補料分批發酵條件優化提高D-泛酸的產量

周海巖,周斌,鄒樹平,張博,柳志強*

1(浙江省生物有機合成技術研究重點實驗室(浙江工業大學),浙江 杭州,310014)2(手性生物制造國家地方聯合工程研究中心(浙江工業大學),浙江 杭州,310014)

D-泛酸是水溶性的B族復合維生素(B5),作為合成輔酶A和?；d體蛋白的一種前體發揮作用[1-2]。作為一種重要的生長因子,D-泛酸參與碳水化合物、蛋白質和脂肪酸的代謝[3]。目前,D-泛酸被廣泛用于醫藥、食品、飼料工業等領域[4-5]。

D-泛酸的生產方法主要包括物理誘導結晶法、化學拆分法和生物法。物理誘導結晶法工藝成熟,但只能生產泛酸鈣,無法用于其他泛酸衍生物的生產?；瘜W拆分法是目前最主要的合成方法,但拆分劑價格昂貴,分離困難,還存在毒性和環境污染問題[6-7]。通過合理運用微生物或酶來生產D-泛酸,不僅能夠保證泛酸的拆分質量而且還能減低反應成本[8],相較化學法,生物法具有更加綠色環保的優點[9]。生物酶法是利用泛酸合成酶催化D-泛解酸和β-丙氨酸進行縮合反應生成D-泛酸,反應條件溫和,沒有副產物的生成,更有利于產品分離[10-12]。20世紀90年代,就有學者開始研究生物發酵法生產D-泛酸,并取得了一定的成果。但是目前D-泛酸的產量尚未達到工業化生產的要求,主要原因是D-泛酸代謝途徑長、分支代謝多,目的產物D-泛酸的積累量不高[13];其次,在D-泛酸合成過程中,需要很多前體物質,對培養基要求和發酵控制比較苛刻[14-16]。

本文以實驗室前期構建的E.coliDPA21/pBCST3為D-泛酸生產菌株,在5 L發酵罐水平進行關鍵發酵參數的優化,主要包括在分批發酵實驗中對發酵溫度、pH、轉速進行優化,以及在補料分批發酵實驗中對葡萄糖和β-丙氨酸的流加方式和濃度進行優化,以進一步提高D-泛酸的產量,初步建立高效的發酵調控工藝,為后期的工業化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌種

E.coliDPA21/pBCST3,保藏于浙江工業大學生物工程研究所。E.coliDPA21的基因型為DPA17ΔpoxB ΔpflB ΔldhA ΔilvE。

1.2 培養基

種子培養基(LB培養基)(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10。

發酵培養基：葡萄糖30 g/L、(NH4)2SO416 g/L、KH2PO42 g/L、酵母粉2 g/L、金屬鹽溶液1 mL/L、L-異亮氨酸20 mg/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)0.2 mmol/L、卡那霉素(kanamycin,Kan)50 mg/L、維生素B15 mg/L、維生素B122 mg/L、β-丙氨酸 3 g/L。

金屬鹽溶液(g/L)：CaCl210、FeSO4·7H2O 10、ZnSO4·7H2O 1、CuSO40.20、NiCl2·7H2O 0.02。

補料培養基：葡萄糖500 g/L、(NH4)2SO410 g/L、KH2PO414 g/L、酵母粉2 g/L、金屬鹽溶液1 mL/L、L-異亮氨酸 20 mg/L、MgSO4·7H2O 16 g/L、IPTG 0.2 mmol/L、Kan 50 mg/L、維生素B15 mg/L、維生素B122 mg/L;根據需要添加質量濃度為30～50 g/L的β-丙氨酸。

1.3 培養方法

1.3.1 種子培養

從培養成熟的平板中挑出單一的菌落,接入到裝有50 mL種子培養基(含有50 mg/L Kan)的500 mL三角瓶中,于37 ℃、150 r/min培養14 h。

1.3.2 發酵罐發酵培養

按照15%的接種量將種子液接入5 L發酵罐中進行發酵培養。發酵罐裝液量為2 L,培養溫度(30±1)℃,通氣量為1.5 vvm,流加30%的氨水和30%的磷酸溶液自動控制pH使其維持在(6.8±0.1),初始攪拌轉速為400 r/min,后期通過偶聯攪拌轉速對溶氧(dissolved oxygen,DO)(維持在15%左右)進行調節,直到發酵結束。

流加培養：在分批發酵的基礎上,根據實驗設定來補加補料培養基。

1.4 分析方法

1.4.1 細胞濃度測定

取適量的發酵液用蒸餾水進行適當的稀釋后,用Eppendorf BioPhotometer測量600 nm處的吸光值(OD600),使用發酵液上清液作為對照,根據標準曲線換算成菌體干重(dry cell weight,DCW),按公式(1)計算：

DCW(g/L)=0.393 5×OD600+0.014 8

(1)

1.4.2 葡萄糖含量檢測

葡萄糖濃度采用DNS法[17]進行檢測。

1.4.3D-泛酸檢測

將發酵液樣品在12 000 r/min離心5 min,取1 mL上清液按照一定的比例進行稀釋使D-泛酸的含量檢測值在儀器的檢測范圍內;通過無菌濾膜過濾后,D-泛酸的濃度使用HPLC進行檢測。

HPLC檢測條件：儀器為日本日立(HITACHI)公司Primaide,色譜柱型號為Eclipse XD8-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm),柱溫30 ℃,檢測器為紫外檢測器,檢測波長210 nm,流動相體積比A(磷酸)∶B(乙腈)∶C(水)=1∶50∶950,流速0.9 mL/min,進樣量10 μL。

1.5 數據處理

數據用Excel和Origin 2018軟件處理。

2 結果與分析

2.1 5 L發酵罐分批培養條件的優化

2.1.1 不同培養溫度對產D-泛酸的影響

溫度是影響微生物生長和存活的主要環境因素之一,溫度對發酵的影響主要表現在對細胞生長、產物合成、發酵液的物理性質和生物合成方向等方面。為確定最佳發酵溫度,在其他條件不變的條件下,分別設置不同的溫度(27、30、33 ℃)進行分批發酵實驗。

如圖1所示,在3種不同的溫度下,菌體生長情況在發酵后期無顯著差別,葡萄糖在22 h左右消耗完,此時細胞干重開始呈現穩定趨勢。但由于D-泛酸的生物合成與菌體生長并不是完全耦合的,在基質消耗完全后仍會利用發酵液中的有機酸(D-泛解酸、α-酮戊二酸和α-酮異戊酸)和氨基酸(β-丙氨酸、L-谷氨酸)等其他物質繼續合成D-泛酸,最終產量分別達到5.31、7.30和6.56 g/L。當發酵溫度從27 ℃升高至30 ℃時,D-泛酸產量隨之增加;隨著發酵溫度的進一步升高(33 ℃),D-泛酸產量隨之下降,原因可能為高溫會影響D-泛酸合成途徑中一些關鍵酶的活力。因此,選擇30 ℃作為分批發酵的溫度。

a-菌體生長;b-D-泛酸生產;c-葡萄糖消耗圖1 不同培養溫度下D-泛酸發酵參數Fig.1 Fermentation parameters of D-pantothenic acid at different temperatures

2.1.2 不同pH對D-泛酸生產的影響

隨著菌種對培養基中碳、氮源的利用以及有機酸和氨基酸的積累,培養液的pH會發生一定的變化。pH值主要影響菌體內某些關鍵酶的活性,從而影響產物的產量。pH對D-泛解酸內酯水解酶活力影響顯著[18],而D-泛酸內酯水解酶是泛酸合成中的關鍵酶,當pH為6.0～7.5時最有利于D-泛酸的合成。因此本實驗選擇pH為6.2～7.4進行研究。

由圖2可知,在pH 6.2～7.4,pH為6.8時的菌體生長和D-泛酸合成量在整個培養過程中均略高于其他pH值時的水平,因此,選擇pH 6.8作為發酵pH。

a-菌體生長;b-D-泛酸生產;c-葡萄糖消耗圖2 不同pH條件下D-泛酸發酵參數Fig.2 Fermentation parameters of D-pantothenic acid at different pH

2.1.3 不同DO對D-泛酸生產的影響

如圖3所示,在發酵的前12 h,菌體生長情況基本一致,而發酵12 h后呈現不同的變化降勢,5%、15%和25%條件下的DCW分別為7.08、7.57和7.44 g/L。DO為5%時菌體量較低,這說明攪拌轉速過低可能會造成供氧不足,從而影響菌體生長;而過高的轉速會產生剪切力,對菌體造成一定損傷,使其過早衰亡或自溶[20]。而18 h后,DO為15%時的D-泛酸產量高于其他2個溶氧條件下的產量,綜合考慮菌體生長、D-泛酸產量以及工業生產中能耗的因素,選擇15%作為分批發酵的溶氧水平。

a-菌體生長;b-D-泛酸生產;c-葡萄糖消耗圖3 不同DO條件下D-泛酸發酵參數Fig.3 Fermentation parameters of D-pantothenic acid at different DO levels

2.2 β-丙氨酸補料方式和濃度對發酵的影響

在發酵參數確定的基礎上,對β-丙氨酸的補料方式進行優化。主要分為β-丙氨酸與糖混合流加和β-丙氨酸單獨流加2種方式,β-丙氨酸的質量濃度為30、40、50 g/L。

由圖4和圖5可知,在2種不同的β-丙氨酸補料條件下,D-泛酸的最高產量均在β-丙氨酸質量濃度40 g/L時,混合流加方式下最高產量為40.25 g/L,高于分開流加時的27.38 g/L。比較在同一種β-丙氨酸流加方式不同濃度時,發現在發酵20 h左右,即開始補糖時,D-泛酸的合成速率出現差異,流加質量濃度為50 g/L時,D-泛酸合成速率最高,但快速進入生產穩定期。流加質量濃度為40 g/L時,D-泛酸合成速率先增大后減小,緩慢進入穩定期。當流加質量濃度為30 g/L時,D-泛酸的合成速率較補料前有所下降,但D-泛酸產量一直處于緩慢增長狀態。說明β-丙氨酸的流加濃度對D-泛酸的合成有顯著的影響。原因可能為在20 h左右菌體內合成D-泛酸的相關酶活力較高,能夠將較高濃度的β-丙氨酸轉化合成D-泛酸。在35 h左右,菌體的活力開始下降,不能夠迅速地將β-丙氨酸進行轉化,此時,β-丙氨酸消耗速率小于補給速率,使胞外β-丙氨酸大量積累,從而抑制D-泛酸的合成。

a-30 g/L;b-40 g/L;c-50 g/L圖4 混合流加方式下β-丙氨酸的濃度優化Fig.4 Optimization of β-alanine concentration in mixed feeding mode

a-30 g/L;B-40 g/L;C-50 g/L圖5 單獨流加方式下β-丙氨酸的濃度優化Fig.5 Optimization of β-alanine concentration under separate feeding mode

2.3 葡萄糖補料方式優化

在β-丙氨酸的補料工藝確定的基礎上,對補糖工藝進行優化。葡萄糖作為一種重要的發酵底物,對微生物生長和代謝至關重要。從前期的分批發酵實驗中發現,在D-泛酸分批發酵結束時,菌體生長和D-泛酸合成都沒有出現快速的下降。因此在葡萄糖耗盡之前如果及時補充葡萄糖,將可以提高產物轉化率。目前,葡萄糖的流加方式有很多種,本實驗結合D-泛酸合成的特性,采用2種補料方式,即脈沖補料和勻速補料進行D-泛酸的發酵。理論上較低的葡萄糖濃度更有利于發酵[21],根據前期的預實驗和ZHANG等[16]的研究,發現糖質量濃度維持在5 g/L左右時有利于D-泛酸的積累。所以當殘余葡萄糖質量濃度下降到5 g/L或以下時開始進行葡萄糖流加。

2.3.1 不同脈沖濃度對D-泛酸發酵的影響

由圖6可知,在3種不同脈沖(5～10、5～20、5～30 g/L)條件下,DCW變化趨勢相似。在發酵后期,當脈沖質量濃度為5～30 g/L時,D-泛酸的合成早于其他2種條件下達到平衡,但產量較低;而脈沖質量濃度為5～10 g/L時,D-泛酸的產量明顯高于其他2種條件下的水平,達到41.5 g/L,表明低濃度的葡萄糖更有利于D-泛酸的合成。

a-5～10 g/L;b-5～20 g/L;c-5～30 g/L圖6 不同脈沖糖濃度對D-泛酸發酵的影響Fig.6 Effects of different pulsed glucose concentrations on D-pantothenic acid production

2.3.2 不同恒速補糖對D-泛酸發酵的影響

分別以2.0、2.5和3.0 g/(L·h)進行勻速補糖。由圖7-a可知,當補糖速率為2.0 g/(L·h)時,發酵過程中出現較長時間的低糖(<5 g/L)階段,菌體生長較緩慢。而當補糖速率為2.5 g/(L·h)時(圖7-b),糖質量濃度可以很好地控制在5～10 g/L,菌體生長速率也相對更快,最終D-泛酸產量達到32.33 g/L。而當補糖速率為3.5 g/(L·h)時(圖7-c),發酵后期由于補糖速率超過菌體耗糖速率,發酵液中糖濃度過高而導致菌體生長和D-泛酸受到影響?？傮w而言,在勻速補料條件下,D-泛酸的最高產量(32.33 g/L)明顯低于間歇性補料(5～10 g/L)的最高產量(41.5 g/L)。因此,最佳的葡萄糖流加方式為脈沖補料,質量濃度為5～10 g/L。

a-2.0 g/(L·h);b-2.5 g/(L·h);c-3.0 g/(L·h)圖7 不同勻速補糖對D-泛酸發酵的影響Fig.7 Effects of different rates of glucose supplementation on D-pantothenic acid production

3 結論

通過對D-泛酸發酵培養條件進行考察,確定5 L發酵罐的最佳培養條件為溫度30 ℃、pH 6.8、DO 15%,確定了最佳的β-丙氨酸流加方式,即與葡萄糖溶液混合流加,且β-丙氨酸質量濃度最佳為40 g/L。在此基礎上,通過比較脈沖補料和勻速補料方式確定葡萄糖以5～10 g/L的質量濃度進行脈沖式補料對于提高D-泛酸的產量效果更好,D-泛酸的最高產量達到41.5 g/L。后續需進一步縮短反應時間,簡化發酵操作流程來提高產量以達到工業化生產標準。