高寒濕地凍融退化下微生物群落特征變化

章妮, 陳克龍, 王恒生, 楊陽

高寒濕地凍融退化下微生物群落特征變化

章妮1,2, 陳克龍2,3,*, 王恒生4, 楊陽1,2

1. 青海師范大學生命科學學院, 西寧 810008 2. 青海省青海師范大學青藏高原地表過程與生態保育教育部重點實驗室, 西寧 810008 3. 青海師范大學科技處, 西寧 810008 4. 合肥師范學院生命科學學院, 合肥 230061

全球變暖大背景下, 大量凍土將面臨進一步退化, 而凍融過程遍布整個青藏高原, 土壤微生物對環境變化更有著高度的敏感性。以青海湖河源濕地濕地凍融退化下的土壤微生物為研究對象, 基于16s rRNA及18s rDNA測序探究凍融退化對土壤微生物群落結構及多樣性的影響。結果顯示: 青海湖高寒濕地有效序列注釋得到1583個細菌操作分類單元以及80個真菌操作分類單元。凍融退化并未改變土壤微生物的優勢菌群: 細菌群落中的優勢菌群均為變形菌門 (Proteobacteria) 及酸桿菌門 (Acidobacteria), 已知的真菌菌群中相對豐度最高的均為子囊菌門 (Ascomycota)。凍融退化使0—10 cm、10—20 cm的細菌群落結構趨于相似, 真菌群落中德福里斯孢屬 ()、擔孢酵母屬 () 的相對豐度顯著減少。凍融退化顯著影響土壤微生物的多樣性, 降低了細菌群落的ACE指數、Chao1指數、Simpson指數以及真菌群落的ACE指數、Chao1指數、Shannon指數, 細菌群落的Shannon指數及真菌群落的Simpson指數有所增加。本研究表明, 凍融退化對土壤微生物的群落結構、多樣性均有影響, 為凍土退化下生態系統作用機制的探究提供參考。

濕地; 凍融退化; 土壤微生物; 高通量測序

0 前言

微生物因其具有類群豐富且多樣的特征, 成為土壤生物體不可或缺的一部分。它主要作用于土壤生態系統的功能和調控方面, 如植物營養的釋放與再吸收、分解植物凋落物、碳氮循環等[1]。在濕地生態循環系統中, 微生物更是作用于生態系統內外的諸多方面, 對生態系統內部而言,它作用于物質循環、能量流動和維持系統穩定性等方面, 對外部而言, 它在廢物處理、生態修復、氣體調節和生物多樣性保護方面也發揮著重要作用[2-3]?，F有研究表明, 土壤微生物對微環境的高敏感性可令其作為優于土壤總有機質的環境指示因子, 而其對外界環境的早期響應指標即生物量和群落結構的變化[4-6]。青藏高原的濕地面積高達13.19萬平方千米[7], 青海湖位于青藏高原東北部, 其高寒濕地因環境條件的復雜性、地理位置的獨特性導致生態系統脆弱而敏感[8-9], 因而對濕地的微生物特征的研究極其重要。

凍融作用對土壤微生物的生命活動、群落結構、多樣性以及生物量都有影響[10-15], 青藏高原作為平均海拔超過4000米的高海拔地區, 凍融現象分布廣泛[16]。多年凍土面積為106萬平方千米, 季節凍土面積更是達到了146萬平方千米[17-18]。IPCC最新報道指出, 截止到本世紀末, 全球地表平均溫度上升了約1.5－2.0 ℃, 從2018－2100年全球氣溫將上升0.8—4.3 ℃[19]。全球變暖的大背景下, 青藏高原凍融交替將更加頻繁, 大量凍土可能面臨進一步退化。但凍融退化下的微生物群落結構以及多樣性的變化還鮮有報道。本次研究旨在探究高寒濕地凍融退化下的土壤微生物群落結構以及多樣性的變化, 以期進一步了解濕地生態系統作用機制, 更深層次的剖析濕地生態系統中生物與環境因子之間的偶聯關系。

1 研究區概況

瓦顏山觀測站 (37°43′38.03′′—37°46′20′′N、100°01′58.87′′—100°05′04. 17′′E) 位于青海湖北岸距剛察縣52 km的沙柳河上游支流源頭處, 為典型的河源濕地。該區的平均海拔為3720—3850 m, 屬高原大陸性氣候, 多年平均溫度為－3.31 ℃, 日均最高氣溫為11.87 ℃, 最低為－19.73 ℃, 年降水量為420.37 mm, 且該區為高寒草甸, 植被以小嵩草 () 為主。

2 材料與方法

2.1 土壤樣品的采集

于2019年8月進行土壤樣品的采集, 本次實驗設置三個重復, 在自然狀態 (Wck) 未退化土壤以及凍融退化 (WD) 區分別每隔0.5 m圍三個樣方, 即Wck1、Wck2、Wck3、WD1、WD2、WD3。用直徑為4.5 cm土鉆在每個樣方采用五點法取樣, 取0—20 cm土層土樣(0—10 cm、10—20 cm), 同層土壤混勻、過篩, 裝到10ml的EP管中。最終標記為Wck1-1、Wck1-2、Wck2-1、Wck2-2、Wck3-1、Wck3-2、WD1-1、WD1-2、WD2-1、WD2-2、WD3-1、WD3-2, 置于液氮罐用于北京組學生物科技有限公司的高通量測序。以ck1、ck2、D1、D2表示不同分組的不同土層。

2.2 研究方法

2.2.1 土壤微生物群落結構及多樣性測定

提取樣品的總基因組DNA后, 選擇細菌的兩個高變區(V3+V4區)以及真菌的ITS區(ITS1, ITS2)通過保守區設計引物進行PCR擴增, 再對V3、V4區以及ITS區進行高通量測序分析。首先采用Mio-bio公司的土壤微生物總DNA提取試劑盒 (PowerSoil DNA Isolation Kit) 對DNA進行抽提, 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量, －80℃保存合格DNA, 用于后續的PCR擴增過程。再對細菌16s RNA的V3+V4區以及真菌的ITS區域進行擴增, 正向引物分別為5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’和5’-CTTGGTCA-TTTAGAGGAAGTAA-3’, 反向引物分別為5’- GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’和5’-GCTGCG-TTCTTCATCGATGC-3’。采用50 μL反應體系進行PCR擴增, 擴增程序為: 預變性1 min(98 ℃), 進行(98 ℃, 10 s; 50 ℃, 30 s; 72 ℃, 30 s)的30個循環; 72 ℃, 5 min, 10 ℃保溫。PCR擴增后再次用瓊脂糖凝膠電泳對產物質量進行檢測。

2.2.2 數據分析處理

PCR擴增產物經純化、定量、均一化形成測序文庫, 質檢后Illumina 測序平臺進行文庫測序, 原始文件由堿基識別(Base Calling)轉化得到原始測序序列(Sequenced Reads)。FLASH v1. 2. 7軟件[20]進行PE reads 拼接得到原始Tags數據(Raw Tags), Trimmomatic v0. 33軟件[21]、UCHIME v4. 2軟件[22]對Raw Tags過濾并去除嵌合體得到Effective Tags, QIIME(Version 1.9.1)[23]在序列的相似性高于97%的程度上分別基于Silva(細菌)[24]和 UNITE(真菌)[25]聚類得到OTU數目以及韋恩圖, 同時生成不同分類水平的物種豐度表。利用 R 語言工具繪制群落結構圖并進行Heatmap聚類分析, 采用Mothur軟件[26]評估α-多樣性, Qiime軟件進行β-多樣性分析, Circos繪制物種豐度與樣品相互關系圖。SPSS 21.0進行ANOVA單因素分析, 對組間及組內數據作顯著性檢驗。Excel 2018進行統計圖的繪制。

3 結果與分析

3.1 土壤微生物樣品稀釋曲線

稀釋曲線是基于OTU對樣品進行質控過濾, 驗證樣品覆蓋度的合理性。絕大多數樣品的稀疏曲線為平緩趨勢(圖1), 表明細菌和真菌的測序數量使得OTU已經達到了飽和, 即再次增加測序深度后, OTU的數量不會產生波動。

3.2 凍融退化下土壤微生物群落結構變化

高通量測序得到24個不同門的細菌類群, 可明確所測樣品中中變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)均為優勢種群, 兩菌群豐度占比分別為51%和20%, 細菌Circos圖(圖2a)中, WD與Wck的優勢菌群具有一致性。不同組在綠彎菌門 (Chloroflexi)、芽單胞菌門 (Gemmatimonadetes)、匿桿菌門 (Latescibacteria) 及硝棘菌門 (Nitrospinae) 四個菌群具有極顯著差異(<0.01), Nitrospirae門和Patescibacteria門具有顯著差異(<0.05)。分別對0—10 cm和10—20 cm同層細菌群落結構進行ANOVA分析, ck1和D1的細菌群落結構在五個菌群中具有極顯著差異(<0.01), 即Chloroflexi門、Ento-theonellaeota門、Gemmatimonadetes門、Latesci-bacteria門和Nitrospinae門, 在Acidobacteria門也存在顯著差異(<0.05)。ck2和D2的細菌群落中, 六大菌群具有極顯著差異(<0.01), 包括Gemmati-monadetes門、Latescibacteria門、Nitrospirae門、Planctomycetes門、Tenericutes門及Zixibacteria門, 而Firmicutes門、Modulibacteria門、Nitrospinae門、WPS-2門和WS2門差異性顯著(<0.05)。不同土層的細菌群落結構分析中, ck1的細菌群落以變形菌門為最具優勢菌群, 次優勢菌群為酸桿菌門, ck2的優勢菌群與其一致, Wck的不同土層ANOVA分析表明, Wck中的Entotheonellaeota門、Planctomycetes門、Tenericutes門、WPS-2門、Zixibacteria門具有極顯著差異(<0.01), Elusimicrobia門、Firmicutes門及Modulibacteria門具有顯著差異(<0.05)。WD不同土壤層次的ANOVA分析顯示, 兩者僅在Actino-bacteria門和Bacteroidetes門差異顯著(<0.05)。細菌門水平相對豐度大于0.1%的有13個菌群, 百分比堆積條形圖顯示(圖3a), 自然與凍融退化下不同土層的細菌群落結構中各菌群所占的比例各異, ck1在Verrucomicrobia門占比最高(56.56%), ck2在Zixibacteria門(99.74%)及Firmicutes門(95.91%)有絕對的優勢, D1與D2皆在Latescibacteria門占比較高, 分別占比34.44%、45.61%。一定程度上反應了Wck組內不同層的差異以及WD組內的相似性, 表明自然狀態下不同土層的細菌群落結構差異較大。

圖1 細菌 (a) 及真菌 (b) 稀釋性曲線

Figure 1 Dilution curves of bacteria (a) and fungi (b)

真菌門水平絕大部分都為未知類群, 占比達到了79%, 已知菌群為子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota), 顯著性檢驗表明門水平下的真菌菌群群落結構差異不顯著。真菌屬除未知菌群外測得25個菌群, 其屬水平Circos圖(圖2b)顯示, Wck中克勞氏菌屬()、絲蓋傘屬()豐度值相對較高, 占比分別為6%和4%, 而WD中鏈格孢屬()及球旋霉屬()相對豐度值較高。ANOVA分析結果顯示, Wck與WD的屬有極顯著差異(<0.01),屬及未知菌群具有顯著差異(< 0.05)。分別對0-10cm、10-20cm的WD和Wck的真菌群落結構進行同層ANOVA顯著性分析, ck1與D1的真菌群落結構沒有顯著性差異, ck2與D2在屬有顯著性差異(<0.05)。不同土層的真菌群落結構中, ck1與ck2、D1與D2間的真菌菌群結構差異不顯著。真菌屬相對豐度大于0.1%除未知菌群的真菌菌群為19個, 其百分比堆積條圖(圖3b)清晰展示了ck1、ck2、D1、D2在不同真菌屬所占的比例大小, ck1在屬占比最高(93.65%), ck2則在屬(94.42%)、屬(86.92%)占比較高, D1的屬(82.00%)及屬(81.04%)占比最高, D2占比最高的屬則為屬(99.32%), 各組真菌菌群結構存在差異, 但差異并不顯著。以上結果表明, 凍融退化對真菌群落結構的影響較小,屬、屬所占比例明顯減少, 未知菌群的比例增大。

圖2 細菌 (a) 及真菌 (b) Circos圖

Figure 2 Circos diagram of bacteria (a) and fungus (b)

圖3 細菌 (a) 及真菌 (b) 百分比條圖

Figure 3 Bar chart of percentage of bacteria (a) and fungus (b)

3.3 凍融退化下土壤微生物群落多樣性變化

3.3.1 土壤微生物多樣性分析

高通量測序結果顯示, 細菌OTU數為1583個, 真菌OTU數為80個。韋恩圖結果顯示, 凍融(WD)退化的微生物種類完全從屬于自然狀態(Wck)的微生物種類。其中Wck的細菌OTU數量比WD多121個, 真菌OTU則多6個。表明凍融對微生物種類影響較小, 可能對微生物均勻度影響較大。細菌群落的多樣性指數中, 豐富度指數即ACE指數 (1371—1518) 和Chao1指數 (1387—1537), 均勻度指數為Simpson指數 (0.0056—0.1724) 以及Shannon多樣性指數 (3.8134—6.2080), 真菌群落多樣性指數中, ACE指數范圍為32—72, Chao1指數在36—74之間, Simpson指數在0.0947—0.8781范圍, Shannon多樣性指數范圍為0.3791—2.9244。與WD比較, Wck土壤細菌群落平均ACE指數(1446.391), 平均Chao1指數 (1457.942), 平均Simpson指數(0.034733)相對較高, 平均Shannon指數 (5.672415) 較低。Wck土壤真菌群落平均ACE指數 (67.88167), 平均Chao1指數 (68.325), 平均Shannon指數 (2.338095) 相對較高, 平均Simpson指數(0.229947)較低。單因素分析結果顯示, Wck與WD的土壤細菌群落多樣性沒有顯著差異, 且土壤真菌的均勻度指數也沒有顯著差異, 但其豐富度指數具有極顯著差異 (0.01)。分別對比同層Wck、WD的土壤微生物多樣性, ck1與D1細菌的豐富度指數及均勻度指數均存在顯著差異, 除ACE指數(<0.05)外, 其余指數顯示差異極顯著 (<0.01); 但ck1與D1真菌僅豐富度指數差異顯著 (<0.05), 表明0—10 cm的真菌均勻度并未受到凍融退化的顯著影響。ck2和D2細菌的ACE指數、Chao1指數具有極顯著差異 (<0.01), 即10—20 cm的細菌豐富度受到了顯著影響。不同層的微生物多樣性指數的ANOVA分析表明, ck1與ck2的細菌在豐富度指數上差異極顯著 (<0.01), D1與D2細菌的均勻度指數存在顯著差異 (<0.05), 且Shannon指數差異極顯著 (<0.01)。以上結果表明, 凍融退化顯著影響了土壤真菌的豐富度指數, 對0—10 cm的土壤真菌豐富度的影響更為明顯; 對不同土層細菌的多樣性指數均有顯著影響, 尤其對土壤細菌的豐富度指數的影響較大, 但凍融退化對土壤微生物多樣性的影響并未在整體上體現出細菌多樣性指數的顯著變化。不同土層微生物多樣性差異在一定程度上發生了中和, 使整體未能表現出統計學上的顯著差異。

3.3.2 土壤微生物多樣性差異分析

土壤細菌群落多樣性的相似性較大(圖4a), PCA分析中, 主成分1和主成分2的解釋程度為95.91%, ck與D較為聚集, 即WD組內差異較小, Wck組內差異明顯。差異性熱圖更為清晰的展示了樣品間的差異性(圖4c), Wck1-2、Wck2-2、Wck3-2單獨聚為一支, Wck1-1、Wck2-1、Wck3-1與WD組樣品聚為一支, 即ck1與WD的相似性更大, 表明凍融退化對不同土層的細菌多樣性產生的影響使得10—20 cm土層的細菌多樣性趨于0—10 cm土層的細菌多樣性。土壤真菌群落多樣性差異較為顯著(圖4b), 主成分1、主成分2解釋程度為75.75%, 前三個主成分的解釋程度則達到86.89%, ck與D離散程度較高, 表明Wck與WD的組間差異較大, 但Wck、WD組內的差異性較小。凍融對于真菌群落多樣性影響可能更為顯著, 這與土壤微生物多樣性指數的差異分析結果一致。差異分析熱圖顯示(圖4d), 不同樣品間都存在差異, 表明不同采樣點以及不同土層對樣品有一定程度的影響, 表層土壤和深層土壤的真菌多樣性都受凍融退化的影響。Adonis/ANOSIM非參數檢驗方法表明差異具有顯著性(<0.05), 進一步提供了土壤真菌多樣性具有差異的佐證。

4 討論

4.1 凍融退化下高寒濕地土壤微生物群落結構特征變化

凍融退化并未影響高寒濕地細菌群落結構中的優勢菌群, 這與濕地土壤常見的細菌門的優勢菌群差異不大[27-29], 表明各濕地生態系統中起主要作用的功能菌群有極大程度的一致性。但凍融退化使Chloroflexi門、Gemmatimonadetes門、Nitrospinae門、Nitrospirae門的豐度顯著增加, 同時降低了Latescibacteria門、Patescibacteria門的豐度, 即細菌群落結構發生顯著改變。Sharma等的凍融對土壤微生物群落結構的研究也表明能觀察到土壤微生物群落結構的變化[14]。Wck與WD的同層細菌群落結構分析中, 凍融退化使0—10 cm及10—20 cm土層的芽單胞菌門、匿桿菌門、硝棘菌門都發生了顯著變化, 表明這三個細菌門可能對凍融退化更為敏感。芽單胞菌門和匿桿菌門均為革蘭氏陰性菌, 而硝棘菌門則為一類亞硝酸鹽氧化細菌, 在碳固定上起著重要作用[30], 表明凍融退化下的土壤微生物可能具有更大的碳固定潛能。不同層的組內分析表明, ck1的細菌群落結構與ck2的細菌群落結構差異較大, 與Fierer等人研究的不同土層的微生物群落結構存在明顯差異具有一致性[31]。而WD中不同土層的細菌結構僅放線菌門和擬桿菌門存在顯著差異, 表明凍融退化下不同土層細菌群落結構的相似度較高。凍融退化改變了部分菌群的豐度, 顯著影響了細菌的群落結構, 同時使不同土層的細菌結構趨于相似。

表1 土壤微生物豐富度及多樣性指數

Table.1 Soil microbial richness and diversity index

圖4 細菌及真菌多樣性差異分析

Figure 4 Diversity analysis of bacteria and fungi

凍融退化對高寒濕地真菌群落結構存在影響, 但并不顯著, 真菌門水平下的方差分析結果表明, Wck與WD不存在顯著性差異。屬水平下分析結果表明在德福里斯孢屬)、擔孢酵母屬 () 的組間差異顯著, 德福里斯孢屬為無性型耐熱真菌[32], 其在ck2與D2同層分析也表現出顯著差異, 擔孢酵母屬則屬擔子菌門。而未知真菌菌群豐度的增加表明了其在凍融退化下具有一定的優勢。Wck、WD的組內單因素分析沒有顯示出顯著差異, 表明不同土層土壤真菌的群落結構相似, 真菌對凍融退化的耐受能力較強[10]。凍融對真菌群落結構的影響在于使已知菌群中的兩個屬豐度降低以及未知菌群豐度增大, 但對真菌群落整體結構影響不大。真菌群落結構中未知菌群的群落及功能有必要進一步剖析, 以便于對濕地生態系統機制進行深層探究。

4.2 凍融退化對高寒濕地微生物多樣性的影響

凍融退化對高寒濕地土壤微生物的多樣性指數影響顯著。其Alpha多樣性指數存在一定的差異, 且細菌的種類和數量有著絕對的優勢, 趙先麗等對濕地土壤微生物的研究也表明了細菌比真菌有更強的生長繁殖能力[33]。凍融退化下真菌群落多樣性的豐富度指數差異極顯著, 且WD

5 結論

凍融退化改變了青海湖濕地土壤微生物的群落結構以及多樣性。土壤細菌群落的芽單胞菌門、硝棘菌門相對豐度顯著增加, 匿桿菌門相對豐度顯著減少, 優勢菌群并未變化; 整體上細菌群落的多樣性指數呈降低趨勢, 但不同層次的細菌受到的影響相反, 在一定程度上中和了差異, 其變化并不顯著。凍融退化對土壤真菌群落結構的影響較小, 德福里斯孢屬和擔孢酵母屬的相對豐度降低, 表明部分真菌菌群可以反應環境的變化情況; 真菌群落多樣性指數整體呈降低趨勢, 其豐富度指數降低尤為顯著。凍融退化改變了土壤微生物的群落結構, 降低了土壤微生物群落的多樣性。本文闡明了高寒濕地凍融現象導致的土壤退化下土壤微生物群落特征的變化, 但“土壤-微生物-根際”存在著相互關系, 凍融退化對土壤的影響并不只是土壤微生物這一單因素, 因此凍融退化對濕地土壤的理化性質以及根際植物等的影響有待進一步的探究, 以期對凍融退化下濕地生態系統作用機制的深層次剖析。

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Changes of microbial community characteristics in freezing-thaw degradation of alpine wetland

ZHANG Ni1,2, CHEN Kelong2,3,*, WANG Hengsheng4, YANG Yang1,2

1. College of Life Science Qinghai Normal University, Xining 810008, China 2. Key Laboratory of Surface Processes and Ecological Conservation, Ministry of Education, Qinghai Normal University, Qinghai Province, Xining 810008, China 3. Science and Technology Department, Qinghai Normal University, Xining 810008, China 4. School of Life Science, Hefei Normal University, Hefei 230061, China

Under the background of global warming, a large amount of permafrost will be further degraded, and the freezing-thawing process spreads throughout the Qinghai-Tibet plateau, and soil microorganisms are highly sensitive to environmental changes. So in this paper, soil microorganisms under freezing-thawing degradation in the wetland at the source of a river of Qinghai lake were taken as the research object. The effects of freezing-thawing degradation on the structure and diversity of soil microbial community were explored based on 16s rRNA and 18s rDNA sequencing. The results showed that 1583 bacterial and 80 fungal operational taxa were obtained from the effective sequence annotation of Qinghai lake alpine wetland. Freezing-thawing degradation did not change the dominant flora of soil microorganisms: the dominant flora in the bacterial community were all Proteobacteria and Acidobacteria, and Ascomycota had the highest relative abundance among the known fungal flora. Freezing-thawing degradation resulted in the similarity of the structure of the bacterial community of 0-10 cm and 10-20 cm, and the relative abundance of the fungal community of Devriesia and Erythrobasidium was significantly reduced. Moreover, freezing-thawing degradation significantly affected the turbidities of soil microorganisms, and reduced the ACE index, Chao1 index and Simpson index of bacterial community, as well as the ACE index, Chao1 index and Shannon index of fungal community, while the Shannon index of bacterial community and Simpson index of fungal community were increased. This study shows that freezing-thawing degradation has an impact on the community structure and diversity of soil microorganisms, providing a reference for the study of the mechanism of ecosystem action under the degradation of frozen soil.

wetland; freezing-thawing degradation; soil microorganism; high throughput sequencing

10.14108/j.cnki.1008-8873.2022.02.003

Q938.1+1

A

1008-8873(2022)02-020-09

2020-06-11;

2020-07-03

國家自然科學基金項目(41661023); 國家科技支撐計劃項目(2017YFC0403601); 第二次青藏高原綜合科學考察研究(2019QZKK0405); 青海省科技廳項目(2017-ZJ-782)

章妮(1997—), 女, 湖北荊州人, 碩士研究生, 主要從事濕地生態學研究, E-mail:1581146264@qq.com

通信作者:陳克龍, 男, 二級教授, 博士生導師, 主要從事生物地理與濕地生態研究, E-mail:ckl7813@163.com

章妮, 陳克龍, 王恒生, 等. 高寒濕地凍融退化下微生物群落特征變化[J]. 生態科學, 2022, 41(2): 20–28.

ZHANG Ni, CHEN Kelong, WANG Hengsheng,et al. Changes of microbial community characteristics in freezing-thaw degradation of alpine wetland [J]. Ecological Science, 2022, 41(2): 20–28.