酸棗仁蛋白的不同蛋白酶酶解產物功能特性及抗氧化活性分析

張 雙，韓榮欣，王 欣，肖鳳琴，李 佳，董紅影，李光哲，嚴銘銘,2,

（1.長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117；2.吉林省中藥保健食品科技創新中心，吉林 長春 130117；3.長春中醫藥大學藥學院，吉林 長春 130117）

神農本草經記載的酸棗仁，為鼠李科植物酸棗（Ziziphus jujubeMill.）的干燥成熟種子，是我國臨床應用的傳統中藥，主產于河北、陜西、遼寧、河南等地。酸棗仁性味酸、甘平微溫，具有養肝、寧心安神、斂汗生津的功效，主治虛煩不眠，驚悸怔祌，煩渴虛汗等癥[1]。酸棗仁中富含多種有效成分，主要為黃酮、生物堿、皂苷、揮發油、蛋白質等，其中，蛋白質占其干重的40%，約含有18種人體所需氨基酸。酸棗仁具有良好的食品功能特性，是理想的功能產品和植物蛋白來源[2]。前期研究發現，酸棗仁蛋白具有一定的抗氧化、抗疲勞以及增強免疫功能等生物活性[3]。但經實驗及文獻研究發現，由于蛋白質復雜的空間結構以及較大的分子質量，導致酸棗仁蛋白的部分性質較一般（如溶解性、抗氧化性等），絕大部分不能夠被人體攝入利用，營養價值得不到充分地發揮[4]。相關研究表明，多肽具有大分子蛋白質和游離氨基酸所不具備的生物學活性，且更容易被人體吸收，逐漸成為近年來食品領域的研究熱點。

酶解法是國內外生產多肽的主要方法，是一種酶促降解蛋白達到提取、改性目的的方法，具有反應條件溫和、副產物少等優點，還可以進一步通過分離純化得到具有多種理想功能特性和高營養的多肽。隨著研究的不斷深入，從不同蛋白酶解產物中分離得到的多肽在人體調節中起到了重要作用，具有降血壓、抗氧化、降膽固醇、降血糖、調節免疫等生理功能，可以作為潛在的食品添加劑，提高食品的營養價值，大大改善了食品的品質[5]。近年來，關于蛋白水解物的研究已有許多報道，研究證明水解物都具有較好的功能特性和生物活性。有研究表明，不同的蛋白酶解產物可產生不同的理化性質、功能特性以及生物活性，閻震等[6]用多種蛋白酶對牡丹籽蛋白進行酶解處理，所得的不同蛋白酶解產物理化性質及抗氧化活性均具有差異，其中，堿性蛋白酶解產物具有更高的水解度、更小的粒徑以及更強的體外抗氧化活性。這是由于不同種類的蛋白酶在蛋白質鏈中有不同的活性位點和切割位點。

目前，有關酸棗仁蛋白酶解產物的研究較少，而不同蛋白酶處理酸棗仁蛋白的研究尚未發現。趙節昌[7]關于酶解酸棗仁蛋白制備抗氧化肽的研究結果表明，酸棗仁蛋白酶解物具有良好的DPPH自由基清除活性，但對其他的功能特性和抗氧化活性尚無研究。因此，本研究以酸棗仁蛋白為原料，采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶分別對酸棗仁蛋白進行酶解，并對不同酸棗仁蛋白酶解產物的功能特性和體外抗氧化活性進行研究，以期得到具有良好功能特性及抗氧化活性的蛋白酶解產物，為酸棗仁這種藥食同源中藥材在食品及保健食品行業中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁藥材 長春中醫藥大學附屬醫院；堿性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、木瓜蛋白酶（0.5～2 U/mg） 購于上海源葉生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS） 美國 sigma公司；考馬斯亮藍R-250、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS） 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

HX-400A型高速中藥粉碎機 浙江省永康市溪岸五金藥具廠；Y50型養生破壁機 中山市奧英斯電器有限公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋 金壇市佳美儀器有限公司；DF-101S型集熱式磁力攪拌器金壇市醫療器械廠；SCIENTZ-50F型冷凍干燥機寧波新芝凍干設備股份有限公司；PowerPac Basic型蛋白電泳裝置 BIO-RAD；UV-1700型紫外分光光度計、2010A型高效液相色譜儀 日本島津（中國）有限公司；S220-K-CN型臺式pH計 梅特勒—托利多國際貿易（上海）有限公司；AB265-S型電子分析天平 梅特勒—托利多國際貿易（上海）有限公司；Centrifuge 5840 R型高速離心機 德國eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸棗仁蛋白的提取 取適量酸棗仁藥材，粉碎后過60目篩，置于5倍體積的石油醚中攪拌脫脂24 h，在3000 r/min室溫下離心10 min除去石油醚，沉淀放置在通風櫥中干燥，過60目篩。取均一的脫脂酸棗仁粉末150 g，按料液比1:20（g/mL）加入3000 mL蒸餾水溶解，配制1 mol/L NaOH溶液調節pH10，在55 ℃恒溫水浴鍋中攪拌50 min，冷卻放涼后4000 r/min離心20 min，取上清液進行酸沉，用1 mol/L鹽酸溶液調節pH4，4 ℃靜置2 h，繼續4000 r/min離心10 min，沉淀加水用養生破壁機復溶，用1 mol/L NaOH溶液調至中性，裝袋透析48 h，期間每2 h換一次水，?80 ℃凍干得酸棗仁蛋白[8]。

1.2.2 酸棗仁蛋白的酶解 取蒸餾水100 mL，加入酸棗仁蛋白5 g，溶解制成5%的蛋白溶液，分別在各酶的最適條件下進行酶解，具體條件見表1。將蛋白溶液置于55 ℃水浴鍋中保溫放置，用1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L HCl溶液調節pH至酶最適pH后，分別加入不同種類的蛋白酶0.1 g（酶與底物比為2%），酶解過程中每隔20 min用1 mol/L NaOH溶液維持反應體系的pH，酶解時間為3 h，結束后沸水滅酶10 min，冷卻至室溫，8000 r/min離心10 min，取上清液冷凍干燥，?20 ℃保存備用[9]。

1.2.3 水解度的測定 總氮含量：采用GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法進行測定。氨態氮含量：采用GB 5009.235-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態氮的測定》中的酸度計法進行測定[10]。稱量5.0 g試樣于50 mL燒杯中，用水分數次洗入100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取20.0 mL置于200 mL燒杯中，加60 mL水,開動磁力攪拌器，用氫氧化鈉標準溶液[c（NaOH）=0.050 mol/L]滴定至酸度計指示pH為8.2，記下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數，可計算總酸含量。加入10.0 mL甲醛溶液，混勻。再用氫氧化鈉標準滴定溶液繼續滴定至pH為9.2，記下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數。同時取80 mL水，先用氫氧化鈉標準溶液調節至pH為8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至pH為9.2，做試劑空白試驗。

1.2.4 多肽含量的測定 采用福林酚法[11]對三種蛋白酶解產物中的多肽含量進行測定。配制福林酚試劑甲、試劑乙。分別取樣品溶液1.3 mL，加水稀釋并定容至100 mL，得多肽含量大約為0.14 mg/mL的供試品溶液，待測。取1 mL樣品溶液（約合20～250 μg多肽）加入5 mL試劑甲混勻，于20～25 ℃放置10 min，再加0.5 mL試劑乙（Folin-酚），立即搖勻，在20～25 ℃保溫30 min然后于500 nm處比色，以1 mL水代替樣品作空白對照。測定后，可以在標準曲線中查出未知樣品的濃度。取0.2 mL樣品溶液（約含5～100 μg多肽）加入1 mL試劑甲（選用0.3～0.5 cm直徑的小試管）混勻，10 min后，加入0.1 mL試劑乙，立即混勻，30 min后比色。

1.2.5 SDS-PAGE電泳分析 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳使用12.5%分離凝膠和5%濃縮凝膠，酸棗仁蛋白或酶解物和上樣緩沖液以1:1的比例混合，混合溶液在100 ℃加熱5 min。待其冷卻至室溫后，向凝膠中加入10 μL混合溶液上樣。用Bio-Rad電泳儀進行SDS-PAGE電泳[12]，樣品在70 V下運行30 min，在140 V下運行1 h。凝膠在考馬斯亮藍R250中染色，并在脫色溶液（冰醋酸:甲醇:水=20:60:120）中脫色。最后，所得凝膠在凝膠成像儀中拍照成像。

1.2.6 溶解性的測定 加蒸餾水于酶解物中配制成0.1%的溶液，分別調節溶液pH（2～10），離心15 min（5000 r/min），取上清液補足至1 mL，用福林酚法分別測定上清液和樣品溶液中的多肽含量。

1.2.7 持水性、持油性測定 持水性：取酸棗仁蛋白酶解產物0.5 g，置于10 mL離心管中，加入10 mL蒸餾水，混勻，放置室溫25 ℃下30 min，4000 r/min離心20 min，去除上清稱量刻度離心管的質量。

式中：m0：樣品質量（g），m1：樣品質量+離心管質量（g），m2：離心管質量+去除上清液的樣品質量。

持油性：在10 mL離心管中加入0.5 g酶解物，3 mL大豆色拉油，充分混勻樣品與色拉油，在室溫條件下放置30 min，4000 r/min離心20 min，棄去上層未被吸附的色拉油，稱量質量。

式中：m0：樣品質量（g），m1：離心管質量+樣品質量（g），m2：離心管質量+吸油后的樣品質量（g）。

1.2.8 起泡性及其泡沫穩定性 稱50 mL 1%的樣品溶液，分別調pH（2～10），記體積V0，置于10000 r/min高速分散器中1 min，記總體積V1，30 min后記總體積V2。

1.2.9 乳化性及其穩定性 配制9 mL 1%的蛋白及樣品溶液，分別調節pH（2、4、6、8、10、12），加入3 mL大豆色拉油，10000 r/min均質2 min，攪打成均一的乳化液，取50 mL于試管中，加入5 mL 0.1% SDS溶液，設置500 nm測吸光值A1，30 min后測吸光度A2[13]。

式中：Φ：油相的體積分數（%）；D:稀釋倍數；c：酸棗仁蛋白酶解產物質量濃度（g/mL）；t：時間（min）；L：光程（1 cm）；2.303表示ln10。

1.2.10 抗氧化活性的測定

1.2.1 0.1 DPPH自由基清除率測定 加蒸餾水于一定質量的酶解物中配制成不同質量濃度的溶液；分別吸取1 mL樣品溶液與DPPH溶液混勻，室溫下避光反應30 min，測定517 nm處吸光度；以1 mL蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照組，以0.5 mL蒸餾水+0.5 mL 95%乙醇混合溶液代替DPPH溶液作為樣品對照組[14]，以維生素C、谷胱甘肽為陽性對照組，并按下式計算DPPH自由基清除率。

式中：S：DPPH自由基清除率（%）；A0：空白對照組吸光值；A1：樣品組吸光值；A2：樣品對照組吸光值。

1.2.1 0.2 ABTS自由基清除率測定 將5 mL濃度為7.4 mmol/L的ABTS溶液與88 μL 2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液混勻，靜置12～16 h，配制成ABTS+儲備液。取ABTS+儲備液0.4 mL，用pH7.4的PBS溶液稀釋，使734 nm處吸光度為0.7±0.02，制成ABTS+工作液[15]。分別將200 μL ABTS+工作液與10 μL不同濃度的樣品溶液混勻，室溫避光反應6 min，測定734 nm處吸光度值。用10 μL PBS溶液代替樣品溶液作為空白對照組，以維生素C、谷胱甘肽為樣品對照組，按下式計算ABTS自由基清除率。

式中：S：ABTS自由基清除率（%）；A0：空白對照組吸光值；A1：樣品組吸光值；A2：樣品對照組吸光值。

1.2.1 0.3 超氧陰離子清除率測定 采用鄰苯三酚自氧化法[16]。將5 mL Tris-HCl緩沖溶液（0.05 mol/L，pH 8.2）和0.5 mL不同濃度樣品溶液混合，于25 ℃水浴中反應20 min，然后加入在25 ℃下預熱0.5 mL鄰苯三酚溶液（7 mmol/L）。每隔10 s在325 nm處測定混合物的吸光度，即為實驗組A1。以0.3 mL蒸餾水代替鄰苯三酚溶液作為樣品對照組A2，以0.1 mL蒸溜水代替樣品液作為空白對照組A0。并于420 nm處測定吸光度值，蒸餾水調0。按下式計算超氧陰離子的清除率：

式中：S：超氧陰離子清除率（%）；A0：為空白對照組吸光值；A1：樣品組吸光值；A2：樣品對照組吸光值。

1.2.1 0.4 羥基自由基清除率的測定 將1.0 mL樣品溶液與FeSO4（1.0 mL，2 mmol/L）及水楊酸乙醇溶液（1.0 mL，6 mmol/L）混合。隨后，向溶液中添加1.0 mL H2O2（6 mmol/L），37 ℃水浴反應1 h后，在510 nm處立即測定吸光度[17]。1 mL蒸餾水代替H2O2，測定吸光度值作為樣品對照組；1 mL蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照；以照維生素C代替樣品作為樣品陽性對照組，按下式計算羥基自由基的清除率：

式中：S：羥基自由基清除率，%；A0：空白對照組吸光值；A1：樣品組吸光值；A2：樣品對照組吸光值。

1.3 數據處理

所有試驗平行測定3次，結果取平均值，使用Origin 2019和SPSS 20.0軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 水解度（DH）的測定

酶解法作為常用的蛋白質改性方法，現已得到廣泛地應用，其中，蛋白酶種類是影響酶解過程的一個重要因素，蛋白酶能夠將蛋白質水解成為小分子肽類和氨基酸[18]。由于蛋白酶具有底物專一性，不同種類的蛋白酶，其酶切位點也不相同，進而可導致酶解產物的理化性質及生物活性不同[19]。酸棗仁蛋白不同蛋白酶解產物的水解度測定結果如圖1所示，不同酸棗仁蛋白酶解產物的水解度隨著時間的延長而增大。反應開始的前3 h內，不同酶解產物的水解度增長速率較快，當反應時間超過3 h后，增長趨勢較為平緩，所以后續實驗均采用了3 h作為水解的最適時間。實驗結果表明，相比于中性蛋白酶解產物（16.94%）及木瓜蛋白酶解產物（12.89%），堿性蛋白酶解產物具有更高的水解度（22.91%），可能是由于堿性蛋白酶是一種內切蛋白酶，具有更多的催化位點來切斷蛋白質中的肽鍵，使得酶解反應更加完全[20]。

圖1 不同酸棗仁蛋白酶解產物的水解度Fig.1 Degree of hydrolysis of enzymatic hydrolysates from different Ziziphi Spinosae semen protein

2.2 電泳結果分析

SDS-PAGE通常用于蛋白質分子量和亞基組成分析。在還原條件下酸棗仁蛋白及其不同酶解產物的電泳圖如圖2所示。結果表明，酸棗仁蛋白主要由10～40 kDa（15、20、25、35、40 kDa）范圍內的五條主要低分子量亞基組成。經不同蛋白酶處理后，不同蛋白酶解物的條帶轉移到低分子量范圍，條帶主要分布在15 kDa以下，表明酶解后分子量較大的蛋白亞基被降解，產生分子量較小的片段。其中，中性蛋白酶解產物及木瓜蛋白酶解產物在22 kDa處仍具有一定的蛋白條帶，而堿性蛋白酶解產物中未發現此情況，進一步結合水解度測定結果分析，表明堿性蛋白酶可使水解反應更完全，產生更多具有小分子量的肽段。

圖2 SDS-PAGE電泳檢測結果Fig.2 Results of SDS-PAGE electrophoresis

2.3 不同酸棗仁蛋白酶解產物的溶解性

3種酶解產物在不同pH條件下的溶解性由圖3所示，結果表明，木瓜蛋白酶解產物的溶解度最大，其次是堿性蛋白酶解產物，最后是中性蛋白酶解產物，這可能是由于不同酶解產物其氨基酸序列及所得到的肽段長度存在一定的差異而導致的。3種酶解物在pH2～10范圍內的溶解性均高于酸棗仁蛋白，這可能是由于酶解后，肽鍵斷裂形成了部分更小的肽段以及部分親水性基團，進而導致其溶解性增強[21]。當pH為4時，木瓜蛋白酶解物、中性蛋白酶解物、堿性蛋白酶解物的溶解度最小，達到了酸棗仁蛋白的等電點，分子聚合，溶解性降低[22]。隨著pH升高，不同蛋白酶解產物的溶解性逐漸增強。以上研究表明酸棗仁蛋白酶解產物具有很好的溶解性。

圖3 不同酸棗仁蛋白酶解產物的溶解性Fig.3 Solubility of hydrolysates from different Ziziphi Spinosae semen protein

2.4 不同酸棗仁蛋白酶解產物的持水性和持油性

3種不同酸棗仁蛋白酶解產物的持水性和持油性如圖4所示，相比于酸棗仁蛋白，持水性明顯降低，這可能與酶解產物本身的溶解性有較大關系，酶解后溶解性明顯增強，導致其對水的吸附能力變差，進而降低了持水性[23]。此外，由圖4可知，相比于酸棗仁蛋白，不同的酸棗仁蛋白酶解產物持油性均有明顯提升，由于不同種類蛋白酶的作用位點不同，酶解獲得的多肽片段也不相同，表現出的功能特性存在差異，其中，木瓜蛋白酶的持油性最大，這是由于酶解使得蛋白質的空間結構被破壞，部分親脂基團外露，影響了木瓜蛋白酶的構象和催化活性，進而影響其與底物的結合和催化，通過疏水作用增強蛋白質與油脂的結合能力，進一步增強了持油能力[24]。

圖4 不同酸棗仁蛋白酶解產物的持水性及持油性Fig.4 Water and oil holding capacity of enzymatic hydrolysates from different Ziziphi Spinosae semen protein

2.5 不同酸棗仁蛋白酶解產物的起泡性和起泡穩定性

3種不同酸棗仁蛋白酶解產物的起泡性和起泡穩定性如圖5、圖6所示，不同酸棗仁蛋白酶解產物的起泡性強弱為：木瓜蛋白酶解產物>堿性蛋白酶解產物>中性蛋白酶解產物。和酸棗仁蛋白相比，酶解產物的起泡性明顯提升，因為酶解產物的溶解性明顯增強，溶液的分散性增加，進一步增強了其起泡性能[25]。酸棗仁蛋白及其酶解產物在pH（2～10）范圍內，起泡性先減弱后增強，在pH4時最低，此時達到了蛋白質的等電點，溶解性較差，分散在溶液中的蛋白質較少，進一步導致其起泡性較差，隨著pH的逐漸升高，不同酸棗仁蛋白酶解產物的溶解性逐漸增強，其起泡性也隨之增強。以上研究結果表明，不同酸棗仁蛋白酶解產物均具有良好起泡性能，可將其添加到泡沫型食品中，增添食品的風味，減少化學起泡劑的使用[26]。

圖5 不同酸棗仁蛋白酶解產物的起泡性Fig.5 Foaming properties of enzymatic hydrolysates from different Ziziphi Spinosae semen protein

圖6 不同酸棗仁蛋白酶解產物的起泡穩定性Fig.6 Foaming stability of enzymatic hydrolysates from different Ziziphi Spinosae semen protein

2.6 不同酸棗仁蛋白酶解物的乳化性和乳化穩定性

不同酸棗仁蛋白酶解物的乳化性及其穩定性如圖7、圖8所示。由圖可知，相比于酸棗仁蛋白，木瓜蛋白酶解產物、中性蛋白酶解產物及堿性蛋白酶解物乳化性和乳化穩定性均有明顯提升，這可能是由于酶解過程中，蛋白質中的疏水性殘基進一步暴露，增強了與油的結合能力，使得蛋白質更快更多的與油水界面吸附，增強了乳化性[27]。研究表明，木瓜蛋白酶解產物的乳化性略高于堿性蛋白酶解產物及中性蛋白酶解產物，這可能與其溶解度有關，溶解度高的酶解產物，溶液中蛋白質分子含量較高，與油水界面接觸吸附的能力就越強，導致其乳化性較強[28]，堿性蛋白酶的乳化穩定性強于中性蛋白酶和木瓜蛋白酶解物。以上研究結果表明，酶解后可進一步提高酸棗仁蛋白的乳化性能，所得的酶解產物具有較好的食品功能特性。

圖7 不同酸棗仁蛋白酶解產物乳化性Fig.7 Emulsifying properties of different enzymatic hydrolysates from Ziziphi Spinosae semen protein

圖8 不同酸棗仁蛋白酶解產物乳化穩定性Fig.8 Emulsification stability of different enzymatic hydrolysates of Ziziphi Spinosae semen protein

2.7 酸棗仁蛋白酶解物的體外抗氧化活性

2.7.1 DPPH自由基清除能力 不同酸棗仁蛋白酶解物的DPPH自由基清除能力由圖9所示，當質量濃度在0.5～2.5 mg/mL范圍內，酸棗仁蛋白及其不同酶解產物的DPPH自由基清除能力隨濃度不斷的增加而不斷增強，不同酸棗仁蛋白酶解產物的DPPH自由基清除能力均明顯高于酸棗仁蛋白。相同質量濃度時，堿性蛋白酶解物的DPPH清除能力最強，其次是中性蛋白酶解產物，木瓜蛋白酶解物的清除能力最弱，當濃度為2.5 mg/mL時，堿性蛋白酶解產物的清除能力可高達95.87%，逐漸接近于陽性對照組VC的清除能力，且高于常見的抗氧化肽谷胱甘肽（GSH）的清除能力。這是由于堿性蛋白酶酶解時，堿性蛋白酶解物中的疏水性氨基酸含量較高，脂溶性的DPPH與其更好的結合，對DPPH的清除能力明顯增強[29]。以上研究結果表明酸棗仁蛋白酶解產物具有很強的DPPH自由基清除活性。

圖9 不同酸棗仁蛋白酶解產物對DPPH自由基清除能力Fig.9 DPPH radical scavenging ability of different enzymolysis hydrolysates of Ziziphi Spinosae semen protein

2.7.2 ABTS自由基清除能力 不同酸棗仁蛋白酶解物的ABTS自由基清除能力如圖10所示，當質量濃度為0.5～2.5 mg/mL范圍內時，酸棗仁蛋白及其酶解物對ABTS自由基清除活性隨質量濃度的增加而增強。結果表明，不同酶解產物的ABTS自由基清除能力均明顯增強。在相同質量濃度下，堿性蛋白酶酶解后的蛋白酶解物對ABTS自由基清除率明顯高于酸性蛋白酶和中性蛋白酶處理的蛋白酶解物。當質量濃度為2.5 mg/mL時，對ABTS自由基清除率最高達到90.84%，接近于陽性對照組VC及GSH的清除能力，表明堿性蛋白酶解物具有較強的ABTS自由基清除能力，可作為一種潛在的抗氧化劑[30]。

2.7.3 超氧陰離子自由基清除能力 不同酸棗仁蛋白酶解物超氧陰離子自由基清除能力如圖11所示，當質量濃度為0.5～2.5 mg/mL范圍時，酸棗仁蛋白及其酶解產物對超氧陰離子的清除活性與樣品濃度呈正相關，均在2.5 mg/mL時具有最高的清除活性。其中堿性蛋白酶解產物的超氧陰離子自由基清除效果最好，其次是中性蛋白酶，木瓜蛋白酶解產物最差。相比于酸棗仁蛋白，不同酸棗仁蛋白酶解產物的自由基清除活性均具有明顯提升，表明酶解處理可明顯提高蛋白質的抗氧化性。當質量濃度為2.5 mg/mL時，堿性蛋白酶酶解物的超氧陰離子清除率最高為44.77%，中性蛋白酶解產物超氧陰離子清除率為38.35%，木瓜蛋白酶解產物超氧陰離子清除率為20.33%。其中堿性蛋白酶解物清除效果好與其產生大量的疏水性氨基酸與自由基結合從而產生良好的抗氧化效果有關[31]。

圖11 不同酸棗仁蛋白酶解產物對超氧陰離子的清除活性Fig.11 O2?· scavenging activity of different enzymatic hydrolysates of Ziziphi Spinosae semen protein

2.7.4 羥基自由基清除能力 3種酸棗仁蛋白酶解物的羥基自由基清除能力如圖12所示，在0.5～2.5 mg/mL范圍內，羥基自由基的清除能力與不同酸棗仁蛋白酶解產物的質量濃度呈正比關系，即隨著質量濃度的增加，羥基自由基的清除能力越強。實驗結果表明，酸棗仁蛋白經不同蛋白酶處理后，不同酸棗仁蛋白酶解產物的羥基自由基清除活性明顯增強。3種蛋白酶解產物中，堿性蛋白酶解產物的羥基自由基清除能力最強，為47.77%；其次是木瓜蛋白酶解產物，為37.16%，中性蛋白酶解產物的羥基自由基清除能力最差，為35.04%。以上研究結果表明，不同酸棗仁蛋白酶解產物均具有一定的羥基自由基清除能力，其中堿性蛋白酶解產物效果最好。

圖12 不同酸棗仁蛋白酶解產物的對羥基自由基的清除能力Fig.12 ·OH scavenging ability of different enzymolysis hydrolysates of Ziziphi Spinosae semen protein

3 結論

本研究以酸棗仁蛋白為原料，采用不同蛋白酶對其進行酶解處理，得到三種不同蛋白酶解產物。并對不同酸棗仁蛋白酶解產物的功能特性及體外抗氧化活性進行比較研究。SDS-PAGE電泳結果表明，酶解處理后，其分子量分布有所變化，由高分子量分布向低分子量分布轉變，其中，堿性蛋白酶解產物的變化最為明顯。功能特性研究表明，相比于酸棗仁蛋白，持水性有所降低，不同蛋白酶解產物的溶解性、吸油性、起泡性、乳化性及乳化穩定性均具有不同程度地提高，功能特性在一定溫度和pH范圍內保持良好。體外抗氧化活性結果表明，與酸棗仁蛋白相比，不同酸棗仁蛋白酶解物的體外抗氧化活性均具有不同程度地提升，其中經堿性蛋白酶酶解的產物DPPH、ABTS、超氧陰離子自由基等清除能力均強于中性蛋白酶解產物及木瓜蛋白酶解產物，表明酶解大大提高了酸棗仁的體外抗氧化能力，以上研究表明所得的酸棗仁蛋白酶解產物具有較好的功能特性以及體外抗氧化活性，可作為一種潛在的抗氧化劑應用于食品及保健食品加工行業中，有助于發揮酸棗仁藥材自身最大的利用價值，為酸棗仁蛋白酶解產物的應用提供了一定的理論依據。