研究雙孢蘑菇表面微生物群落的動態變化和優勢腐敗菌，發現雙孢蘑菇表面主要的腐敗微生物為假單胞菌[6]。假單胞菌是常見的腐敗微生物，可通過引起雙孢蘑菇褐變、斑點和腐敗而顯著降低其品質[7]。據報道，傘菌假單胞菌（Pseudomonas agarici）是引起雙孢蘑菇表面斑點的主要因素[8]。Gill 等[9]研究表明托拉斯假單胞菌（Pseudomonas tolaasii）會引起雙孢蘑菇褐斑病。有文獻[10]報道：4 ℃并不能完全抑制假單胞菌的生長繁殖，在食品冷藏條件下假單胞菌比其它腐敗細菌的生長速率快，僅采用低溫貯藏措施不能完全抑制雙孢蘑菇表面假單胞菌的增長。雙孢蘑菇在生產運輸、貯藏銷售的過程中，常被置于溫度相對較高的環境下，加速了微生物的生長繁殖[11]。本研究利用低溫結合ε-PL，研究其對雙孢蘑菇表面微生物生長的影響，建立貨架期預測模型，為雙孢蘑菇的保鮮提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

試驗所用的食用菌子實體（雙孢蘑菇）由福建省漳州市同發食品工業有限公司提供。

細菌菌種：托拉斯假單胞菌（Pseudomonas tolaasii）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、米氏假單胞菌（Pseudomonas migulae）和傘菌假單胞菌（Pseudomonas agarici）為雙孢蘑菇表面分離得到[6]。

蛋白胨粉（Peptone），杭州微生物試劑有限公司；腦-心浸出液肉湯、胰蛋白胨大豆瓊脂、假單胞菌CFC 選擇性培養基（CFC），青島海博生物技術有限公司；ε-聚賴氨酸鹽酸鹽，浙江新銀象生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

B-CYD2022L 無菌采樣袋，比克曼生物科技有限公司；MX-S 混勻儀，北京興創實驗儀器（北京）股份公司；JZ-1 拍擊式均質機，拓赫機電科技（上海）有限公司；Megafuge 8 離心機，上海賽默飛世爾科技有限公司；MGC-100 光照培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；TMS-PRO 質構儀，美國FTC 公司；ADCI-60-C 全自動測色色差計，北京辰泰克儀器技術有限公司；MB25 水分測定儀，奧豪斯有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌液的制備 4 株假單胞混合菌液制備參考李長城[12]的方法，接種至雙孢蘑菇的混合假單胞菌液濃度為107～108CFU/mL。

1.3.2 樣品處理 選擇外觀潔白，大小一致，無褐變和機械損傷的新鮮雙孢蘑菇。一部分用5 kGy劑量輻照處理，用來測定假單胞菌的生長情況；另一部分置于4 ℃條件下存放，用來測量背景菌的生長情況。在無菌條件下，將質量濃度為0.15 g/L和0.30 g/L 的ε-聚賴氨酸水溶液用噴霧器均勻地噴灑到菇體表面，自然晾干。用無菌均質袋將雙孢蘑菇分裝成質量約為25 g 于無菌均質袋中，其中輻照組需將100 μL 假單胞菌混合菌懸液接種至雙孢蘑菇樣品中，最終雙孢蘑菇樣品中細菌濃度為4.0～5.0 lg（CFU/g），并在所有樣品袋貼上標簽。

1.3.3 培養與計數 參考彭亞博等[13]的方法。背景菌和假單胞菌菌數轉化為以10 為底的對數或自然對數。最終單位以lg （CFU/g）表示。

1.3.4 模型的建立 根據研究表明，采用修正的Gompertz 模型對雙孢蘑菇表面假單胞菌和背景菌群的生長曲線均具良好的擬合精確度[6]。故本文繼續采用修正的Gompertz 模型擬合。表達式如下：

式中：X（t）——t 時刻細菌的菌數，ln（CFU/g）；X0——細菌的初始菌數，ln（CFU/g）；Xmax——細菌的穩定期菌數，ln（CFU/g）；μmax——比生長速率，h-1。

1.3.5 感官評分 參照Lukasse 等[14]進行感官評價的評定。感官評級表見表1。

表1 感官指標評價標準Table 1 Standard of sensory properties

1.3.6 顏色的評價 通過ADCI-60-C 全自動測色色差計測定雙孢蘑菇蓋的黑白度L*值，從而對雙孢蘑菇的顏色進行評價。

1.3.7 硬度評價 采用SMSTA TA.XT plus 質構儀測定雙孢蘑菇的硬度。質構儀的設置參數如下：P/2 探頭；100 g 觸發力；10%壓縮比；1 mm·s-1測前速度；1 mm·s-1測中速度；10 mm·s-1測后速度。

1.3.8 失重率的測定 采用稱量法測定雙孢蘑菇的失重率。M1為貯藏前雙孢蘑菇的質量，g；M2為貯藏后雙孢蘑菇的質量，g。

1.3.9 水分含量的測定 將雙孢蘑菇子實體去柄去菌褶，縱切成1 mm 的薄片，稱取1 g 后采用水分測定儀測定水分含量。

1.3.10 統計學分析 背景菌及假單胞菌生長數據均采用美國農業部東部地區研究中心開發的預測微生物專用軟件IPMP2013（Integrated Pathogen Modeling Program）進行分析。采用SPSS 16.0 軟件進行顯著性差異分析（Duncan 法，顯著水平P≤0.05）。

2 結果與分析

2.1 溫度和ε-PL 濃度對雙孢蘑菇表面微生物生長曲線的影響

由圖1可知，在4，16 和25 ℃時，經過不同濃度的ε-PL （0.15 和0.30 g/L）處理，雙孢蘑菇表面背景菌和假單胞菌的生長曲線有所不同。背景菌和假單胞菌的生長曲線呈現出完整的3 個階段，分別為：遲緩期、對數期和穩定期。雙孢蘑菇表面背景菌群在穩定期的菌落數大于假單胞菌。溫度和貯藏時間微生物的生長具有影響，低溫貯藏則有利于抑制微生物的生長。在16 和25 ℃時，ε-PL對雙孢蘑菇表面背景菌群及假單胞菌生長無明顯抑制作用。在4 ℃條件下，ε-PL 對雙孢蘑菇表面假單胞菌生長有抑制作用，質量濃度為0.30 g/L的ε-PL 對雙孢蘑菇表面假單胞菌生長抑制作用效果最佳。由此可知，低溫條件和ε-PL 協同作用對雙孢蘑菇具有較好的保鮮作用。

圖1 ε-PL 對雙孢蘑菇表面背景菌群及假單胞菌生長的影響Fig.1 The effect the of growth of background microorganisms and Pseudomonas spp.on Agaricus bisporus treated with ε-PL

2.2 溫度和ε-PL 濃度對雙孢蘑菇表面微生物生長速率的影響

由表2可知，不同濃度的ε-PL 對雙孢蘑菇表面背景菌群生長速率影響不大。由圖2可知，不同濃度ε-PL 對雙孢蘑菇表面背景菌群最大生長菌數無顯著影響（P＞0.05）。4，16 和25 ℃時，最大生長菌數分別為7.42，8.35 和8.65 lg（CFU/g）。在4℃時，不同濃度ε-PL 處理后的雙孢蘑菇樣品中假單胞菌最大生長菌數分別為7.42，6.60，6.36 lg（CFU/g）。而4 ℃條件下，添加0.15 g/L 和0.30 g/L濃度ε-PL 的雙孢蘑菇樣品中假單胞菌的比生長速率分別為0.026 h-1和0.017 h-1，明顯低于對照組0.035 h-1，表明在4 ℃條件下，質量濃度0.15 g/L和0.30 g/L 的ε-PL 對雙孢蘑菇表面假單胞菌生長有抑制作用。

圖2 雙孢蘑菇表面背景菌群及假單胞菌在不同溫度、濃度ε-PL 下最大生長菌數Fig.2 The maximum bacterial populations of background microorganisms and Pseudomonas spp.on Agaricus bisporus at different temperature and different concentrations of ε-PL

表2 溫度和ε-PL 濃度對雙孢蘑菇表面背景菌群和假單胞菌生長速率影響Table 2 Effects of temperature and concentrations of ε-PL on the growth rate of background microorganisms and Pseudomonas spp.on Agaricus bisporus

16 ℃時，不同濃度ε-PL 對雙孢蘑菇樣品中假單胞菌最大生長菌數分別為8.18，8.28，8.35 lg（CFU/g）。在16 ℃條件下，添加0.00，0.15 和0.30g/L 質量濃度ε-PL 的雙孢蘑菇樣品中假單胞菌的比生長速率分 別：0.200，0.243 和0.233 h-1，ε-PL對其抑制效果無顯著性差異（P＞0.05）。

在25 ℃時，最大生長菌數分別為8.65，8.64，8.55 lg（CFU/g）。而25 ℃下，添加0.00，0.15 和0.30 g/L 質量濃度ε-PL 的雙孢蘑菇樣品中假單胞菌的比生長速率分別：0.569，0.655 和0.523 h-1，說明0.00～0.30 g/L 質量濃度ε-PL 對其抑制效果無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 不同溫度、ε-PL 濃度條件下雙孢蘑菇貨架期方程

從微生物的角度來說，背景菌群的生長動力學模型可以反映產品的貨架期，表3列出了不同溫度和不同濃度ε-PL 下雙孢蘑菇貨架期方程，可為評價雙孢蘑菇相關產品的貨架期提供參考。

表3 雙孢蘑菇的貨架期方程Table 3 The shelf life equation of Agaricus bisporus

2.4 低溫（4 ℃）條件下ε-PL 濃度對雙孢蘑菇品質的影響

ε-PL 是一種多肽類的天然保鮮劑，抑菌性能良好，且對人體安全無害。ε-PL 處理對雙孢蘑菇感官評價如圖3所示。第0 天時，經0.15 和0.30 g/L 質量濃度ε-PL 處理的雙孢蘑菇與對照組（0.00 g/L）相比，無明顯差別，說明ε-PL 對雙孢蘑菇的外觀品質沒有影響。在貯藏溫度為4 ℃的條件下，雙孢蘑菇的感官評分隨著貯藏時間的增加而降低。在貯藏時間為第8 天時，雙孢蘑菇具有明顯開傘的情況，菇體外觀顏色變暗，菇體產生異味，出現褐變和腐爛，食用品質下降，失去商品價值。

圖3 雙孢蘑菇貯藏期間感官評價變化情況Fig.3 Sensory evaluation of Agaricus bisporus during storage

2.5 不同ε-PL 濃度處理對雙孢蘑菇白度的影響

雙孢蘑菇菌蓋的潔白與否是消費者判斷雙孢蘑菇品質的重要指標。采收后的雙孢蘑菇菌蓋較容易發生褐變，會導致雙孢蘑菇中的營養物質流失，降低雙孢蘑菇的品質，影響其商品價值。L*值越高提示雙孢蘑菇褐變程度越低。如圖4所示，不同處理組的L*值均呈現不斷降低的現象。經0.00，0.15 和0.30 g/L 質量濃度的ε-PL 處理的雙孢蘑菇的L*初始值分別為84.24，84.61，84.86，無顯著性差異（P＞0.05）。對照組（0.00 g/L）的L*值下降速率較快，貯藏4 d 后L*值從84.24 降到76.26，而0.30 g/L 質量濃度的ε-PL 處理組貯藏4 d 時的L*值為78.02，顯著高于對照組（P＜0.05）。由此可知，ε-PL 處理能夠延緩雙孢蘑菇的褐變。貯藏第6 天時，對照組與處理組的L*值均降至75以下。

圖4 雙孢蘑菇貯藏期間白度值變化情況Fig.4 The value of L* on Agaricus bisporus during storage

2.6 不同ε-PL 濃度處理對雙孢蘑菇硬度的影響

硬度是判定雙孢蘑菇品質的一項重要指標。新鮮程度較高的雙孢蘑菇組織結構緊密，其菇體內含水量高可以較好地維持細胞膨壓，因此菇體的硬度值也較高[15]。雙孢蘑菇在貯藏期間，由于呼吸作用和蒸騰作用，菇體的水分會逐漸減少，并且菇體產生自溶，導致雙孢蘑菇的硬度降低[16]。據報道，雙孢蘑菇采后貨架期短，易受微生物侵染，腐敗細菌（如假單胞菌）產生的酶能夠降解菇體的細胞壁，分解細胞內基質，使細胞產生破裂，膨壓發生改變，導致菇體組織結構變軟，硬度降低[17-19]。由圖5可知，與對照組相比，在第2，4，6，8 和10 天時，經過ε-PL 處理后，雙孢蘑菇的菇體硬度能夠顯著提高（P＜0.05）。第8 天時，對照組的硬度指標減少了21.76%，而0.15 和0.30 g/L 的ε-PL 處理組僅分別下降了11.72%和6.25%。由此說明，ε-PL 處理可以保持雙孢蘑菇較高的硬果，有一定的保鮮效果。

圖5 ε-PL 對貯藏期間雙孢蘑菇硬度的影響Fig.5 The effect of hardness on Agaricus bisporus treated with ε-PL during storage

2.7 不同ε-PL 濃度處理對雙孢蘑菇水分含量和失重的影響

雙孢蘑菇子實體中含水量高，據報道，失重率達到5%時，雙孢蘑菇菇體會產生皺縮，增加PPO等酶的活力，由此加速雙孢蘑菇的褐變。雙孢蘑菇的失重的主要原因是水分蒸騰作用。由圖6和圖7所示，4 ℃貯藏期間，經0.00，0.15 和0.30 g/L 質量濃度的ε-PL 處理的雙孢蘑菇的初始水分含量分別為92.21%，92.38%，93.43%，無顯著性差異（P＞0.05）。失重率的上升與水分含量的下降屬于對應關系。隨著貯藏時間的延長，雙孢蘑菇的失重率逐漸增大，而水分含量逐漸減小。在貯藏期間，與對照組相比，ε-PL 處理的雙胞蘑菇其水分含量高于對照組，但沒有顯著差異（P＞0.05）；并且能夠減緩雙孢蘑菇的質量損失。

圖6 雙孢蘑菇貯藏期間失重率變化情況Fig.6 The weight loss rate of Agaricus bisporus during storage

圖7 雙孢蘑菇貯藏期間水分含量變化情況Fig.7 The moisture content of Agaricus bisporus during storage

3 討論

物理方法對設備要求較高?；瘜W方法具有成本低和保鮮效果好的特點，但是化學殘留物具有不可避免的毒副作用。因此，高效無毒的天然保鮮劑在雙孢蘑菇的應用前景十分廣闊?；艚÷數萚19]研究發現超高壓與ε-PL 處理能夠有效保持鰹魚色澤，延長鰹魚的貨架期。但目前聚賴氨酸對于食用菌的保鮮研究相對較少。因此，本研究通過探究恒溫（4～25 ℃）條件下不同質量濃度的ε-PL（0.00，0.15 和0.30 g/L）添加量處理對雙孢蘑菇表面背景菌群和假單胞菌生長的抑制作用，并建立相應的貨架期預測模型，結合感官、色澤、質地、失重情況、水分變化等指標，綜合探討ε-PL 在不同溫度條件下對雙孢蘑菇的保鮮效果。研究發現，在4，16 和25 ℃時，雙孢蘑菇在不同質量濃度的ε-PL（0.15 和0.30 g/L）作用下，背景菌群及假單胞菌的生長曲線呈現出完整的3 個階段。在4 ℃條件下ε-PL 對雙孢蘑菇表面假單胞菌生長有抑制作用，質量濃度為0.30 g/L 的ε-PL 對雙孢蘑菇表面假單胞菌生長有顯著抑制作用（P＜0.05）。周祺等[20]研究表明：ε-PL 對腸球菌具有抑制作用。肖媛等[21]研究發現，經過ε-PL 處理，能夠降低柑橘果實酸腐病的損傷接種發病率和病斑直徑，破壞柑橘酸腐病細胞膜的完整性，抑制菌體細胞的生長繁殖，由此表明ε-PL 具有良好抑菌的作用。在16 ℃和25 ℃條件下ε-PL 對雙孢蘑菇表面背景菌群和假單胞菌生長無顯著性差異（P＞0.05）。在4 ℃條件下，不同質量濃度的ε-PL（0.15 和0.30 g/L）處理的雙孢蘑菇感官品質、L*值、硬度和水分含量隨著貯藏時間的增加而逐漸下降，失重率隨著貯藏時間的延長逐漸減小。雙孢蘑菇的褐變與菇體內的酚類物質氧化及微生物有著密切的關系[22]。本研究發現：與對照組相比，ε-PL 能夠提高雙孢蘑菇的硬度和持水性，延緩菇體發生褐變，對延長雙孢蘑菇的貨架期具有積極的作用。研究報道表明ε-PL 可以提高櫻桃，鮮切菠菜等果蔬的貯藏品質，并且延長其貨架期[23-24]。綜上所述，在4 ℃條件下，質量濃度為0.30 g/L 的ε-PL 對雙孢蘑菇表面假單胞菌生長有顯著抑制作用，并且ε-PL 處理可以提高雙孢蘑菇的品質，延長雙孢蘑菇的貯藏期。

注：圖中不同字母表示在0.05 水平上差異顯著，相同字母表示差異不顯著。