益心舒對缺血型心肌病大鼠心室重構和三磷酸腺苷含量的影響及機制

齊貴彬，高建步，張永杰，王星，張明磊，王新敏，李京倡，解莉莉

（南陽市中心醫院心血管內科，河南南陽473009）

心室重構和心肌組織能量代謝異常在缺血型心肌病的發生與發展中具有重要作用[1]。近年來研究發現，缺血型心肌病大鼠模型存在心室重構、心肌組織中三磷酸腺苷（ATP）含量明顯降低現象，改善能量代謝類藥物能夠改善心功能和缺血型心肌病癥狀[2]。益心舒膠囊是由丹參、人參、五味子、黃芪等組成的復方制劑，具有溫陽、活血、化瘀等作用，有助于改善缺血型心肌病的臨床癥狀[3]。本研究通過建立缺血型心肌病大鼠模型，觀察益心舒對缺血型心肌病大鼠心室重構和ATP含量的影響，并探討相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD 大鼠60 只，體質量190～210 g，購于北京斯貝福生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2019?0010。

1.2 主要藥品、試劑

益心舒膠囊購于貴州信邦制藥股份有限公司，國藥準字Z52020038，規格每粒0.4 g，批號B14000033276；卡維地洛片購于北京巨能制藥有限責任公司，國藥準字H19991108，規格每片20 mg，線粒體膜電位檢測試劑盒JC?1 購于廈門生光生物科技有限公司，批號CA1310?100；SDS?PAGE 凝膠制備試劑盒購于上海尚寶生物有限公司，批號10312；鼠抗人β?抑制蛋白單克隆抗體，（批號DK1052）、鼠抗人磷酸化p38MAPK 蛋白單克隆抗體，（批號DK8524）、鼠抗人解偶聯蛋白2 單克隆抗體單克隆抗體，（批號DK5271）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG（批號HDK0221），均購于武漢科茵生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

Voluson S6彩色超聲診斷儀購于美國GE 公司；CMY?10 型手持式組織勻漿機購于上海測博生物科技有限公司；Eppendorf5418R 高速離心機購于德國艾本德股份公司；PT?350C 全波長酶標儀購于北京普天新橋技術有限公司。

1.4 方法

1.4.1 缺血型心肌病大鼠模型制備[4]隨機選取12只大鼠為正常對照組，另外的大鼠采用左側冠狀動脈前降支結扎術制備缺血型心肌病模型。具體方法如下：術前禁食8 h，按300 mg/kg的劑量腹腔注射10%（φ）水合氯醛麻醉，在胸骨左側第4和第5肋間隙處開胸，將心臟擠出，在肺動脈圓錐和左心耳交界處距離根部1 mm的位置結扎，將心臟迅速放回胸腔，排出胸腔中氣體后縫合。將存活的大鼠常規飼養4周，自由進食、飲水，4周后進行彩色超聲診斷儀檢查，左室射血分數低于50%為缺血型心肌病造模成功。

1.4.2 分組與給藥取36只造模成功的大鼠，隨機分為模型組、益心舒組、卡維地洛組，每組12只。正常對照組12只大鼠在冠脈前降支距離根部1 mm 的位置僅穿線不結扎，其余操作與另外3組相同。根據人體給藥劑量折合后益心舒組大鼠給藥劑量為20 mg/kg，使用0.9%氯化鈉溶液配制成質量濃度為0.8 mg/mL的益心舒藥液；卡維地洛組大鼠給藥劑量為10 mg/kg，使用0.9%（ρ）氯化鈉溶液配制成質量濃度為0.5 mg/mL的卡維地洛藥液；正常對照組和模型組給予相同體積的蒸餾水。每日灌胃1 次，4 周1 個療程。

1.4.3 左心室結構和心室重構指標檢測使用彩色超聲診斷儀進行檢測，左心室結構改變情況觀察指標包括：左心室后壁厚度、室間隔厚度、左心室舒張末期內徑、左心室收縮末期內徑，均連續檢測3個心動周期，取平均值。心室重構指標包括：左心室質量指數=左心室濕質量/大鼠體質量，右心室質量指數=右心室濕質量/大鼠體質量。

1.3.4 心肌ATP 含量測定取各組大鼠心肌組織適量，使用組織勻漿機處理后，4 ℃12 000 r/min離心10 min，收集上清液，加入96孔板中，70 μL/孔，按試劑盒說明書加入相應試劑，上酶標儀檢測，使用考馬斯亮藍法測定每個標本的總蛋白濃度，心肌ATP含量最終以ng/mg prot表示。

1.4.5 心肌線粒體膜電位檢測[5]取各組大鼠心肌組織約40 mg，手術剪碎后加入牛胰蛋白酶，進行組織勻漿，采用差速離心法獲得線粒體。熒光探針JC?1 檢測線粒體跨膜電勢差，操作按試劑盒說明書進行，結果用線粒體膜電位發射率（ER）值表示，計算公式：EK=590 nm熒光強度/527 nm熒光強度。

1.4.6 Western blot 檢測取各組大鼠心肌組織適量勻漿，4 ℃12 000 r/min離心10 min，取上清液，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。以100 μg 蛋白上樣量進行10% SDS?PAGE 凝膠電泳后轉至聚偏二氟乙烯膜，室溫下封閉1 h，洗滌后滴加1∶500 倍稀釋的鼠抗人β?抑制蛋白單克隆抗體，1∶1 000倍稀釋的鼠抗人磷酸化p38MAPK 蛋白、鼠抗人解偶聯蛋白2 單克隆抗體，以及1∶2 000 倍稀釋的鼠抗人GAPDH 單克隆抗體，4 ℃過夜，次日加入1∶2 000 倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG，37 ℃反應2 h，增強化學發光法顯色后分析β?抑制蛋白、磷酸化p38MAPK蛋白、鼠抗人解偶聯蛋白2的表達水平。

1.5 統計學分析

使用SPSS23.0 統計學分析軟件進行數據處理，實驗數據以x±s表示，采用方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠左心室結構的變化情況

模型組大鼠左心室后壁厚度、室間隔厚度、左心室舒張末期內徑明顯低于正常對照組，左心室收縮末期內徑明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；益心舒組和卡維地洛組大鼠左心室后壁厚度、室間隔厚度、左心室舒張末期內徑明顯高于模型組，左心室收縮末期內徑明顯低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；左心室后壁厚度、室間隔厚度、左心室舒張末期內徑、左心室收縮末期內徑在益心舒組與卡維地洛組大鼠之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組左心室結構相關指標比較Table 1 Comparison of relevant indexes of left ventricular structure in each group(±s,n=12)

表1 各組左心室結構相關指標比較Table 1 Comparison of relevant indexes of left ventricular structure in each group(±s,n=12)

與正常對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05。

組別正常對照組模型組益心舒組卡維地洛組劑量/（mg·kg-1）--2 0 10左心室后壁厚度/mm 2.64±0.31 1.52±0.15**1.89±0.20#1.93±0.25#室間隔厚度/mm 2.81±0.29 1.58±0.17**2.06±0.24#2.12±0.27#左心室舒張末期內徑/%6.83±0.59 4.46±0.43**5.27±0.51#5.09±0.46#左心室收縮末期內徑/%1.18±0.11 2.36±0.24*1.71±0.18#1.79±0.21#

2.2 各組大鼠心室重構指標變化情況

模型組大鼠左心室質量指數、右心室質量指數明顯高于正常對照組（P＜0.05或P＜0.01），益心舒組和卡維地洛組大鼠左心室質量指數、右心室質量指數明顯低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）；左心室質量指數、右心室質量指數在益心舒組與卡維地洛組大鼠之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心室重構指標變化情況分析Table 2 Analysis of changes in ventricular remodeling indexes of rats in each group(±s,n=12) w/(mg·g-1)

表2 各組大鼠心室重構指標變化情況分析Table 2 Analysis of changes in ventricular remodeling indexes of rats in each group(±s,n=12) w/(mg·g-1)

與正常對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常對照組模型組益心舒組卡維地洛組劑量/（mg·kg-1）--2 0 10左心室質量指數1.62±0.15 3.05±0.24**1.98±0.19##1.91±0.17##右心室質量指數0.50±0.06 0.96±0.11*0.71±0.09#0.68±0.07#

2.3 各組大鼠ATP含量和線粒體膜電位水平比較

模型組大鼠ATP 含量、線粒體膜電位ER 值明顯低于正常對照組（P＜0.05或P＜0.01）；益心舒組和卡維地洛組大鼠ATP 含量、線粒體膜電位ER 值明顯高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）；ATP 含量、線粒體膜電位ER 值在益心舒組與卡維地洛組間比較差異無統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠ATP含量和線粒體膜電位水平比較Table 3 Comparison of ATP content and mitochondrial membrane potential of rats in each group(±s,n=12)

表3 各組大鼠ATP含量和線粒體膜電位水平比較Table 3 Comparison of ATP content and mitochondrial membrane potential of rats in each group(±s,n=12)

與正常對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常對照組模型組益心舒組卡維地洛組劑量/（mg·kg-1）--2 0 10 ATP含量/（ng·mg-1）10.35±0.47 1.92±0.09**9.86±0.44##10.09±0.41##線粒體膜電位ER值/%4.61±0.34 2.25±0.11*4.53±0.28#4.49±0.25#

2.4 各組大鼠相關蛋白表達水平比較

模型組大鼠β?抑制蛋白表達水平明顯低于正常對照組，磷酸化p38MAPK蛋白、解偶聯蛋白2表達水平明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；益心舒組和卡維地洛組大鼠β?抑制蛋白表達水平明顯高于模型組，磷酸化p38MAPK 蛋白、解偶聯蛋白2 表達水平明顯低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表4，圖1。

表4 各組大鼠相關蛋白表達水平比較Table 4 Comparison of expression levels of related proteins in rats of each group (±s,n=12)

表4 各組大鼠相關蛋白表達水平比較Table 4 Comparison of expression levels of related proteins in rats of each group (±s,n=12)

與正常對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常對照組模型組益心舒組卡維地洛組劑量/（mg·kg-1）--2 0 10 β?抑制蛋白0.95±0.08 0.52±0.14**0.74±0.16#0.77±0.14#磷酸化p38MAPK蛋白0.21±0.05 0.92±0.11**0.47±0.15##0.41±0.13##解偶聯蛋白2 0.16±0.03 0.84±0.08**0.29±0.14##0.23±0.11##

圖1 各組大鼠相關蛋白表達的Western blot電泳圖Figure 1 Western blot electrophoresis of rat related protein expression in each group

3 討論

缺血型心肌病是常見的心血管系統疾病，主要由于心肌損傷，心臟長期處于高負荷導致心室供血不足，引發的一系列失代償反應[6]。在中醫理論中將其歸屬為“胸痹”“怔忡”等范疇，治療原則以溫陽、活血、化瘀、通脈等為主[7]。益心舒膠囊組分包括丹參、人參、五味子、黃芪等，具有溫陽、活血、化瘀等作用。已有的藥理學研究顯示，益心舒膠囊能夠改善心肌對缺氧的耐受能力，擴張冠狀動脈并增加血流量[8]。β-抑制蛋白家族作為一種信號蛋白參與人體的多種生理過程，包括反式激活、泛素化、去磷酸化等效應[9]。由于β?抑制蛋白具有多個作用靶點，已成為目前研究熱點之一。磷酸化p38MAPK蛋白在人體細胞中廣泛分布，在缺氧、輻射、炎癥等多種因素的作用下被激活，是β?抑制蛋白下游的重要靶點[10]。相關研究顯示，p38MAPK蛋白被激活與心力衰竭密切相關，可能與誘發心肌細胞凋亡和心室重構有關[11]。

本研究結果顯示，益心舒組和卡維地洛組大鼠左心室后壁厚度、室間隔厚度、左心室舒張末期內徑明顯升高，左心室收縮末期內徑、左心室質量指數、右心室質量指數明顯降低，且在上述兩組間無明顯差異，提示益心舒膠囊和卡維地洛能夠明顯抑制缺血型心肌病大鼠的心室重構。進一步分析發現，益心舒組和卡維地洛組大鼠β?抑制蛋白高表達，磷酸化p38MAPK 蛋白低表達，可推測益心舒膠囊抑制缺血型心肌病大鼠心室重構的機制可能與調節心肌細胞中β?抑制蛋白、磷酸化p38MAPK 蛋白表達有關。

心肌能量供應不足導致心臟結構和功能受損參與缺血型心肌病的發生與發展，是心室重構進展的主要因素[12]。線粒體是細胞能量代謝的主要場所，解偶聯蛋白2是線粒體內膜兩側的質子轉運體，通過改變線粒體的膜電位水平來調節心肌能量代謝[13]。相關研究顯示，在缺血型心肌病早期，解偶聯蛋白2 能夠抑制超氧陰離子分泌和細胞凋亡，穩定細胞鈣離子水平[14]；隨著缺血型心肌病的進展，解偶聯蛋白2表達不斷上調，解偶聯作用增強，對心肌代謝產生不良影響，造成心肌細胞興奮和收縮偶聯異常，心功能下降[15]。本研究結果顯示，模型組大鼠ATP 含量、線粒體膜電位ER 值明顯降低；益心舒組和卡維地洛組大鼠ATP 含量、線粒體膜電位ER 值明顯升高，且在上述兩組間無明顯差異，提示缺血型心肌病存在明顯的能量代謝障礙，益心舒膠囊能夠明顯改善缺血型心肌病大鼠的能量代謝，效果與卡維地洛相當。進一步分析顯示，益心舒組和卡維地洛組大鼠解偶聯蛋白2 低表達，提示益心舒膠囊可通過抑制缺血型心肌病大鼠偶聯蛋白2 的過表達，穩定線粒體膜電位，保證氧化磷酸化進行，提高心肌ATP 含量，增強心肌收縮力，改善心功能。本研究為益心舒膠囊的臨床應用提供了理論基礎。