寧夏銀川地區番茄斑萎病毒和南方番茄病毒復合侵染分子鑒定

康華軍 李建設 高艷明 史 娟 石延霞 謝學文 李 磊 范騰飛 李寶聚* 柴阿麗*

（1 中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2 寧夏大學，寧夏銀川 750021；3 甘肅農業大學，甘肅蘭州 730070）

寧夏地處我國西北地區東部，黃河上中游，地勢南高北低，呈階梯狀下降，平均海拔1 000 m 以上。區內日照時間長，光能資源豐富，晝夜溫差大，灌溉便利，適宜發展設施蔬菜。番茄（）原產于南美洲，為茄科一年生或多年生草本植物。番茄果實富含胡蘿卜素、維生素、番茄紅素、鉀等營養物質，能減少心臟病發作，可抗癌防癌，降低血壓，延緩衰老，防治動脈硬化等。因其營養豐富，而且具有保健功能，已成為世界上最重要的蔬菜作物之一（夏冬，2014）。目前，寧夏已經成為我國重要的設施番茄生產基地，其栽培面積約占寧夏設施蔬菜總面積的26.5%（沙龍 等，2013）。隨著番茄栽培面積的不斷擴大，病害的發生范圍也越來越廣，嚴重阻礙了番茄的正常生產。

番茄病毒病是影響番茄安全生產的重要限制因素，已發現可以侵染番茄的病毒至少有136 種（Xu et al.，2017）。目前，已報道的侵染我國番茄的常見病毒有20 多種，如番茄褪綠病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）、番茄斑駁花葉病毒（tomato mottle mosaic virus，ToMMV）、番茄花葉病毒（tomato mosaic virus，ToMV）等（劉勇 等，2019）。2011年，寧夏銀川市園藝產業園首次發現番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）（沙龍等，2013），2016 年石嘴山市發生了番茄斑萎病毒?。╰omato spotted wilt virus，TSWV）（曹金強 等，2016）。許多病毒在侵染番茄后表現出類似的癥狀，且田間也經常發生多種病毒復合侵染的現象，因此難以通過肉眼觀察判斷病毒的種類。近些年分子生物學方法以其快速、靈敏、準確的優點，已經被廣泛地用于植物病毒的鑒定和診斷。

本試驗對在寧夏銀川地區采集到的番茄病毒病樣本進行分子生物學鑒定，以明確引起寧夏番茄病毒病的病毒種類，為有針對性地防控該病害的發生提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2021 年8 月，在寧夏銀川地區設施番茄生產基地調查了番茄病毒病發生情況，采集10 份番茄植株莖稈、葉柄和未成熟果實帶有褐色病斑等癥狀的植物樣本，分別裝在干凈的采集袋中，置于冰上運回實驗室，保存于-80 ℃冰箱。

植物總RNA 提取試劑：Trizol、氯仿∶異戊醇（24∶1）、異丙醇、75%乙醇、反轉錄試劑盒PrimeScript ? Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit〔購自寶日醫生物技術（北京）有限公司〕、2×Master Mix（Dye Plus）（購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

1.2 供試引物

本試驗所使用番茄病毒病分子檢測特異性引物共23 對，引物信息見表1。

表1 番茄病毒病分子檢測的引物信息

續表

1.3 植物總RNA 提取及反轉錄

取發病的葉柄、莖稈和果實樣本，加液氮研磨成粉末狀，轉移至1.5 mL 離心管中，加入1 mL Trizol，充分混勻；4 ℃、12 000 r·min離心5 min，取上清液移入另一個1.5 mL 離心管中；加入1/5 體積氯仿∶異戊醇（24∶1），充分混勻；4℃、12 000 r·min離心10 min，取上清液移入另一個1.5 mL 離心管中；加入等體積異丙醇，充分混勻；4 ℃、12 000 r·min離心10 min，倒掉上清液保留沉淀；用1 mL 75%乙醇漂洗，4 ℃、8 000 r·min離心10 min，倒掉上清液保留沉淀；晾干后，加入ddHO 50 μL。RNA 經定量后放入-80 ℃冰箱保存，備用。

以番茄感病樣本總RNA 為模板，使用PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒進行反轉錄。

1.4 RT-PCR 檢測

將反轉錄得到的cDNA 分別利用番茄常見病毒病特異性引物（表1）進行檢測。PCR 反應體系（20 μL）：各0.5 μL 上、下游引物，1 μL模板cDNA，10 μL 2×Master Mix（Dye Plus），ddHO 補足20 μL。反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環；72 ℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物。將PCR 產物送至博邁德基因技術有限公司（北京）進行測序。利用NCBI 核酸數據庫進行BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）序列比對，根據同源性確定病毒種類。

1.5 系統發育分析

保存BLAST 序列比對結果中相應分離物的序列。利用MEGA 6.0 軟件，對保存的序列進行分析。多序列比較分析采用ClustalW，采用鄰接法構建系統進化樹，重復1 000 次。

2 結果與分析

2.1 番茄病株的田間癥狀

2021 年寧夏地區溫室內番茄病毒病嚴重發生，主要癥狀包括：植株的葉柄和莖稈出現褐色、不規則形病斑，病斑大小不等，發病嚴重時病斑可繞莖一周（圖1-A、B）；未成熟果實表面出現褐色、不規則形病斑，隨著病情發展發病部位逐漸壞死、變硬，略微凸起，部分果實出現條紋或同心環紋（圖1-C、D）。

圖1 番茄病毒病植株田間癥狀

2.2 番茄病株樣品的RT-PCR 檢測

提取10 份番茄病株樣品的總RNA，以其為模板，利用不同番茄病毒的特異性引物進行RTPCR 擴增。結果表明：只有引物STVdF/STVdR和TSWV-F/TSWV-R 分別擴增出大小約為681 bp 和777 bp 的特異片段（圖2），其他引物均未擴增出特異片段。測序后經BLAST 比對，大小約為681 bp 特異片段的分離物與GenBank 上的南方番茄病毒（southern tomato virus，STV）的相似性達到100%，大小約為777 bp 特異片段的分離物與GenBank 上的TSWV 的相似性達到99%以上。表明寧夏銀川地區番茄被STV 與TSWV 復合侵染。

圖2 不同引物對番茄病毒病樣本RT-PCR 檢測結果

2.3 TSWV 和STV 聚類分析結果

將所得的TSWV 和STV 分離物的擴增子序列與GenBank 中TSWV 和STV 相應分離物序列進行比對，并選擇其他地區與本試驗中的序列最為接近的TSWV 和STV 分離物，構建系統進化樹（圖3）。結果顯示，寧夏銀川地區番茄上的TSWV 與西班牙辣椒上TSWV 分離物聚在同一分支上，表明進化關系最近，而與其他地區的親緣關系較遠；STV分離物與法國、巴基斯坦、哥倫比亞番茄上的STV分離物的進化關系最近，與其他地區的STV 分離物關系較遠。

圖3 基于TSWV（A）和STV（B）基因組部分核酸序列的系統進化樹

3 結論與討論

采用RT-PCR 方法對采集自寧夏銀川地區的疑似番茄病毒病的植株樣品進行了鑒定，并構建了系統發育樹，結果表明這些番茄被TSWV 和STV復合侵染。寧夏銀川地區番茄上的TSWV 分離物的進化關系與西班牙辣椒上的TSWV 分離物進化關系最近，STV 與法國、巴基斯坦和哥倫比亞番茄上的STV 分離物關系最近。

TSWV 屬于，可以侵染900 多種植物（包括農作物與雜草），如花生、辣椒、馬鈴薯、煙草、番茄、芹菜、南瓜和桔梗等（李云洲 等，2018），在我國許多地區均有TSWV 的為害（李潔等，2017），并且該病毒已經被列入中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄。TSWV 侵染苗期番茄引起生長點和葉片變成銅色并上卷，隨后出現黑斑點，葉片背面葉脈呈紫色，后期引起生長點和葉片壞死，整株萎蔫，果面有環狀病斑，尤其是果實完全成熟時病斑表型非常明顯（Chiemsombat &Adkins，2006；李潔 等，2017；王凱娜 等，2019；李婷婷 等，2020；石巖 等，2020）。據報道，TSWV 只能通過機械傳播和昆蟲傳播，不能通過種子傳播（李云洲 等，2018）。

STV病毒是近些年新發現和命名的一種病毒，屬于Amalgaviridae 科屬。目前已在美國、墨西哥、法國、西班牙、德國和中國等地區發現了STV，主要癥狀包括植株生長矮小，黃化，生長點壞死，果實較小，出現環形斑點等（Turina et al.，2007；Candresse et al.，2013；Gaafar et al.，2019）。除侵染番茄外，STV 還可以侵染藍莓、紫荊花以及杜鵑花等植物（蘇海娣，2013）。與TSWV 不同的是，STV 是嚴格的種傳病毒，不能通過汁液摩擦和嫁接傳播，也沒有發現通過昆蟲傳播（董云浩 等，2019）。

絕大多數病毒都是系統侵染植物，并且許多病毒侵染植株后出現了類似的發病癥狀，導致人們難以準確識別病毒的種類。在田間，多種病毒同時侵染植株的情況時有發生，更是增加了診斷難度?；诜肿由飳W的方法對病毒的種類進行鑒定，可以有效避免以上問題。目前，對田間植物病毒的鑒定越來越依賴于分子診斷。劉微等（2018）通過RTPCR 方法對云南元謀地區的疑似番茄病毒病進行了檢測，發現該地的番茄被番茄褪綠病毒和番茄黃化曲葉病毒復合侵染。Xu 等（2017）對我國的170個番茄樣品進行了小RNA 測序分析，共檢測到了22 種病毒，其中大多數樣品是被多種病毒共同侵染，同時認為STV 已經成為我國番茄上第四大流行病毒。鑒于兩種病毒傳播方式有所不同，在生產中應注意采取綜合措施進行防治，既要加強種子檢疫和種子消毒，同時也要注意防治昆蟲。