復合益生素對熱應激肉雞腸道功能的影響

■李相安 鄒本革 王 政 王文博

（1.青島農業大學海都學院，山東 煙臺 265200；2.青島根源生物技術集團有限公司，山東 青島 266000）

白羽肉雞代謝能力強、產熱多，散熱能力弱，養殖密度大，過度依賴設備通風散熱[1-2]，夏季散熱不充分容易導致熱應激，是現代白羽肉雞養殖損失的主要原因之一[3-5]。

發生熱應激時，肉雞血液動員至呼吸、表皮系統參與散熱，相應其他組織血量減少，長期導致組織缺血，對于消化系統來說，主要引起腸道內皮細胞之間緊密連接破壞，引起腸道屏障功能減弱[6-7]，進而出現大分子通透性增加，誘發炎癥反應[8]，最終導致機體過度消耗出現其他癥狀甚至死亡，造成養殖損失。

緩解熱應激的方法分內外調節兩種：外部調劑主要包括畜舍設計、通風、灑水、遮蔽等，通過降低環境溫度或提高散熱效率來減少環境熱影響；內部調節有飼料配方和飼料添加劑兩種，飼料配方調節主要是降低粗蛋白含量，減少消化產熱；文獻報道可見的緩解熱應激的飼料添加劑有益生素[9-11]、抗生素、抗氧化劑、維生素、礦物質、益生素、精油等。

其中益生素緩解熱應激的機理研究較少，多數學者認為益生素從下調致炎因子表達、改善腸道屏障功能[12]以及緩解宿主氧化應激[13]等幾個方面緩解熱應激的副作用，從而提高動物生產性能。

采食量、生產性能是養殖現場對熱應激損傷的重要評價指標；上皮細胞緊密連接、黏液素mRNA 相對表達水平能側面反映腸道損傷情況；腸黏膜致炎因子、抑炎因子、Toll樣受體和核因子κB（NF-κB）mRNA相對表達水平可以反饋熱應激狀況對腸道的影響；而血清抗氧化指標水平和熱休克蛋白70（HSP70）mRNA相對表達水平可以反映熱損傷后修復情況。

熱應激條件下益生素對動物生產性能、腸道屏障功能及抗氧化能力的影響的綜合數據少見報道。因此本試驗選取復合益生菌作為熱應激修復劑，以基礎日糧為對照組，觀察益生素在熱應激條件下對白羽肉雞生產性能、腸道屏障及有益微生物豐度、炎癥反應、熱應激修復等幾個方面的影響，為實際生產應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用復合益生素制劑1（地衣芽孢桿菌1.31×1010CFU/g、凝結芽孢桿菌1.80×1010CFU/g）、復合益生素制劑2（凝結芽孢桿菌1.80×1010CFU/g、酪酸菌2.45×108CFU/g）和復合益生素制劑3（地衣芽孢桿菌1.31×1010CFU/g、凝結芽孢桿菌1.80×1010CFU/g、酪酸菌2.45×108CFU/g）由青島某生物公司提供。試驗所用白羽肉雞（ROSS）來自于當地農場（山東青島）。

1.2 試驗設計

試驗于2019年11月在青島根源研發中心動物實驗室進行，1日齡白羽肉雞240羽，分為4個處理組：對照組、益生素1組、益生素2組和益生素3組。

每個處理組3個重復，每個重復20羽，公母各半，自由采食和飲水。1 日齡環境溫度（35.0±1.1）℃、相對濕度（65±5）%，之后每周降低2.8 ℃，21 日齡達26.7 ℃、相對濕度（65±5）%。22 日齡開始熱應激處理：每天9：00～17：00 熱風爐調節至環境溫度為35 ℃、相對濕度75%；17:00～次日9：00 自然通風，至42日齡試驗結束。

試驗結束統計各處理組生產性能，并且每個處理組隨機選取6 羽雞屠宰采樣分析。所有試驗操作在青島農業大學動物倫理委員會監督下進行。

1.3 日糧組成及營養水平

試驗所用飼料參考NRC（1998）肉用仔雞的飼養標準，基22～42日齡基礎日糧組成和營養水平見表2。

表1 試驗分組

表2 試驗日糧組成及營養水平（干物質基礎）

1.4 飼養管理及生產性能記錄

每日8：00、14：00分別記錄環境溫度和濕度。每周統計耗料，同時進行稱重，計算平均日采食量、死淘率、平均體重和料重比。

1.5 樣品采集及測定指標

各組隨機選取6羽白羽肉雞頸動脈放血屠宰，取空腸中段，刮取內側黏膜檢測腸黏膜致炎因子、抑炎因子等；另取盲腸腸道內容物用于腸道有益微生物豐度分析；并另取一段空腸樣品，用無菌生理鹽水沖凈后用液氮冷凍并保存于-80 ℃以測定上皮細胞緊密連接、黏液素和HSP70 mRNA相對表達水平。

1.5.1 DNA提取和測序

采用腸道內容物基因組DNA提取試劑盒提取各組肉仔雞盲腸內容物微生物總DNA，每組高通量測序樣本數為6個。按指定測序區域（16S rDNA V3～V4區）合成帶有barcode 的特異性引物，構建Illumina PE250文庫后上機，由上海凌恩生物科技有限公司進行高通量測序。利用Illumina PE250 平臺測序得到的PE reads 根據overlap 關系進行拼接，并對序列質量進行品控和過濾，區分樣本后進行操作分類單元（OTU）聚類分析和物種分類學分析?；诜诸悓W信息，在各分類水平上進行群落結構的統計分析。

1.5.2 血清抗氧化指標測定

頸動脈放血，4 ℃留置，析出血清檢測超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化酶（CAT）和丙二醛（MDA）含量（上海紀寧實業有限公司，上海）。

1.5.3 mRNA相對表達水平測定

試劑盒提取空腸黏膜或空腸樣品總RNA（RNA Extraction Kit，TakaRa），免疫因子引物序列如表3所示。

表3 實時定量PCR使用引物序列

1.6 統計分析

試驗數據經Microsoft Excel 軟件初步處理后，利用SPSS 16.0統計軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 生長性能（見表4）

如表4 所示，各益生素組均重、平均日采食量均高于對照組（P＞0.05）。除益生素2 組外，各益生素組的死淘率、料重比均低于對照組（P＞0.05）。

表4 熱應激對各處理組白羽肉雞生長性能的影響

2.2 腸道屏障（見表5、表6）

表6 熱應激對各處理組白羽肉雞空腸樣品黏液素mRNA相對表達水平的影響

由表5 可知，益生素組ZO-1 mRNA 相對于對照組顯著降低（P＜0.05），且益生素各組E-cadherin 和Occlaudin mRNA 相對表達水平平均值低于對照組（P＞0.05），表明受熱應激影響，對照組緊密連接蛋白E-cadherin、Occlaudin 和ZO-1 mRNA 相對表達水平升高，而3種復合益生素都能有效緩解由于熱應激造成的雞腸道緊密連接蛋白的劇烈變化。

表5 熱應激對各處理組白羽肉雞空腸樣品緊密連接蛋白mRNA相對表達水平的影響

由表6 可知，3 個益生素組MUC-2 和MUC-5ac mRNA 相對表達水平顯著低于對照組（P＜0.05），表明受熱應激影響，對照組MUC-2 和MUC-5ac mRNA 相對表達水平升高，而3種復合益生素都能有效緩解由于熱應激造成的雞腸道上皮細胞黏液素分泌的劇烈變化。

2.3 炎癥反應及有益微生物豐度（見表7～表10）

表7 熱應激對各處理組白羽肉雞空腸黏膜致炎因子mRNA相對表達水平的影響

表8 熱應激對各處理組白羽肉雞空腸黏膜抑炎因子mRNA相對表達水平的影響

表9 熱應激對各處理組白羽肉雞空腸黏膜Toll樣受體及NF-κB mRNA相對表達水平的影響

表10 熱應激對各處理組白羽肉雞腸道食糜乳酸菌及大腸桿菌-志賀氏菌屬豐度的影響（%）

益生素組iNOS mRNA的相對表達水平顯著低于對照組（P＜0.05），各組之間致炎因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA相對表達水平無顯著性差異（P＞0.05），益生素組mRNA 相對表達水平均值低于對照組（表7），表明復合益生素能夠降低熱應激條件下白羽肉雞腸道黏膜中致炎因子相對表達水平。

益生素1、2 組各抑炎因子相對表達水平均低于對照組，益生素3 組IL-10 mRNA 相對表達水平與對照組相比沒有顯著性差異（P＞0.05），表明復合益生素能降低熱應激條件下白羽肉雞腸道黏膜中致炎因子和抑炎因子mRNA相對表達水平。

益生素組NF-κB 相對表達水平顯著低于對照組（P＜0.05）；益生素組TLR-5 mRNA相對表達水平顯著低于對照組（P＜0.05）。3個益生素組乳酸桿菌豐度顯著高于對照組（P＜0.05），而大腸桿菌-志賀氏菌屬豐度顯著低于對照組（P＜0.05）（見表10），表明益生素的添加改善了白羽肉雞腸道有益微生物豐度。

2.4 熱應激修復（見表11、表12）

表11 熱應激對各處理組白羽肉雞空腸樣品熱應激蛋白mRNA相對表達水平的影響

表12 熱應激對各處理組白羽肉雞血清抗氧化指標的影響

益生素組HSP70 mRNA 相對表達水平平均值高于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。益生素2 組HSP90 mRNA 相對表達水平顯著高于其他各組（P＜0.05）。益生素組血清抗氧化指標SOD、GSH-Px、TAOC 水平顯著高于對照組（P＜0.05），MDA 水平低于對照組。本試驗中益生素2 組和益生素3 組MDA 水平顯著低于對照組，益生素1組MDA水平與對照組相比沒有顯著性差異（P＞0.05），但是平均值低于對照組，表明益生素提高了白羽肉雞的抗氧化能力。

3 討論

高溫季節肉雞發生熱應激表現為采食量減少[14]、飼料利用率低[15-16]等，是養殖損失的重要原因之一。熱應激時血液優先供應皮膚及呼吸系統散熱，導致其他器官血液供應不足。熱應激誘發腸道損傷的機理一般認為是缺血[17-18]引起腸壁細胞通透性、緊密連接破壞，導致腸道屏障破壞，外源物質進入循環系統誘發炎癥[19-20]，進一步影響代謝及動物健康。

生產性能方面，熱應激狀況下肉雞機體調動能量降溫，表現為食欲下降，料重比升高，這一點從采食量、均重、料重比等方面數據有體現；本試驗結果表明益生菌對熱應激后的動物生產性能有提高作用，與Parisa 等[21]、Sun 等[22]報道相符合，驗證了復合益生素有助于提高熱應激狀況下白羽肉雞的均重；本試驗益生素組體重增加較大，所以料重比與對照組相比差異不大。

在熱應激缺血導致腸道細胞旁通透性增加、屏障破壞[23-26]，本試驗結果表明復合益生素降低白羽肉雞空腸緊密連接蛋白、黏液素mRNA 的相對表達水平，該結果與Zhang等[12]報道存在不一致。Soheil等[20]認為E-cadherin、Claudin-5 和ZO-1 mRNA 表達水平顯著升高，是因為Cadherins 蛋白表達水平降低后宿主產生的補償效應。結合本試驗結果分析認為對照組緊密連接蛋白和黏液素mRNA相對表達水平升高，反映出對照組的熱應激應答反應較為劇烈，復合益生素則有效維護了腸道屏障功能。另外添加益生素能有效地改善腸道有益微生物豐度，為動物腸道屏障增加一層保護。

本試驗熱應激條件下益生素組致炎因子mRNA相對表達水平降低，而且抑炎因子mRNA相對表達水平降低，表明復合益生素不僅降低了致炎因子mRNA的相對表達水平，同時維持了腸道致炎因子和抑炎因子之間的平衡[10-11，23]。

試驗中3 個益生素組HSP70 mRNA 相對表達水平平均值高于對照組（P＞0.05）、血清抗氧化指標均優于對照組（P＜0.05），表明飼料中添加3 種復合益生素緩解了由熱應激造成的動物機體氧化損傷[10-11，23]，且機體修復能力[27-29]優于對照組。

綜上所述，復合益生素有效緩解了由熱應激導致的屏障功能損傷、腸道炎癥反應和氧化應激，有利于提高白羽肉雞的均重。無論是熱應激還是病理應激，首先受到影響的是動物的腸道屏障，繼而免疫功能被激活并造成生產性能下降，因此增強動物腸道屏障的防御能力，減少動物感染的概率是后抗生素時代保障動物生產性能的前提條件。本研究結果可為日糧調控改善高溫條件下雞群的腸道健康及保障肉雞的生長提供參考，具有重要的實際應用意義。