γ-氨基丁酸對鹽堿脅迫下甘草種子萌發的影響

葛甜甜，王 楠，高 靜*，關思靜，徐蓉蓉，張亞麗，謝豐璞，李 瑞，嚴加坤，顏永剛，張 崗

（1.陜西中醫藥大學藥學院，陜西 西安 712046；2.陜西中醫藥大學陜西中藥資源產業化省部共建協同創新中心/秦藥特色資源研究與開發國家重點實驗室（培育），陜西 咸陽 712083；3.榆林學院生命科學學院，陜西 榆林，719000）

土壤鹽堿化已逐漸成為全球性的問題，其可降低土壤肥力，對植物的生長有較大的傷害。據報道，我國耕地的鹽堿化面積達到9913萬hm2，廣泛分布在西北干旱地區、東部沿海和東北等地區［1-2］。在自然環境下，根據土壤含鹽量和pH值，可分為中性、堿性和鹽堿混合型，其中中性鹽主要有NaCl和Na2SO4，堿性鹽有NaHCO3、Na2CO3［3-4］。土壤鹽堿成分通常頗為復雜，鹽化和堿化常同時發生，并且鹽堿混合是兩者的協同效應對植物的傷害遠大于單一鹽、堿脅迫［5-6］。土壤鹽堿脅迫會嚴重阻礙大多數的種子萌發，并且對胚的生長發育產生不利影響，抑制植物正常的生長［7-8］，研究表明，高濃度的鹽堿處理抑制蓖麻種子萌發，使發芽率、發芽勢、發芽指數降低［9］。趙穎［10］等研究發現藜麥種子萌發率隨鹽堿脅迫濃度的升高而下降并且在高pH下，幼苗在第7天開始腐爛，使其不能正常生長發育。鹽堿脅迫不僅能顯著抑制種子萌發和幼苗生長，可通過增大細胞脂膜的透性以及膜脂過氧化反應的速度提高，進而破壞細胞膜的正常生理功能，導致植物體內積累了大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），進一步導致酶系統的損害［11］，使部分組織受到一定傷害。

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）是一類具有生物活性的四碳非蛋白質氨基酸，作為細胞內源信號分子普遍存在于動植物組織中［12］。相關研究表明，當植物面臨缺氧、低溫、高溫、高鹽堿等非生物脅迫時其含量會迅速提高，幫助植物抵御脅迫環境［13］。已有報道指出，葉面噴施GABA后，可提高甜瓜幼苗的抗氧化酶活性，緩解脅迫對植物光系統Ⅱ（PSⅡ）反應中心的抑制作用，增強幼苗葉片的光合能力，從而提高甜瓜幼苗對鹽堿脅迫的抗性［14］。此外，GABA浸種能夠促進低溫［15］和鹽堿脅迫［7］下甜瓜種子的萌發，并通過提高抗氧化酶活性緩解其脅迫造成的傷害。

甘草（GlycyrrhizauralensisFisch.）主要分布在東北、華北、西北等鹽漬化區域［16］，可以在輕微鹽堿地正常生長，但是近年來隨著土壤鹽漬化日益嚴重，大量研究發現高鹽高堿不利于甘草生長，導致其質量與產量下降，無法滿足市場需求［17］。因此，本實驗以甘草種子為供試材料，通過研究不同濃度GA?BA對鹽、堿和鹽堿脅迫下甘草種子萌發和幼苗生長的影響，探索外源GABA增加甘草耐鹽堿性的機理，為提高甘草種子和早期幼苗對鹽堿脅迫的抗性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為甘草種子，于2020年4月采自新疆烏魯木齊，經陜西中醫藥大學黃文靜副教授鑒定為豆科植物甘草G.uralensis種子。收獲凈種后，經打磨后放入編織袋內，于2～8℃冷柜貯藏。

1.2 試驗方法

取適量的甘草種子用10%的H2O2消毒30 min，用蒸餾水沖洗干凈，吹干后將種子置于燒杯中倒入98%H2SO4浸泡30 min后用蒸餾水反復沖洗至中性，晾干，待用。以蒸餾水處理為對照（CK），NaCl濃度為100 mmol·L-1，將其標記為NS；Na2CO3濃度為5 mmol·L-1，標 記 為AS；混 合 鹽 堿 濃 度 為80 mmol·L-1NaCl+5 mmol·L-1Na2CO3（獲得 與中 性鹽 相 同 的Na+堿性溶液），標記為NAS；γ-氨基丁酸（GABA）的濃度設置為0.05、0.1、0.2、0.3、0.5 mmol·L-1，并將其標記為G1、G2、G3、G4和G5。試驗采用拌種的方法（將不同濃度的GABA分別與NaCl、Na2CO3和NaCl+Na2CO3配制成不同的處理液，加入種子發芽床，使GABA始終貫穿整個處理過程），將待用的甘草種子均勻的鋪在2層濾紙、90 mm的培養皿中，加入適量的不同處理液，每個處理3個重復，每個重復30粒種子，放入人工氣候箱中（溫度25℃，相對濕度75%，光暗周期交替為12 h/12 h）進行萌發試驗。24 h后開始逐日觀察并補充相應的處理液，直至發芽結束。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 生長指標的測定

以胚根長1 mm作為種子發芽標志，測定種子處理第1 d的發芽勢和第7 d的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數以及在第7 d每個處理選取9株幼苗用直尺測量胚根、胚軸和子葉的長度。

1.3.2 生理指標的測定

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）采用氮藍四唑（QNBT）法測定，過氧化物酶（Peroxi?dase，POD）采用愈創木酚法測定，過氧化氫酶（Cat?alase，CAT）活性采用紫外分吸收法測定［18］。

1.4 數據處理

利用Microsoft Excel 2019軟件進行數據處理，利用Graphpad 8.0軟件進行繪圖，利用SPSS 25.0軟件進行方差分析和顯著性檢驗。

分別以甘草種子的發芽率（Germination percent?age，GP）、發芽勢（Germination potential，GP）、發芽指數（Germination index，GI）、活力指數（Vitality in?dex，VI）、鮮 重（Fresh weight，FW）、干 重（Dry weight，DW）、胚根長（Radicle length，RL）、胚軸長（Hypocotyl length，HL）、子葉長（Cotyledon length，CL）、SOD、POD和CAT共12個指標，以及鹽、堿和鹽堿脅迫、5個GABA濃度處理作為2個變量組，用R軟件進行冗余分析（Redundancy analysis，RDA），分析3種脅迫及外源GABA與甘草種子萌發及幼苗生長的關系。

2 結果與分析

2.1 外源GABA對鹽、堿和鹽堿脅迫下甘草種子萌發的影響

由表1可知，鹽（92.22%）、堿（91.67%）和鹽堿脅迫（91.67%）與CK相比，種子的發芽率無顯著性差異（P>0.05），在鹽和堿脅迫下發芽勢分別下降了44.26%（P<0.05）、9.01%（P<0.05），活力指數在鹽、堿和鹽堿脅迫下分別下降了39.24%（P<0.05）、13.76%（P>0.05）、24.27%（P>0.05），而發芽指數只在鹽脅迫處理中下降了2.04%（P<0.05）。在鹽、堿脅迫條件下，施用不同濃度的GABA可提高甘草種子的發芽勢或活力指數，在鹽脅迫條件下，0.1mmol·L-1處理能夠顯著提高活力指數，提高了57.13%（P<0.05），在堿條件下，0.05、0.2和0.3mmol·L-1的GABA處理下發芽勢分別提高了18.91%、17.11%和4.49%（P<0.05）。

表1 外源GABA對鹽、堿和鹽堿脅迫下對甘草種子萌發指標的影響Tab.1 Effect of exogenous GABA on seed germination index of G.uralensis under saline，alkaline，and saline-alkaline stresses

2.2 外源GABA對鹽、堿和鹽堿脅迫下甘草幼苗生長的影響

由表2可知，與CK相比，3種處理顯著抑制了甘草幼苗的胚根、胚軸或子葉的生長（P<0.05），其中，鹽處理顯著抑制胚軸和子葉的生長，堿處理顯著抑制了胚根和胚軸的生長，鹽堿處理則抑制了胚根和子葉的生長。不同濃度的GABA大部分可有效緩解三種脅迫對上述指標的抑制作用。其中，鹽脅迫條件下，0.2 mmol·L-1的GABA處理對甘草幼苗的胚根、胚軸的促進作用最顯著，分別為2.46 cm、1.46 cm。在堿脅迫條件下，濃度為0.5 mmol·L-1的GABA可顯著促進胚根的生長，較AS增加了43.07%（P<0.05）。鹽堿混合條件下，GABA在0.05～0.3 mmol·L-1可提高胚根長和鮮重質量，相比NAS胚根長度提高了11.76%～45.1%（P<0.05），鮮 重 提 高 了28.57% ～64.29%（P<0.05），并且，GABA濃度在0.3 mmol·L-1時達到最大，為1.48 cm、0.23 g。

表2 GABA對鹽、堿和鹽堿脅迫下甘草種子生長指標的影響Tab.2 Effect exogenous GABA on seedling growth index of of G.uralensis under saline，alkaline，and saline-alkaline stresses

2.3 GABA對鹽、堿和鹽堿脅迫下甘草幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖1可知，鹽脅迫處理顯著增加了甘草幼苗內POD和CAT活性（P<0.05），外源GABA處理后的甘草幼苗內SOD和POD活性表現出先下降后上升再下降的變化趨勢，且SOD在GABA濃度為0.2 mmol·L-1時活性 最 大，POD則在0.05 mmol·L-1的GABA時活性最大，與NS相比分別增加了8.82%（P<0.05），而CAT活性則表現為先上升后下降的趨勢，GABA在0.2mmol·L-1時達到最大。

圖1 GABA對鹽脅迫下甘草幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.1 Effect of melatonin on antioxidant enzyme activities of G.uralensis seedling under saline stress

由圖2可知，與CK相比，堿脅迫處理顯著抑制了SOD和POD活性（P<0.05），分別下降了24.03%、15.79%。外源施加不同濃度的GABA后SOD、POD和CAT活性大部分顯著增加。其中，0.3 mmol·L-1的GABA處理下對POD和CAT活性的效果最為明顯，是NS的1.77倍、4.48倍（P<0.05）。0.5 mmol·L-1的GABA處理顯著提高了SOD活性，使其增加了18.25%（P<0.05）。

圖2 GABA對堿脅迫下甘草幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of melatonin on antioxidant enzyme activities of G.uralensis seedling under alkaline stress

由圖3可知，與CK相比，鹽堿脅迫處理下SOD和POD活性均顯著增加（P<0.05），上升幅度分別為17.9%、55.67%。與NAS相比，SOD和POD活性隨著GABA濃度的升高呈現出先下降后上升的變化趨勢，且0.05、0.5mmol·L-1的GABA下達到最大，SOD活性增加了10.26%、12.9%（P<0.05），POD活性增加了16.87%、17.67%。CAT表現出隨外源GA?BA濃度的增加而先上升后下降的變化趨勢。GA?BA濃度在0.2、0.3mmol·L-1時達到最大，分別增加了19.50%、21.24%（P<0.05）。

圖3 GABA對鹽堿脅迫下甘草幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of melatonin on antioxidant enzyme activities of G.uralensis seedling under saline-alkaline stresses

2.4 GABA、鹽、堿和鹽堿脅迫與種子萌發和幼苗生長參數的冗余分析

由圖4A可知，FW、DW、CAT、POD與NAG1、NSG3、NS呈正相關，NSG4、NSG5與CL、SOD相關性強，GP、GF、GI、VI、RL、HL與CK、NSG2呈正相關，而NS與其呈負相關。由圖4B得知，AS與SOD、CAT、POD、GP、GI、RL、HL、CL、DW呈負相關。ASG2、ASG4與GP、DW、POD和CAT相關性強，ASG5與GF、GI、VI、RL、HL、CL和SOD呈正相關。由圖4C可知，NAS、NASG1、NASG3、NASG5與POD、CAT、SOD、HL、GF、GI呈正相關，NASG2和NASG4與FW、DW和GP呈正相關。

圖4 外源GABA對鹽（A）、堿（B）和鹽堿脅迫（C）下甘草種子萌發和幼苗生長參數RDA二維排序圖Fig.4 RDA sequence of exogenous GABA on germination and growth parametersof G.uralensis seeds under saline（A），alkaline（B）and saline-alkaline stressessaline-alkali stresses（C）

3 討論與結論

植物的整個生育期中，種子萌發階段是植物體生命的開始，也是植物生長最敏感和關鍵的階段，這時期土壤鹽分過高會嚴重抑制種子的萌發［19］。本實驗研究結果表明，鹽、堿和鹽堿脅迫顯著降低了甘草種子的發芽勢、發芽指數和活力指數，并且抑制了甘草幼苗的胚根、胚軸和子葉的生長，這與王妍［20］等的研究結果一致。同時，本實驗發現鹽、堿和鹽堿脅迫對種子的發芽率沒有顯著影響，據前人研究發現，甘草具有較強的抗寒、抗旱和抗鹽堿能力，可在輕微的在鹽堿地生長［16］，因此推測在較高的鹽堿環境下不影響甘草種子的萌發率，但是會阻礙早期幼苗的正常生長。本研究中，外源GABA可提高鹽、堿和鹽堿脅迫下甘草種子的發芽勢、發芽指數和活力指數，這與前人研究表明GABA能夠顯著緩解鋁脅迫對種子的傷害，提高鋁脅迫下種子的發芽勢、發芽指數、活力指數的結果一致［13］。此外，GABA可有效緩解三種脅迫對胚根、胚軸和子葉生長的抑制作用，其中0.2 mmol·L-1的GABA處理可促進鹽堿脅迫下對甘草幼苗的胚根伸長和鮮重的積累，說明外源GABA具有加快鹽堿脅迫下萌發期甘草種子生長進程的作用。有研究表明，外源GA?BA能緩解高溫脅迫對水稻幼苗生長的抑制作用，并且可增加株高和根長的干物質，這與外源GABA增加內源GABA的含量有關［21］。此外，有研究發現，在低溫、高溫、鹽和干旱等脅迫下，GABA含量增加的同時乙烯含量增加［22］，說明了外源施加GABA后，種子萌發期在逆境脅迫下可積累一定的GABA，其能夠促進乙烯的合成，以此來消減脅迫環境對種子萌發與幼苗生長的抑制作用。

植物在正常生長條件下，體內活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的產生與清除處于動態平衡且不會對細胞膜造成傷害，當植物在低溫、高溫、干旱和鹽堿等逆境時，這種動態平衡被打破，造成了ROS的大量積累，對細胞造成了不同程度的氧化傷害，同時植物體內會啟動自生的抗氧化酶系統，以此來清除過多的ROS，增強植株抗逆性［23-24］。植物體內三種常見的抗氧化酶為SOD、POD和CAT，這三種酶活性的高低可直接反應植物耐逆境脅迫的能力。研究表明，GABA可通過調控植物的抗氧化防御系統來緩解其逆境脅迫［25］，例如，王泳超［26］等在玉米種子耐鹽性的研究中表明，鹽脅迫導致玉米幼苗中丙二醛（MDA）和超氧陰離子（O2.-）含量升高，但用GABA浸種后有效降低了MDA和O2.-的升高幅度，且提高了鹽脅迫下玉米幼苗內SOD、POD和CAT活性。本研究結果表明，在鹽脅迫中，0.05 mmol·L-1的GABA可提高POD活性，0.2 mmol·L-1的GABA可提高SOD和CAT活性；在堿脅迫下，0.3 mmol·L-1的GABA處理后甘草種子發芽過程中SOD、POD和CAT活性均顯著增加；鹽堿脅迫處理后甘草幼苗內的SOD、POD和CAT活性均顯著上升，說明了鹽堿脅迫造成種子萌發過程中氧化傷害，甘草自身可以通過提高抗氧化酶活性以降低鹽堿脅迫的傷害。冗余分析結果表明，不同脅迫下，GABA對甘草幼苗抗氧化酶活性的影響不同，其中，鹽堿脅迫下0.05 mmol·L-1、0.2～0.5 mmol·L-1的GABA與SOD、POD、CAT三種酶活性相關性均很強，這與上述鹽堿脅迫可提高甘草自身抗氧化酶活性的結果一致，同時，外源GABA可進一步使植物產生更多的抗氧化酶活性來抵御鹽堿脅迫對種子萌發及幼苗生長的傷害。此外，王泳超［27］等研究發現，內源GABA含量與SOD、POD和CAT三種抗氧化酶活性呈顯著正相關。Mahmud［28］等在芥菜對鉻脅迫耐受性的研究中發現，GABA可上調酶類抗氧化劑，如谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）、抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）、SOD、POD、CAT，以此減少氧化損傷。這說明了GABA可能作為一種信號分子通過上調抗氧化防御系統的酶活性，誘導有利于抗氧化酶活性的某些基因的表達。

綜上所述，鹽、堿和鹽堿脅迫會抑制甘草早期幼苗生長。外源添加GABA提高種子的發芽勢和活力指數，還可以通過提高SOD、POD和CAT活性來維持細胞內活性氧穩態，進而緩解鹽堿脅迫對甘草早期幼苗的傷害。