壯瑤藥生骨湯治療激素性股骨頭缺血性壞死的臨床療效評價及網絡藥理學機制初探

王偉偉　歐志學　章曉云　李時斌　周毅　李統

〔摘要〕 目的 運用Meta分析對壯瑤藥生骨湯治療激素性股骨頭缺血性壞死的臨床療效進行系統評價，并運用網絡藥理學對其作用機制進行初探。方法 檢索相關數據庫，時間從建庫至2021年1月，查找對象為生骨湯治療激素性股骨頭缺血性壞死的隨機對照試驗研究，采用RevMan 5.3軟件對納入文獻進行質量評價以及Meta分析。并運用網絡藥理學篩選生骨湯成分、靶點以及激素性股骨頭缺血性壞死靶點，進行映射，映射結果采用生物信息學進行注釋，并運用分子對接技術對其進行驗證。結果 （1）共納入5篇文獻，394例患者，結果提示生骨湯可顯著提高臨床總有效率和綜合療效評分，降低患者空骨陷窩概率。（2）網絡藥理學分析得到活性成分40個，共有靶點94個，關鍵成分為木犀草素、去甲漢黃芩素、牽?；ㄉ?、2’-羥基染料木素、染料木素，蛋白質相互作用網絡圖以及關鍵蛋白模塊圖提示壯瑤藥生骨湯主要通過誘導SRC、VEGFA、MMP9、PLG、MAPK14等核心靶點起到治療作用。（3）GO、KEGG富集分析結果顯示，生骨湯通過以上關鍵核心靶點影響PI3K/Akt、HIF-1、MAPK等主要信號通路，集中調控蛋白水解、信號傳導、膠原分解代謝等生物過程來發揮治療激素性股骨頭缺血性壞死作用。（4）分子對接結果顯示，關鍵活性成分與核心靶點結合能均小于參考值，具有較好結合活性。結論 壯瑤藥生骨湯能顯著提高激素性股骨頭缺血性壞死患者臨床總有效率和綜合療效評分，降低其空骨陷窩概率;其中木犀草素、去甲漢黃芩素、牽?；ㄉ?、2’-羥基染料木素、染料木素等為關鍵活性成分，通過調節新生血管生成、凝血系統以及骨細胞的增殖、凋亡、分化等達到治療效果。

〔關鍵詞〕 生骨湯;激素性股骨頭缺血性壞死;Meta分析;網絡藥理學;分子對接;壯瑤藥

〔中圖分類號〕R274? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.04.021

Evaluation of clinical efficacy and network pharmacology mechanism of Zhuangyao medicine Shenggu Decoction in the treatment of steroid-induced avascular necrosis of femoral head

WANG Weiwei OU Zhixue ZHANG Xiaoyun LI Shibin ZHOU Yi LI Tong

（1. Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning， Guangxi 530000， China;

2. Guilin Hospital of Traditional Chinese Medicine， Guilin， Guangxi 541002， China）

〔Abstract〕 Objective To systematically evaluate the clinical efficacy of Zhuangyao medicine Shenggu Decoction in the treatment of steroid-induced avascular necrosis of femoral head by Meta analysis， and to explore its mechanism of action by network pharmacology. Methods Relevant databases were searched from the establishment of the database to January 2021， to search for randomized controlled trials of Shenggu Decoction in the treatment of steroid-induced avascular necrosis of femoral head， and RevMan 5.3 software was used to evaluate the quality of the included literature as well as Meta analysis. Network pharmacology was used to screen the components， targets of Shenggu Decoction and targets of steroid-induced avascular

necrosis of femoral head， and mapped. The mapping results were annotated by bioinformatics， and verified by molecular

docking technology. Results （1） A total of 5 literatures and 394 patients were included. The results indicated that Shenggu Decoction could significantly improve the clinical total effective rate and comprehensive efficacy score， and reduce the probability of patients with empty bone lacuna. （2） Network pharmacology analysis obtained 40 active ingredients， there were 94 targets in total， and the key components were luteolin， norwogonin， morning glory， 2'-hydroxygenistein， and genistein. The protein-protein interaction network map and the key protein module map suggested Zhuangyao medicine Shenggu Decoction mainly plays a therapeutic role by inducing core targets such as SRC， VEGFA， MMP9， PLG， and MAPK14. （3） The results of GO and KEGG enrichment analysis showed that Shenggu Decoction affected major signaling pathways such as PI3K/Akt， HIF-1， and MAPK through the above key core targets， and centrally regulated biological processes such as proteolysis， signal transduction， and collagen catabolism to play a role in the treatment of steroid-induced avascular necrosis of femoral head. （4） Molecular docking results showed that the binding energies of key active ingredients and core targets were all lower than the reference value， indicating good binding activity. Conclusion Zhuangyao medicine Shenggu Decoction can significantly improve the clinical total effective rate and comprehensive efficacy score in patients with steroid-induced avascular necrosis of femoral head， and reduce the probability of empty bone lacuna; luteolin， norwogonin， morning glory， 2'-hydroxygenistein， and genistein are key active ingredients， which achieve therapeutic effects by regulating angiogenesis， coagulation system， and proliferation， apoptosis， and differentiation of bone cells.

〔Keywords〕 Shenggu Decoction; steroid-induced avascular necrosis of femoral head; Meta analysis; network pharmacology; molecular docking; Zhuangyao medicine

股骨頭壞死是一種臨床上常見的骨科疑難雜病，臨床上按照病因將其分為創傷性與非創傷性兩類，非創傷性多由激素過量使用以及飲酒過度所致[1]。相關研究表明[2]，廣西地區使用激素治療自身免疫性疾病從而導致激素性股骨頭缺血性壞死（steroid-induced avascular necrosis of femoral head， SANFH）的患者約占70.08%。其發病率、致殘率常年居高不下，醫療資源被大量浪費，已嚴重拖累社會經濟的發展[3]。而目前多采用手術治療，但手術治療存在費用高、患者依從性差等問題。因此，研究者逐漸將目光轉移至中醫藥領域。

中醫藥因其不良反應少，臨床療效佳等優勢，受到越來越多研究者的青睞。而壯瑤醫作為我國傳統醫藥的一個重要組成部分，其用藥大多采用本地藥材，且在臨床方面療效顯著，能降低醫療費用和提高人民生活質量。生骨湯是壯瑤醫治療SANFH的經典方，具有補益肝腎、益髓生骨等作用[4]。其中主藥扶芳藤和松蘭補肝腎之虧虛，丟了棒和水田七消腫止痛、活血化瘀;大葉千斤拔、紅杜仲和雞血藤為佐，行補虛健骨之療效;四方藤調和藥性、舒經活絡。該方雖然被廣泛應用于SANFH治療，但其具體作用機制尚未明確，缺乏充分的循證依據?；谝陨犀F狀，本研究采用Meta分析聯合網絡藥理學的方式，在綜合評價壯瑤藥生骨湯治療SANFH療效的同時，對其潛在的作用機制進行初步探索，為其臨床提供更為可靠的循證依據，也為其后期的實驗研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1? Meta分析

1.1.1? 文獻納入標準? 文獻為國內外公開發表的隨機對照試驗;研究對象為SANFH患者;觀察組為生骨湯或常規治療+生骨湯，對照組為常規治療;有明顯的結局指標，且數據完整。

1.1.2? 文獻排除標準? 文獻重復發表;關鍵信息無法獲得的文獻;設計不嚴謹，文獻不完整;納入患者合并其他嚴重疾病，如惡性腫瘤、心血管疾病等;療效評定標準不規范，治療結果未完整公布。

1.1.3? 相關指標? 臨床總有效率、綜合療效評分、空骨陷窩率。

1.1.4? 文獻檢索策略? 相關數據庫：中國知網、維普、萬方、中國生物醫學文獻數據庫、PubMed、Cochrane

Library、Embase、MEDLINE以及Web of Science。檢索方式：根據各數據庫檢索情況，通過主題詞聯合自由詞的方式進行檢索。中文檢索關鍵詞為“生骨湯”“壯藥”“瑤藥”“激素性股骨頭缺血性壞死”，英文檢索關鍵詞為“Shenggu Decoction”“Zhuang Medicine”“Yao Medicine”“steroid-induced avascular necrosis of femoral head”。

1.1.5? 數據提取和文獻質量評價? 提取文獻相關信息為題目、作者、單位、年份、干預措施、治療療程和觀察指標等。采用RevMan 5.3軟件對納入文獻進行質量評價，內容包括隨機序列產生、分配隱藏、對研究者或患者施加盲法、不完全結局數據、其他偏倚。評價結果分為“低風險”“不清楚風險”“高風險”。以上內容由兩名專業人員獨立匯總完成，當出現不同意見時再增加一名專業人員同組討論后決定。

1.1.6? 數據統計與分析? 利用RevMan 5.3軟件對納入研究進行Meta分析，不能進行Meta分析的則進行描述性定性分析。二分類變量資料以95%可信區間（confidence interval， CI）比值比（odds ratio， OR）表示，連續性變量資料以95%CI標準化均值差（STD mean difference， SMD）表示。顯示異質時，即P<0.1、I2≥50%，采用隨機效應模型;顯示同質時，即P>0.1，I2<50%，采用固定效應模型。

1.2? 網絡藥理學

1.2.1? 生骨湯活性成分及靶點獲取? 利用TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm）、DrugBank（https：//go.

drugbank.com/）和中藥與化學成分數據庫（http：//www.chemcpd.csdb.cn/cmpref/main/tcm_introduce.asp）以及查閱文獻等方法收集生骨湯活性成分和相關靶點信息。TCMSP數據庫根據口服生物利用度（oral

bioavailability， OB）≥30%以及類藥性（drug-likeness， DL）≥0.18進行篩選，其他數據庫和查閱文獻獲取到的活性成分則以Lipinski類藥五原則[5-6]，即分子量（MW<500），氫鍵供體數（Hdon<5），氫鍵受體數（Hacc<10），脂水分配系數（AlogP<5）和旋轉鍵（RBN<10）對其進行篩選。通過PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索獲得的生骨湯活性成分的結構式，未能搜索到的則收集其2D結構圖，最后利用Swiss TargetPrediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）進行靶點預測。

1.2.2? SANFH靶點篩選預測? 以“steroid-induced avascular necrosis of femoral head”為關鍵詞，利用GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）對其相關靶點進行篩選。

1.2.3? 共同靶點篩選? 將兩者靶點經Venn Diagram網站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）取交集，獲取兩者共同靶點并繪制韋恩圖。

1.2.4? 網絡構建與分析? 運用Cytoscape 3.7.2構建“中藥-活性成分-共有靶點”網絡圖;將共同靶點導入String數據庫（http：//string-db.org/cgi/input.pl），置信度得分設置為>0.9，隱藏游離蛋白進行參數分析，結果導出后再導入Cytoscape 3.7.2中構建蛋白質相互作用（protein-protein interaction， PPI）網絡圖，運用MCODE插件篩選關鍵蛋白模塊，參數設置：度值=2，節點得分=0.2，最大深度=100。

1.2.5? GO、KEGG富集分析? 運用DAVID數據庫（http：//david.ncifcrf.gov）對導出數據進行GO、KEGG富集分析，GO富集分析包括生物過程、分子功能和細胞組分;KEGG富集分析則直觀檢測共有靶點涉及的通路分布情況;最后通過微生信網站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）將GO、KEGG富集結果可視化。

1.2.6? 分子對接? 根據“1.2.4”分析結果，取關鍵活性成分與核心蛋白運用AutoDock vina 1.1.2軟件進行分子對接。首先，在PDB數據庫（http：//www.rcsb.org/）搜索關鍵蛋白3D結構，使用PyMOL 1.7.2.1軟件移除關鍵蛋白中非蛋白分子和配體;通過PubChem數據庫下載活性成分結構并進行優化。使用AutoDock vina 1.1.2軟件進行定位、殘基修補、水分子去除、添加氫原子和電荷并保存。以原配體所在位點作為關鍵蛋白活性口袋進行分子對接，最后通過PyMOL 1.7.2.1軟件對結果進行可視化。

2 結果

2.1? Meta分析結果

2.1.1? 文獻檢索結果? 初步檢索得到中文文獻3584篇和英文文獻865篇，通過閱讀題目和查重后，剔除4434篇，剩中文文獻15篇和英文文獻0篇，根據納入標準與排除標準進行閱讀評估和剔除后，最終納入文獻5篇[7-11]。

2.1.2? 納入文獻基本特征? 納入5篇文獻均為中文文獻，共計5項研究和394例樣本，其中試驗組199例和對照組195例，試驗組干預措施均為生骨湯，對照組干預措施均為常規治療藥物。見表1。

2.1.3? 納入文獻偏倚分析評估? 本次研究納入文獻均提及“隨機”字樣，其中2篇文獻[7，11]采用隨機數字表法，評定為低風險，剩余3篇文獻[8-10]只描述為隨機，未明確隨機序列產生方法，故評定為不清楚風險;本次研究納入文獻均未提及分配隱藏及盲法，故評定為不清楚風險;所有納入文獻均有明確結局指標，故評定為低風險;所有納入文獻均未發現重復發表或發表偏倚，評定為低風險;其他偏倚均未知，故評定為不清楚風險。見圖1。

2.1.4? 療效評價分析? （1）臨床總有效率：納入的5篇文獻[7-11]均提及臨床總有效率，結果提示各研究間具有同質性（P=0.79，I2=0%），選擇固定效應模型，OR=4.38（95%CI 2.15～8.89，P<0.000 01），提示生骨湯優于仙靈骨葆膠囊，兩者差異具有統計學意義。見圖2a。

（2）綜合療效評分：納入的5篇文獻中4篇[7-8，10-11]提及綜合療效評分，結果提示各研究間具有同質性（P=0.57，I=0%），選擇固定效應模型，SMD=3.89（95%CI 3.48～4.30，P<0.000 01），提示生骨湯優于仙靈骨葆膠囊，兩者差異具有統計學意義。見圖2b。

（3）空骨陷窩率：納入的5篇文獻中2篇[7，9]提及空骨陷窩率，結果提示各研究間具有同質性（P=0.90，I=0%），選擇固定效應模型，OR=0.16（95%CI 0.05～0.58，P=0.005），提示生骨湯優于仙靈骨葆膠囊，兩者差異具有統計學意義。見圖2c。

2.1.5? 發表偏倚? 繪制漏斗圖對生骨湯和仙靈骨葆膠囊在提高總有效率方面進行偏倚分析，如圖所示，漏斗圖各散點呈不完全對稱，說明存在發表偏倚的可能性。見圖3。

2.2? 網絡藥理學結果

2.2.1? 藥物成分及相關靶點篩選? 通過數據庫和查閱文獻，共得到生骨湯活性成分40個，活性成分靶點630個。

2.2.2? 疾病靶點篩選? 結果匯總后共得到SANFH相關靶點505個。

2.2.3? 潛在靶點預測結果? 經Venn Diagram網站得到共同靶點94個。見圖4a。

2.2.4? 網絡構建與結果分析? “中藥-活性成分-共同靶點”網絡圖見圖4b，通過Network Analyzer工具分析網絡中節點的度值。度值排前5位的靶點為雞肉瘤病毒基因（sarcoma gene， SRC）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A， VEGFA）、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9， MMP9）、纖溶酶原（plasminogen， PLG）、絲裂原激活蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14， MAPK14）;排前5位的成分為木犀草素（luteolin）、去甲漢黃芩素（norwogonin）、牽?；ㄉ兀╬etunidin）、2’-羥基染料木素（2'-hydroxygenistein）、染料木素（genistein），具體活性成分信息見表2。將共同靶點導入String數據庫進行參數分析后，剩余83個核心蛋白，導出結果后接著導入Cytoscape 3.7.2中構建PPI圖，見圖4c，并通過Network Analyzer工具和MCODE插件篩選關鍵蛋白模塊，得到2個關鍵蛋白模塊，模塊1評分為7.714，模塊2評分為4.333，具體情況見圖4d。

2.2.5? GO、KEGG富集分析? 將83個核心靶點上傳至DAVID數據庫，進行GO、KEGG富集分析。GO富集分析共得到431個條目，其中細胞組分34個，生物過程307個，分子功能90個，顯示生骨湯治療SANFH主要與蛋白水解、信號傳導、膠原分解代謝過程等生物過程及蛋白質結合、ATP結合、鋅離子結合等分子功能密切相關，其過程涉及質膜、細胞外區域、細胞外泌體等細胞組分，見圖5。KEGG富集分析共得到73條通路，具體分布見圖6，排除與SANFH聯系不夠密切的通路，篩選出磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B， PI3K/Akt）、低氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1， HIF-1）、絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）等相關主要信號通路。

2.2.6? 分子對接結果? 根據“2.2.4”分析結果，分別取度值前5位的活性成分以及核心蛋白進行分子對接，并取結合能最低者進行可視化，見表3、圖7，結果顯示，關鍵活性成分與核心蛋白的結合能均≤-5.0 kJ/mol[12]，且多數嵌入核心靶點活性口袋的疏水區，結合模式多以π-π作用和氫鍵為主，提示具有較好結合活性，其中染料木素能與MMP9上的LEU-188、LEU-222、LEU-243、ALA-189、VAL-223以及MIS-226殘基結合。

3 討論

近年來，隨著糖皮質激素的廣泛應用，SANFH的發病率也在逐年升高，其占比率在非創傷性股骨頭壞死中高達51%[13-14]，已成為臨床上較為棘手的骨科疾病。SANFH的發病機制較為復雜，其中股骨頭血液循環中斷是目前最普遍認可的發病機制。目前，西藥多采用增加纖溶、擴張血管、抗凝與降脂藥物聯合使用，或將增加成骨與抑制破骨藥物聯合使用[15]。西藥治療通常只涉及一種或幾種作用機制，治療效果不穩定。中醫治療則以整體觀為指導，強調早期診斷、早期治療以及病證結合，以求髖關節局部和整體穩定[16]。在患者不同時期均需采用一定的補腎健骨中藥治療[17-19]，而生骨湯是壯瑤醫治療SANFH的經驗方，具有補益肝腎、益髓生骨、舒筋活絡、活血化瘀的作用，且療效顯著[7-11]。而本次Meta分析結果顯示，與常規用藥仙靈骨葆膠囊相比，生骨湯的療效更好，可顯著提高總有效率、綜合療效評分，并降低患者的空骨陷窩率。

基于Meta分析結果，本次研究進一步通過網絡藥理學對生骨湯治療SANFH的潛在作用機制進行初步探索，發現木犀草素、去甲漢黃芩素、牽?；ㄉ?、2’-羥基染料木素、染料木素為關鍵成分。木犀草素是一種黃酮類化合物，具有抗炎以及調節免疫的作用[20]。相關研究顯示[21]，木犀草素能通過STAT1/Caspase-3信號通路抑制去脫氧誘導的成骨凋亡激活。染料木素主要來源于廣豆根和金雀花等一些豆科植物，具有提取率高、成本低等特點[22]。而相關實驗顯示[23]，染料木素可通過旁分泌刺激成骨細胞增殖、分化，進而增強骨保護素蛋白質分泌以及mRNA表達。

此外，本次研究還發現生骨湯治療SANFH的核心靶點為SRC、VEGFA、MMP9、PLG、MAPK14。PLG是纖溶系統的重要組成之一，激活后具有溶解血栓并抑制凝血的作用?；|金屬蛋白酶（matrix

metalloproteinase， MMPs）是參與降解全身各種組織細胞外基質的蛋白酶家族，其中MMP2、MMP9在破骨細胞中大量表達，降解骨基質相關有機物[24]。VEGFA是VEGF家族中常見的一位成員，具有促進新生血管生成的作用[25]。VEGF與其激酶結構域受體（Flt-1、Flt-4、KDR）特異性結合后，增加相關靜脈通透性來促進營養物質以及炎性物質滲出。而SRC是Src激酶家族的成員之一，近期有相關研究表明[26]，LPS通過TLR4通路觸發信號分子Src/Syk磷酸化，激活NF-κB和AP-1信號通路，從而影響炎性因子表達。血管發生炎癥反應會導致組織腫脹引起骨內壓升高，而骨內壓升高是SANFH的一個重要病因。綜上所述，生骨湯治療SANFH主要是通過調節新生血管生成、凝血系統以及骨吸收等相關途徑。

另外，本次研究發現，PI3K/Akt、HIF-1、MAPK等相關通路與生骨湯治療SANFH密切相關。PI3K/Akt通路主要參與細胞增殖、凋亡和分化[27]。Zou等[28]研究發現缺氧條件下，小鼠成骨細胞中PI3K-Akt信號通路受到抑制，最終導致成骨細胞凋亡。Liu等[29]研究發現，人多能干細胞分泌物可通過激活PI3K/Akt通路增強股骨頭內血管內皮細胞的成血管能力，維持股骨頭血供。HIF-1α信號通路在缺血/低氧環境下，對血管生成和骨形成起著十分重要的調節作用。相關研究表明低氧情況下，穩定表達的HIF-1α蛋白能增高VEGF的表達來促進血管生成[30]。Zhang等[31]研究也證實在低氧環境下，軟骨細胞HIF-1α、VEGF表達均升高，誘導血管生成來為骨生成帶來氧分和營養物質。MAPK通路在細胞生長及細胞信息交流過程中起到十分重要的作用，其中p38-MAPK、ERK信號通路調控細胞凋亡，從而影響SANFH。p38通過磷酸化p53，影響活性氧簇在線粒體中的產生，將氧化應激信號轉化為凋亡信號以促進成骨細胞凋亡[32]。而ERK通路，則具有調節成骨細胞分化增殖的作用，該通路被激活后，RUNX2、Ⅰ型膠原以及堿性磷酸酶表達水平會增高，從而促進成骨細胞增殖[33]。

本次研究不足之處：（1）納入文獻只有5篇，且質量有所欠缺;（2）納入文獻均為國內研究;（3）網絡藥理學研究未將分析結果與成分含量相聯系，后續研究應將兩者關系考慮在內進行分析;（4）此次研究搜索到松蘭、丟了棒的相關活性成分均未滿足篩選條件，望后續能完善相關成分研究。

本次研究運用Meta分析和網絡藥理學進行綜合分析，結果表明，生骨湯可顯著提高SANFH患者臨床總有效率、綜合療效評分，并降低其空骨陷窩率;而生骨湯主要是通過誘導調控相關靶點和信號通路，調節新生血管生成、凝血系統以及骨細胞的增殖、凋亡、分化來發揮治療作用。本研究一定程度上為壯瑤藥生骨湯治療SANFH提供了較為科學的循證依據，并分析了其內在機制，這為傳統醫學與現代醫學研究相結合提供了理論依據，也為今后臨床相關問題的研究提供了系統的研究思維與模式。

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