鋅指蛋白調控機體炎癥信號通路的研究進展

陳可添，黎力之，幸清鳳，廖曉鵬，關瑋琨，文龍，張海波*，郭冬生*

（1.宜春學院生命科學與資源環境學院，江西省高等學校硒農業工程技術研究中心，宜春市功能農業與生態環境重點實驗室，宜春學院繼續教育學院，江西宜春 336000；2.江西正宇生物科技有限公司，江西宜春 336000）

1985 年，Miller 等首次發現轉錄因子IIIA 中鋅指結構在基因調控方面起重要作用，并將含有鋅指結構的蛋白命名為鋅指蛋白。鋅指蛋白基因敲除小鼠會逐漸出現惡病質、自身免疫性疾病、不完全性脫毛、關節炎和結膜炎等病癥，鋅指蛋白基因全身性敲除小鼠在出生后呈現生長遲緩甚至異常死亡、代謝功能障礙和嚴重低血糖等病況。外源注射10 mk/kg葡萄糖酸鋅可顯著增強大鼠體內鋅指蛋白基因表達，降低骨髓中性粒細胞和二甲基亞砜誘導分化人原髓白血病細胞產生的腫瘤壞死因子-（TNF-），增強機體免疫力。Wu 等研究發現，急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（ALI/ARDS）大鼠補充外源鋅可上調鋅指蛋白表達，顯著降低TNF-、核因子-B（NFB）p65 的表達量，緩解脂多糖誘導的肺部炎癥反應。NF-B 信號通路與Wnt/-catenin 信號通路在調控炎癥反應過程中尤其關鍵，鋅指蛋白對兩者均有調節作用。其一，鋅指蛋白通過擾亂NF-B 抑制蛋白激酶（IKK）和NF-B 抑制蛋白（IB）磷酸化，抑制受體相互作用蛋白1（RIP1）泛素化過程，阻礙NF-B 活化，影響其下游炎癥通路；其二，鋅指蛋白通過抑制糖原合酶激酶-3（GSK-3）磷酸化、與散亂蛋白（Dvl）蛋白競爭性結合支架蛋白（Axin），穩定-catenin 降解復合物完整性，調控炎癥通路。本文就鋅指蛋白介導動物機體炎癥相關通路的調節作用進行綜述，以期在調控動物炎癥方面提供理論參考。

1 鋅指蛋白簡述

1.1 鋅指蛋白概況 鋅指蛋白是一類具有指狀結構域的轉錄因子，用鋅離子螯合劑除去鋅指蛋白中鋅離子或以Fe、Cu、Mn 等金屬離子置換，均會降低鋅指蛋白與DNA、RNA 等結合特異性，破壞蛋白結構穩定性。趙又佼等通過核磁共振發現鋅指蛋白含鋅離子時會折疊成緊密結構，鋅離子夾疊在螺旋和兩股反向平行的鏈之間；去除鋅離子后發現鋅指蛋白肽呈無規則卷曲，鋅指序列無法正常形成，蛋白功能近乎完全喪失。鋅指結構中有充分保守的區域，其結構穩定性主要由鋅離子提供的鏈間交叉連接維持，其缺乏時“鋅指”不能形成折疊結構，鋅離子的存在使鋅指蛋白呈現一個由不同肽序列折疊而成的完美螺旋構象。鋅指蛋白因序列結構分不同構型，具有特異功能，如痘病毒鋅指結構域（POZ）、CXXC 型鋅指結構域（ZF-CXXC）等，鋅指蛋白通過這些結構域特異性識別結合底物，從而調控靶基因表達，影響機體生理功能。

1.2 鋅指蛋白分類 根據功能差異，鋅指蛋白分為RING 蛋白、去泛素分子（DUBs）蛋白、CXXC 蛋白、POZ 蛋白等多個亞家族。RING 鋅指蛋白具有進化上的保守性，與蛋白質互作調控體內靶基因表達。研究發現，轉導通路相關蛋白和體內部分調節蛋白如乳腺癌敏感因子、轉錄中間因子TIF1、原癌蛋白CBL 等都含有RING 鋅指區。DUBs 在泛素化途徑中扮演重要角色，其主要通過水解泛素羧基末端酯鍵、肽鍵或異肽鍵，將泛素分子特異性從鏈接泛素蛋白或前體蛋白中釋放。CXXC 鋅指蛋白家族特有基序ZF-CXXC，由兩對保守富含胞嘧啶集團結合2個鋅離子組成，可特異性識別并結合富含CpG 二核苷酸的DNA 序列。研究表明，人類基因5q31 染色體區缺失型鋅指蛋白基因易發生急性髓性白血病和骨髓增生異常綜合征等疾病，該家族內如鋅指蛋白CXXC4、鋅指蛋白CXXC5除信號傳導、細胞凋亡、細胞能量代謝和血管生成等生物學功能外，還介導Wnt/-catenin 信號通路調控機體免疫。鋅指蛋白ZBTB 亞家族屬于POZ 蛋白家族，該亞家族成員N 端均有一個BTB/POZ 結構域，用以調節蛋白間相互作用；C 端數個CH鋅指結構域，介導蛋白與DNA 序列間的識別、結合作用。該亞家族成員具有轉錄抑制功能，如鋅指蛋白ZBTB20 抑制產生Toll 樣受體4（TLR4）觸發的巨噬細胞前炎性細胞因子和干擾素（IFN-），調節機體免疫功能?？傊?，RING 蛋白、DUBs 蛋白、CXXC 蛋白、POZ 蛋白等鋅指蛋白亞家族本同末異，在NF-B、Wnt/-catenin 通路等途徑中調節機體免疫。

2 鋅指蛋白對動物炎癥通路的影響

2.1 鋅指蛋白對NF-B 通路的調節作用 正常生理條件下，NF-B 以一種無生理活性的二聚體形式存在于胞漿。當機體受到炎性細胞因子或其他外來刺激時，誘導胞質內IB 磷酸化、泛素化而降解，導致胞內NF-B增多，誘使其下游炎性細胞因子合成釋放，機體發生炎癥反應、細胞凋亡等組織損傷現象。鋅指蛋白A20是炎性反應的內源性調控蛋白和組織細胞保護性蛋白，在B 細胞、T 細胞和成纖維細胞中均表達，對NF-B負性調控功能體現在減輕機體炎癥反應及緩解免疫損傷方面。鋅指蛋白A20 作為DUBs 家族中的一員，其N 端含有半胱氨酸蛋白酶/DUB 結構域OUT，C 端含有7個鋅指結構，其中第4 鋅指有E3 泛素連接酶活性，具有去泛素化和泛素化活性的雙重功能。一方面，鋅指蛋白A20 通過N-末端脫泛素因子干擾腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）、RIP1、NF-B 必需調制蛋白（NEMO）等泛素化修飾，抑制下游IB 磷酸化；另一方面，鋅指域C-末端E3 泛素連接酶泛素化修飾TLR、核苷酸結合寡聚化結構域蛋白2（NOD2）、T 細胞抗原受體（TCR）和B 細胞抗原受體（BCR），抑制NF-B 信號通路。

隨著研究的深入，現已確定凡能激活NF-B 信號通路的因素均能誘導鋅指蛋白A20 表達上調。研究發現10 ng/mL TNF-處理大鼠髓核細胞72 h 后，鋅指蛋白A20、p53、p-p65 等表達均顯著提升。急性肝損傷模型小鼠血清和肝組織中TNF-表達較正常組小鼠升高，肝組織白細胞介素1（）、mRNA表達及p-IB和p-NF-B p65 蛋白表達均增加；外源藥物增強鋅指蛋白基因表達后發現小鼠血清和肝組織TNF-濃度降低，肝組織NF-B p65 蛋白升高，mRNA 及p-IB和p-NF-B p65蛋白表達顯著降低。TNF-與受體TNFR2 結合后使其匯集，泛素化RIP1 的K63 位，激活轉化生長因子激酶并與IKK-結合形成復合體，IB發生泛素化，引起NF-B 進入細胞核，激活下游靶基因。上調鋅指蛋白表達可抑制NF-B 信號通路，調控炎癥反應。試驗發現，在TNF 激活的NF-B 信號通路中，鋅指蛋白A20、多聚泛素化鏈和NEMO 形成復合物，利用鋅指蛋白A20 去泛素化功能限制IKK 活化，以及鋅指結構域7（ZnF7）與K63 多聚泛素化鏈結合共同作用使RIP1 被蛋白酶降解；同時，鋅指蛋白A20 還可使TRAF2 泛素化降解，抑制NF-B 信號活化。鋅指蛋白A20 還可阻礙NF-B 作用于IL-1、CD40 的反應，抑制模式識別受體發出的信號及T 細胞、B 細胞抗原受體活化。鋅指蛋白ZBTB20，又稱ZNF288、DPZF或HOF，是BTB/POZ 家族的獨特成員，主要通過N端BTB/POZ 結構域和C 端CH保守的Krüppel 型鋅指作為轉錄抑制因子發揮作用，在機體脾臟、胸腺、淋巴結等組織器官廣泛表達。Liu 等特異性敲除小鼠髓系細胞鋅指蛋白基因，發現多種TLR 配體反應性下降，巨噬細胞產生的炎性細胞因子如TNF、IFN-、IL-6 等減少。另外，鋅指蛋白ZBTB20 通過抑制TLR 下游信號通路中基因轉錄，下調NF-B表達。綜上所述，鋅指蛋白對機體NF-B 的調控機理主要通過下調基因表達，干擾IB 磷酸化，抑制NF-B 活化，減少促炎因子分泌，平衡機體炎癥反應（圖1）。

圖1 鋅指蛋白介導NF-кB 信號轉導通路調節動物腸道炎癥

2.2 鋅指蛋白對Wnt/-catenin 信號通路的影響 Wnt/-catenin 信號通路具有進化保守、高度復雜的特點，由配體蛋白Wnt 和膜蛋白受體結合激發信號轉導通路，調節器官發育、組織穩態及損傷修復等重要過程。外界刺激（如損傷、病原體、激動劑等）使Wnt 信號通路異常，抑制GSK-3活性，導致細胞內-catenin 聚集過多，與T 細胞因子/淋巴增強因子（TCF/LEF）相互作用，引起機體過度炎癥反應。如發生骨關節炎時，Wnt/-catenin 信號通路過表達抑制軟骨細胞增殖及II型膠原蛋白分泌導致軟骨退化，另外還使滑膜成纖維細胞過度增殖，及I 型膠原沉積引起滑膜炎癥。多發性硬化（中樞神經系統炎性脫髓鞘性病變）大鼠模型體內Wnt3、p-GSK-3、-catenin 蛋白水平顯著升高，模型鼠脊髓呈現大量炎性細胞浸潤，TNF-、IL-1等炎癥因子濃度升高。

鋅指蛋白CXXC 家族調控Wnt/-catenin 信號通路，一是當機體處于穩定狀態時，通過降低GSK-3磷酸化，使-catenin 降解保持低值；同時，鋅指蛋白CXXC 過表達抑制Wnt/-catenin 信號通路關鍵蛋白，競爭性拮抗使-catenin 降解復合物免受破壞。在Wnt 配體未激活信號通路時，Axin、腺瘤樣息肉蛋白（APC）、GSK-3和酪蛋白激酶（CK I）組成復合體，使-catenin 磷酸化后被-轉導素重復序列包含蛋白泛素化降解。對膠原蛋白II 誘導的類風濕關節炎大鼠注射GSK-3抑制劑后發現，前列腺素E2,5-羥色胺和組胺等自身活性物質增加，血清中IL-6、IL-12 和TNF-等細胞炎性因子顯著增多。Giacoppo 等建立實驗性變態反應性腦脊髓炎小鼠模型發現，GSK3-活性受到抑制，-catenin上調，入核后調節下游基因表達。正常狀態下鋅指蛋白CXXC4 對GSK-3有保護作用，可抑制GSK-3的磷酸化。李萍等研究發現，鋅指蛋白基因甲基化異常的細胞組中p-GSK-3、Wnt、-catenin 相對量均顯著高于正常組，表明當鋅指蛋白CXXC4 基因被抑制時，GSK-3磷酸化加劇，Wnt/-catenin 通路上調。

當機體發生炎癥反應或受到外界刺激時，Wnt 配體蛋白與卷曲蛋白（FZD）、低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（LRP5/6）結合，形成Wnt-FZD-LRP5/6 三聚體復合物，使細胞內Dvl 蛋白活化并向質膜遷移。研究表明，鋅指蛋白CXXC4、CXXC5 能作為Dvl 蛋白結合伴侶，負反饋調節Wnt/-catenin 信號通路。鋅指蛋白CXXC4 通過其特殊的“KTXXXI”基序直接與Dvl 蛋白PDZ 結構域相互作用，穩定-catenin 降解復合物。鋅指蛋白CXXC5 與Dvl 蛋白相互作用在多種細胞內被發現，如成骨細胞、皮膚細胞、神經干細胞等。Lee 等在皮膚損傷后修復愈合的研究中發現，鋅指蛋白CXXC5 含有C-末端的Dvl 結合結構域，其與Dvl 相互作用，成為Wnt/-catenin 途徑的負反饋調節因子。對生長期小鼠肺成纖維細胞分別添加目的基因腺病毒載體、基因抑制載體感染48 h后發現，添加組-catenin、Dvl 蛋白量顯著減少，抑制組-catenin、Dvl 蛋白表達量顯著增加；此外，在TGF-1 刺激下細胞-catenin、Dvl 蛋白表達增加，添加基因載體后，兩者逐漸減少。表明鋅指蛋白CXXC5 在活化的Wnt/-catenin 信號通路中，過表達影響Dvl 蛋白含量調控-catenin 濃度。綜上所述，當Wnt/-catenin 信號通路無Wnt 配體存在時，鋅指蛋白通過抑制GSK-3磷酸化，穩定-catenin 降解復合物，抑制下游IL-1、TNF-等炎癥因子分泌；當Wnt 配體激活Wnt/-catenin 信號通路，鋅指蛋白與Dvl 蛋白進行競爭性結合，阻礙Dvl 蛋白與Axin-GSK-3作用，間接穩定-catenin 降解復合物，阻斷炎癥過度進程（圖2）。

圖2 鋅指蛋白介導Wnt/β-catenin 信號轉導通路調節動物炎癥

3 總結與展望

在基因炎癥通路中，鋅指蛋白可以調控基因表達，干擾IB磷酸化，抑制NF-B 信號通路，減少炎癥因子分泌。在Wnt/-catenin 信號通路中，鋅指蛋白會抑制GSK-3磷酸化，保持-catenin 降解復合物完整性；另外，鋅指蛋白還會與Dvl 蛋白競爭，保護Axin 蛋白，調控Wnt/-catenin 通路，抑制炎癥反應。目前對鋅指類蛋白的研究主要集中在分析鋅指蛋白結構，建立其與DNA 互作模型。但是關于鋅指蛋白的研究仍存在不足。第一，鋅指蛋白家族龐大種類較多，除對C2H2 型研究較透徹外，其他各類型的結構功能有待深入探索。第二，鋅指蛋白功能研究大多集中在機體免疫炎癥抗腫瘤等方面，在應對一些非生物脅迫如熱應激等環境下相關研究較少。隨著對鋅指蛋白結構和功能研究的不斷深入，闡明鋅指蛋白調控機理，人工鋅指蛋白技術將具有更廣闊的應用前景。